מאמר שיטה

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

DOI:

10.3791/65572

⸱

20 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס רקומביננטי הקשור באדנו (rAAV) נמצא בשימוש נרחב להעברת גנים קליניים ופרה-קליניים. שימוש לא מוערך מספיק עבור rAAVs הוא התמרה חזקה של תאים בתרבית ללא צורך בטיהור. עבור חוקרים חדשים ב-rAAV, אנו מספקים פרוטוקול לשיבוט קלטות טרנסגניות, ייצור וקטורים גולמיים והתמרה של תרביות תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) יכולים להשיג ביטוי טרנסגנים חזק ועמיד ללא אינטגרציה במגוון רחב של סוגי רקמות, מה שהופך אותם לבחירה פופולרית להעברת גנים במודלים של בעלי חיים ובמסגרות קליניות. בנוסף ליישומים טיפוליים, rAAVs הם כלי מעבדה שימושי להעברת טרנסגנים המותאמים לצרכי הניסוי של החוקר ולמטרות המדעיות שלו בתאים בתרבית. כמה דוגמאות כוללות גנים אקסוגניים של כתבים, קלטות ביטוי יתר, הפרעות RNA וכלים מבוססי קריספר, כולל אלה עבור מסכים ברחבי הגנום. התמרה rAAV פחות מזיקה לתאים מאשר אלקטרופורציה או הדבקה כימית ואינה דורשת ציוד מיוחד או ריאגנטים יקרים כדי לייצר. ניתן להוסיף ליזטים גולמיים או מדיה מותנית המכילה rAAV ישירות לתאים בתרבית ללא טיהור נוסף כדי להתמיר סוגי תאים רבים – תכונה שאינה מוערכת מספיק של rAAVs. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לשיבוט קלטות טרנסגנים בסיסיות ומדגימים כיצד לייצר וליישם תכשירי rAAV גולמיים על תאים בתרבית. כהוכחה עקרונית, אנו מדגימים התמרה של שלושה סוגי תאים שעדיין לא דווחו ביישומי rAAV: תאי שליה, מיובלסטים ואורגנואידים של המעי הדק. אנו דנים בשימושים מתאימים לתכשירי rAAV גולמיים, במגבלות של rAAV להעברת גנים, ובשיקולים לבחירת קפסיד. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, זולה ויעילה עבור חוקרים להשגת העברת DNA פרודוקטיבית בתרבית תאים באמצעות rAAV ללא צורך בשלבי טיטרציה וטיהור מייגעים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בירור הבסיסים המולקולריים של תפקודים תאיים דורש לעתים קרובות ביטוי של דנ"א מהונדס בתרבית תאים. כדי לבוא לידי ביטוי, טרנסגנים חייבים לחדור דרך הממברנה הסלקטיבית של התא ולהגיע לגרעין 1,2. לכן, היכולת לעקוף ביעילות את המחסומים הפיזיים של התא ולתפעל את התהליכים המרכזיים שלו היא הכרחית ליישום טרנסגנזה כדי לחשוף תופעות ביולוגיות חדשות. גישה אחת מנצלת את היכולת הפנימית של נגיפים להעביר ולבטא דנ"א זר 3,4.

נגיף הקשור לאדנו (AAV) הוא אחד מנגיפי היונקים הקטנים ביותר: גנום הדנ"א החד-גדילי שלו, 4.7 קילו-בסיס (kb), מכיל שני גנים, rep (עבור רפליאז) ו-cap (עבור קפסיד), ארוזים בתוך קפסיד איקוסהדרלי של 60 מר בגודל 25 ננומטר. לגנים rep/cap יש מספר רב של מקדמים, מסגרות קריאה ומוצרי splice המקודדים לפחות תשעה חלבונים ייחודיים הדרושים לשכפול נגיפי, ייצור ואריזה 5,6. בנוסף, שני קצוות הגנום מכילים מבנים משניים הנקראים חזרות מסוף הפוכות (ITR) הנחוצים לשכפול DNA, אריזת גנום ועיבוד במורד הזרם במהלך התמרה 7,8,9,10. ה- ITR הם רכיבי ה- DNA היחידים הנדרשים לאריזת הגנום לתוך הקפסיד, ולכן ניתן לשכפל AAV למטרות העברת טרנסגנים על ידי החלפת הגנים החוזרים / כובע הנגיפים בבחירת החוקר של אלמנטים רגולטוריים ו / או גנים בעלי עניין6. ה-AAV הרקומביננטי (rAAV) המתקבל, עם גנום וקטורי מהונדס (VG), נמצא בשימוש נרחב במרפאה לטיפול גנטי אנושי וצבר הצלחות11. שימוש לא מוערך מספיק בווקטור נמצא במעבדה; rAAVs יכולים להשיג ביעילות ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית כדי למלא את צרכי הניסוי של החוקר12.

השיטה הנפוצה ביותר לייצור rAAV היא באמצעות טרנספקציה של פלסמיד משולש לתאי HEK293 או 293T (איור 1). הפלסמיד הראשון, המכונה בדרך כלל פלסמיד סיס, מכיל את הטרנסגן הרצוי משני צדדיו ITR (pAAV). בהתאם ליישום, פלסמידים סיס עם אלמנטים נפוצים, כגון מקדמים חזקים או כלים מבוססי קריספר, זמינים לרכישה. השני הוא פלסמיד pRep/Cap המכיל את הגנים מסוג פרא AAV rep ו-cap המסופקים בטרנס - כלומר, על פלסמיד נפרד, שאינו מכיל ITR המבטא אלמנטים רגולטוריים ומבניים המקיימים אינטראקציה עם פלסמיד סיס - ולכן נקרא פלסמיד טרנס. בנוסף לסגירה פיזית של VG, הקפסיד משפיע על טרופיזם תאי12,13. על ידי אספקת גן הכובע הספציפי לסרוטיפ בטרנס, החוקרים יכולים בקלות למקסם את יעילות ההולכה על ידי בחירת סרוטיפ קפסיד אופטימלי עבור תא היעד הנתון שלהם. לבסוף, כ-Dependoparvovirus, AAV דורש וירוס עוזר כדי להפעיל ביטוי rep/cap מהמקדמים הנגיפיים שלו, המושג על ידי גנים מסייעים אדנו-ויראליים, המסופקים על פלסמיד שלישי כגון pAdΔF614,15. לאחר 72 שעות של טרנספקציית פלסמיד משולש, הווקטור יכול להשתחרר מתאי היצרן למדיה התרבית על ידי מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים. לאחר מכן נאספים כל תכולת הצלחת, ופסולת תאית גדולה מוסרת באמצעות צנטריפוגה; הסופרנאטנט התקשורתי המתקבל הוא הכנת rAAV גסה המוכנה לתמריצים במורד הזרם.

העברת תאים HEK 293 (T), קציר וקטור, דיאגרמת תהליך התמרה, ניתוח ביטוי גנים.
איור 1: סקירה כללית של ייצור וקטורי rAAV גולמי. ייצור rAAV גולמי וטרנסדוקציה ניתן לבצע בתוך 5 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

rAAV עשוי להיות נוח יותר עבור העברת טרנסגנים בהשוואה לשיטות טרנספקציה אחרות, אשר קשורות בדרך כלל עם רעילות תאית, יעילות נמוכה, ריאגנטים יקרים וציוד, כגון עבור electroporation או transfection כימי / שומנים מבוססי16,17. rAAV עוקף מכשולים אלה ולעתים קרובות מספק ביטוי טרנסגנים חזק עם רעילות מינימלית, וזמן מעשי מינימלי. חשוב לציין, ייצור rAAV ויישומו בתרבית תאים הוא פשוט, ורק לעתים רחוקות דורש טיהור של הווקטור ממדיית התרבית (איור 1). בנוסף, rAAV אינו משלב את ה-VG שלו בגנום המארח, בניגוד להעברת טרנסגנים לנטיויראליים, ובכך מפחית את הסיכון למוטגנזה החדרתית18. למרות היתרונות הפוטנציאליים של שימוש ב- rAAV להעברת טרנסגנים, יש לקחת בחשבון מגבלות. חשוב לציין, גודל הטרנסגן, כולל ITRs, לא יעלה על 4.9 KB בשל אילוצים פיזיים של הקפסיד, ובכך להגביל את יכולתו של החוקר לספק ביעילות אלמנטים רגולטוריים גדולים וטרנסגנים. יתר על כן, מכיוון ש-rAAV הוא וירוס שאינו משתלב, התמרה גורמת לביטוי טרנסגנים חולפים בתאים מתחלקים ועשויה שלא להיות מעשית לביטוי יציב. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות המשתמשות בתבניות Cas9 כפולות של rAAV ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR) כדי להכניס רצפים במיקומים גנומיים ספציפיים אם חוקר מעוניין בכך19.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. רכישת פלסמיד

הערה: פרוטוקול זה ישבט גן מעניין (GOI) לפלסמיד המכיל ITR עם מקדם ציטומגלווירוס (CMV) ורצף פולי-אדנילציה SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). עם זאת, פלסמיד זה יכול לשמש ללא שיבוט נוסף כדי לייצר rAAVs, אריזה נוח כפול EGFP ו Luciferase כתב. פלסמידים עם אלמנטים רגולטוריים שונים או עבור יישומים שונים, כגון עבור ניסויים מבוססי קריספר, זמינים באינטרנט ויבצעו שלבי שיבוט דומים לאלה שלהלן (ראה דיון לשלבי שיבוט נוספים). בנוסף, ניתן להשתמש בפלסמידים מסוג rep/cap, או trans, עבור סרוטיפים שונים - פרוטוקול זה ישתמש ב-rep/cap עבור סרוטיפ AAV 2.

  1. רכשו דקירות חיידקיות המכילות פלסמיד סיס המכיל ITR, פלסמיד עוזר אדנווירוס, פלסמיד חזרה/כובע ופלסמיד המכיל GOI. פזרו את החיידקים על צלחות אגר בודדות המכילות אנטיביוטיקה ספציפית לעמידות של כל פלסמיד. לדגור על החיידקים ב 30 מעלות צלזיוס במשך הלילה כדי לגדול.
    הערה: אם פלסמיד עם GOI אינו זמין לרכישה, ניתן לרכוש מקטע DNA סינתטי (ראה טבלת חומרים) באינטרנט. בנוסף, ניתן להשתמש במקטע DNA סינתטי כדי לדלג על כל תהליך ה-PCR במידת הצורך.
  2. בחרו מושבה אחת מכל צלחת וגדלו ב-3 מ"ל של חיץ לוריא ברטאני (LB) בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כשהוא רועד ב-180 סל"ד. להעביר 1 מ"ל של החיידקים לתוך בקבוק Erlenmeyer סטרילי 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל של חיץ LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה. יש לנער ב-30°C, 180 סל"ד למשך הלילה.
  3. מעבירים את החיידקים לצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם, טמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט. בודד את הפלסמיד באמצעות ערכת midiprep נמוכה או נטולת אנדוטוקסין בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: ITR הם מבנים לא יציבים. כדי למנוע מחיקות ITR או מוטציות, יש לגדל תאי חיידקים בטמפרטורה של 30°C כדי להאט את חלוקת התאים ולצמצם שגיאות בשכפול. כדי להגדיל את תפוקת פלסמיד וטוהר, ערכת midiprep או maxiprep היא אידיאלית. מומלץ להשתמש בערכה דלת או נטולת אנדוטוקסין כדי להפחית את זיהום האנדוטוקסין בתאים במורד הזרם. אין צורך לבצע בידוד פלסמיד בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, שכן זיהום של הכנת פלסמיד אינו סביר אם מבוצע על ספסל סטנדרטי.

2. שיבוט גן מעניין לפלסמיד המכיל AAV ITR

  1. פתח את מפת הפלסמיד המכילה את GOI בתוכנת צפייה ב- DNA.
    הערה: הקלטת המלאה, כולל ה-ITR, לא תעלה על 4.9 KB עקב מגבלות אריזה פיזית של הקפסיד. בנוסף, לא ניתן להשיג הגברה PCR באמצעות ITR עקב מבנים משניים. ככזה, הרכבת גיבסון אינה מומלצת לשיבוט טרנסגנים rAAV.
    1. לחץ על הכרטיסייה רצף כדי לחשוף את הרצף המלא של הפלסמיד. גלול לאזור 5' ביותר של רצף GOI ולחץ על הנוקלאוטיד הראשון תוך גרירה פנימה לכיוון גוף הגן כדי ליצור פריימר קדימה. שחרר ברגע שטמפרטורת התכה (Tm) של ~ 55 ° C הגיעה.
    2. לחץ על Forward Primer. כלול ידנית את הרצף עבור אתר הגבלת EcoRI (5' GAATTC 3') בקצה 5' ביותר של רצף הפריימר. בנוסף, הוסף שישה בסיסים אקראיים נוספים בקצה 5' של אתר הגבלה זה כדי לאפשר לאנזים לתקשר ביעילות עם הדנ"א. לחץ על הוסף פריימר. עיינו באיור 2 כדוגמה מייצגת.
    3. בדוק את הפריימר כדי לוודא שהוא לא יכול ליצור סיכות שיער או דימרים פריימר (למעט אתר הגבלה שהוא פלינדרומי). אם נוצרות סיכות ראש, שנה את הרצף האקראי של ששת הבסיסים הנוספים. בנוסף, ודא שהפריימר אינו נקשר בשום מקום אחר על הפלסמיד.
    4. חזור על השלבים כדי ליצור פריימר הפוך באזור 3' ביותר של GOI פנימה לגוף הגן. לחץ על פריימר הפוך וכלול אתר הגבלת NotI (5' GCGGCCGC 3').
      הערה: ממשלת ישראל אינה יכולה להכיל אתרי הגבלה EcoRI או NotI – אם כן, יהיה צורך להשתמש באנזימי הגבלה שונים.
  2. להגביר את GOI בתגובת PCR של 50 μL. השתמש ברכיבים הבודדים הנדרשים מטבלה 1.
    1. מקם את התגובה ב- thermocycler ופעל לפי פרמטרי המחזור מטבלה 2 לתכנות. אם לפריימרים יש T m שונה, השתמש ב- Tm התחתון עבור התוכנית.
    2. ודא הגברה של מקטע PCR נכון על ידי הוספת 1 μL של צבע טעינת ג'ל (6x) ל 5 μL של תגובת PCR. הפעל סולם DNA ואת תערובת PCR על ג'ל אגרוז 0.8% המכיל אתידיום ברומיד ולדמיין עם אור UV.
      זהירות: אתידיום ברומיד הוא מוטגן ידוע.
    3. אם מופיעה רצועה אחת ספציפית על הג'ל, יש לטהר את מוצר ה-PCR שנותר בצינור רצועת ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR מבוססת עמודה בהתאם להוראות היצרן. אם מופיעות רצועות מרובות (עקב הגברה לא ספציפית), הוציאו את הרצועה הרצויה וטיהרו את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם להוראות היצרן.
  3. עיכול מוצר PCR מטוהר ופלסמיד עמוד השדרה pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 בתגובה של 50 μL עם הרכיבים הבודדים הנדרשים מטבלה 3 למשך שעה אחת ב-37°C. נדרשת כמות גדולה יותר של DNA פלסמיד pAAV עקב התאוששות לא יעילה צפויה לאחר מיצוי ג'ל.
    הערה: אנזימי ההגבלה שבהם נעשה שימוש הם גרסאות באיכות גבוהה (HF). לא ניתן להשתמש ב- NotI רגיל עם מאגר CutSmart. אם נעשה שימוש באנזימים שונים, ייתכן שיהיה צורך בטמפרטורת דגירה ובחיץ שונים.
    1. יש לטהר את מוצר ה-PCR המעוכל באמצעות ערכת ניקוי PCR מבוססת עמודות בהתאם להוראות היצרן.
    2. הכינו את פלסמיד עמוד השדרה pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 המעוכל עבור אלקטרופורזה בג'ל על ידי הוספת 10 μL של צבע העמסת ג'ל (6x) עד 50 μL של תגובת עיכול. יש להעמיס סולם DNA, תגובת עיכול ו-250 ננוגרם של פלסמיד לא מעוכל (בקרה שלילית) על ג'ל אגרוז 0.8% המכיל אתידיום ברומיד עם בארות רחבות שיניים. דמיינו עם אור UV, הוציאו את המקטע הרצוי (~ 4.5 קילובייט), וטהרו את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם להוראות היצרן.
  4. קשרו את מוצר ה-PCR המעוכל ואת פלסמיד עמוד השדרה pAAV המעוכל בתגובת קשירה של 20 מיקרוליטר עם הרכיבים הבודדים הנדרשים מטבלה 4. כדי לחשב את כמות מוצרי ה- PCR הדרושים, השתמש בפורמולה 1. בדרך כלל, השתמש ביחס מולארי של 3:1 בין מוצר PCR (אינספציה) לעמוד השדרה (pAAV), עם מסה של 50 ng עמוד השדרה.
    הוסף נוסחת מסה, \( \text{הכנס מסה (ng)} = \frac{\text{מסת עמוד שדרה (ng) × הכנס אורך (kb) × יחס}}{\text{אורך עמוד השדרה (kb)}} \), משוואה לחישובי שיבוט מולקולרי.פורמולה 1
  5. בצע בקרה שלילית על ידי החלפת מוצר ה- PCR במים. יש לדגור על תגובות קשירה ב-16°C למשך הלילה, או בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  6. הפשירו בקבוקון של תאי חיידקים מוכשרים וחסרי רקומבינציה (כגון תאי Stbl3) על קרח והכניסו 50 μL לתוך צינור של 1.5 מ"ל. מוסיפים 3 μL של תגובת הקשירה ישירות על התאים ודגורים על קרח למשך 30 דקות.
    הערה: ITR הם מבנים לא יציבים ולכן דורשים זני חיידקים חסרי רקומבינציה כדי להגביל אירועי מחיקה ורקומבינציה של ITR. ניתן להשתמש בתאי DH5α לסירוגין לצורך התפשטות (פעם או פעמיים) אך אינם מומלצים לשימוש ארוך טווח. יש לבדוק את שלמות ITR באופן קבוע לאחר טיהור midiprep.
    1. הלם חום את החיידקים באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ואז מיד להעביר לקרח למשך 2 דקות. יש להוסיף 200 μL של חיץ LB ולנער במשך שעה אחת ב-30°C, 180 סל"ד.
    2. מורחים 125 μL מהתערובת על צלחת אגר עם האנטיביוטיקה המתאימה ודגרים למשך הלילה (~ 18 שעות) ב 30 מעלות צלזיוס. בחר שיבוטים מרובים והכנס כל אחד מהם לתוך צינור תרבית פלסטיק סטרילי עם 3 מ"ל של LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. יש לדגור על רעידות לילה ב-30°C, 180 סל"ד.
      הערה: כדי למנוע מחיקות ITR או מוטציות, יש לגדל תאי חיידקים בטמפרטורה של 30°C כדי להאט את חלוקת התאים ולצמצם שגיאות בשכפול. בנוסף, מושבות קטנות יותר יש לבחור כמו אלה ללא ITR עשוי להיות יתרון צמיחה על פני אחרים.
    3. פיפטה 1.8 מ"ל מכל תרבית לתוך צינור 2 מ"ל וצנטריפוגה ב 6,000 x גרם במשך 3 דקות, טמפרטורת החדר. בודדו את הדנ"א באמצעות ערכת מיני-הכנה. אחסן את 1.2 מ"ל הנותרים של תרבית ב 4 °C. ודא שיבוטים נכונים על ידי ריצוף DNA או אבחון הגבלת אנזים digest.
      הערה: מומלץ לבצע ריצוף Sanger של העלון, אך תהליכיות באמצעות ITR אינה ניתנת להשגה בשיטות סטנדרטיות. ITR צריך להיות מאומת על ידי תקציר הגבלה כמתואר להלן.
    4. הוסף 50 מ"ל של חיץ LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה לצלוחית Erlenmeyer סטרילית של 250 מ"ל. הוסף 500 μL של התרבית הנותרת לבקבוק ולנער ב 30 ° C, 180 סל"ד עד OD600 של 0.2-0.5 הוא הגיע (~ 18 שעות). מעבירים את החיידקים לצינור חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. בודדו את הדנ"א באמצעות ערכת midiprep נמוכה או נטולת אנדוטוקסין.
    5. בדוק את תקינות ITR עם 20 μL של תקציר אנזים הגבלת אבחון באמצעות XmaI (או SmaI). להכין תגובה המכילה פלסמיד 500 ng , 0.5 μL של אנזים, 1x חיץ; לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C. הפעל את התגובה על 0.8% agarose-gel. אם ITR שלמים, העיכול ייתן להקה ב~2.9 kb ורצועה נוספת בגודל הקלטת. אם לא נצפתה רצועה מובחנת זו, ייתכן שה-ITR לא יהיה שלם, ויהיה צורך לבצע שיבוט מחדש.
      הערה: לפלסמידים המכילים אתרי הגבלה של XmaI (או SmaI) (בנוסף לאלה שב- ITR) יופיעו רצועות נוספות על הג'ל.

דיאגרמת עיצוב פריימר PCR, הערת רצף DNA, פריימרים קדימה ואחורה, גוף הגן.
איור 2: דוגמה מייצגת לעיצוב פריימר. עיצוב פריימר קדימה ואחורה עבור טרנסגן mScarlet (דוגמה מייצגת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כמותרכיב
X μLתבנית DNA (25 ng)
1 μLפריימר F (10 מיקרומטר)
1 μLפריימר R (10 מיקרומטר)
1 μLdNTP (10 mM)
10 מיקרוליטרחיץ Phusion (5x)
1 μLפוסיון פולימראז
X μLמים
50 מיקרוליטרכרך סופי

טבלה 1: ריאגנטים להגברת PCR. המרכיבים הדרושים לתגובת PCR מוצלחת.

צעדטמפרטורהזמן
דנטורציה ראשונית98 °C1 דקות
30 מחזורים98 °C10 שניות
Tm של פריימר30 שניות
72 °C30 שניות ל- KB
הארכה סופית72 °C10 דק'
אחז4 °Cללא הגבלה

טבלה 2: תכנות הגברה PCR. פרמטרי הרכיבה הנדרשים לתגובת PCR מוצלחת.

כמותרכיב
X μLמוצר PCR (1 מיקרוגרם) או פלסמיד pAAV (3 מיקרוגרם)
5 מיקרוליטרחוצץ (10x)
1 μLEcoRI-HF
1 μLNotI-HF
X μLמים
50 מיקרוליטרכרך סופי

טבלה 3: ריאגנטים לעיכול. המרכיבים הדרושים לתגובת עיכול מוצלחת.

כמותרכיב
X μLהוספה (X ng)
X μLעמוד שדרה (50 ננוגרם)
2 μLT4 DNA Ligase Buffer (10x)
1 μLליגאז DNA T4
X μLמים
20 מיקרוליטרכרך סופי

טבלה 4: ריאגנטים של קשירה. המרכיבים הדרושים לתגובת קשירה מוצלחת.

3. ייצור וקטורי עם טרנספקציה פלסמיד משולש

הערה: הערכים הבאים ממוטבים עבור באר אחת של צלחת 6 בארות המניבה נפח הכנה גולמי סופי של 2 מ"ל. ניתן להגדיל את כל הערכים ב- 10x עבור צלחת בגודל 15 ס"מ המניבה נפח סופי של 20 מ"ל או להקטין פי 4 עבור צלחת בעלת 24 בארות עם נפח סופי של 500 μL.

  1. צור מלאי של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר של פוליאתילנימין הידרוכלוריד (PEI) MAX על ידי המסת 100 מ"ג של PEI MAX ב-100 מ"ל מים מזוקקים. כוונן את ה-pH ל-7.1 עם NaOH. סנן לעקר את התערובת עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולהקפיא 1 מ"ל aliquots ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך. לאחר הפשרה, לאחסן את מגיב במשך חודש אחד ב 4 °C (75 °F).
  2. זרעו 3 x 10 5 HEK293 או HEK293T תאים לתוך צלחת 6 בארות עם מדיום עיט מעובד של Dulbecco שחומם מראש (DMEM,4.5 גרם / ליטר גלוקוז, 110 מ"ג / ליטר נתרן פירובט) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). לגדול ל~75%-90% מפגש באינקובטור שנקבע ב-37°C ו-5% CO2 (איור 3).
    הערה: תאים בתרבית עם פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) נצפו כמפחיתים את תפוקת הייצור הווקטורי. שימוש בטכניקה סטרילית נכונה עוקף את הצורך להשתמש ב- P / S, ולכן מומלץ לא לגדל תאי HEK293 עם אנטיביוטיקה20. אם P/S נדרש בהתמרות במורד הזרם, מומלץ להוסיף P/S להכנה גולמית לאחר הקציר.
  3. בצינור של 2 מ"ל, הכינו תערובת המכילה 1.3 מיקרוגרם pAAV2/2 (Rep/Cap, סרוטיפ 2), 1.3 מיקרוגרם pAAV.GOI, 2.6 מיקרוגרם pAdΔF6 ו-DMEM נטול סרום (SF) (4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט) לנפח כולל של 100 מיקרוליטר (ראו טבלה משלימה 1 לחישובים נוחים).
  4. הכינו בקרה שלילית בצינור נפרד על ידי החלפת pRep/Cap בכל פלסמיד שאינו קשור. הבקרה השלילית מסבירה פלסמיד pAAV.GOI לא ארוז הקיים בהכנה הגולמית שעלולה להדביק תאים במהלך התמורה, אם כי נדיר.
    הערה: פלסמיד maxiprep או midiprep נטול אנדוטוקסין נמוך או נטול הוא אידיאלי עבור טרנספקציה משולשת ובדרך כלל מייצר וקטור טיטר גבוה יותר בהשוואה ל- DNA miniprep, אם כי ניתן להשתמש ב- DNA miniprep לבדיקות מקדימות מהירות ומלוכלכות.
  5. הוסף 5.2 μL של PEI MAX לתערובת פלסמיד; זוהי תערובת פלסמיד:PEI ביחס של 1:1. מערבבים היטב על ידי פעימות 10-15 פעמים על מערבל מערבולת להגדיר 7. אם מיוצרים תכשירים וקטוריים מרובים, הוסף PEI לכל תערובת פלסמיד במרווחי זמן קבועים של דקה אחת (כלומר, הכנה 1 ב- t = 0 דקות, הכנה 2 ב- t = 1 דקה וכו ') כדי לאפשר תזמון מספיק כדי לשאוף בארות ולדלל את התגובה בשלבים הבאים.
    הערה: יחס של 1:1 של פלסמיד:PEI נצפה כאופטימלי. עם זאת, משתמשים בודדים יכולים למטב יחס זה ליעילות מרבית. עיין בדיון כיצד לבצע אופטימיזציה של PEI (ראה גם טבלה משלימה 2).
  6. לדגור על כל צינור במשך 15 דקות בדיוק ולאחר מכן לדלל את התגובה עם 1.9 מ"ל של SF DMEM (4.5 גרם / ליטר גלוקוז, 110 מ"ג / ליטר נתרן פירובט) עבור נפח סופי של 2 מ"ל. פיפטה עדינה 2x כדי לערבב. ערבוב יתר ישבש מתחמי פלסמיד/PEI ויביא ליעילות טרנספקציה נמוכה יותר.
  7. יש לשאוב מדיה מבאר ולהוסיף פלסמיד:תערובת PEI בעדינות על דפנות הבאר כדי למנוע ניתוק תאי. לדגור על תאים במשך 72 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. ליזה של תאים והיפרדות במהלך הדגירה היא תהליך נורמלי של ייצור rAAV (איור 4).

תרבית תאים בתמונת מיקרוסקופ; ניתוח מורפולוגיה תאית.
איור 3: תאי HEK293 מוכנים להתמרה. המפגש האידיאלי (75%-90%) של תאי HEK293 הדרושים לטרנספקציה של פלסמיד משולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גידול תרבית תאים במשך ארבעה ימים; תמונות מיקרוסקופ יום 0-3; תצפית על התפשטות תאים.
איור 4: תאי HEK293 לאחר טרנספקציה. המראה של תאי HEK293 לפני ואחרי 1, 2 או 3 ימים לאחר transfection עם pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2 , pAdΔF6 ויחס 1:1 של פלסמיד:PEI . פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. קצירת תכשירים וקטוריים גולמיים

  1. להקפיא את כל הצלחת של תאים נגועים במשך 30 דקות ב -80 ° C, ולאחר מכן להפשיר במשך 30 דקות ב 37 ° C. חזרו על הפעולה במשך שלושה מחזורי הקפאה/הפשרה. אין להסיר את המכסה – הצלחת חייבת להישאר סטרילית בפנים. צלחות יכולות להישאר בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות להמשיך לשלבים הבאים.
    הערה: אינקובטור ללא לחות עובד הכי טוב להפשרה, מה שממזער עיבוי בחלק החיצוני של צלחות שיכול להוביל לזיהום בשוגג.
  2. בצע את שני השלבים הבאים במכסה מנוע זרימה למינרית באמצעות טכניקות אספטיות. מערבבים כל באר על ידי צנרת כדי להבטיח הפרעה מקסימלית של התאים. מעבירים ליזט לצינור 2 מ"ל וצנטריפוגה למשך 15 דקות במהירות של 15,000 x גרם, בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת תאים.
  3. בזהירות להעביר supernatant לצינור חדש 2 מ"ל. ניתן להשתמש בתכשיר גס זה באופן מיידי ללא טיטרציה או טיהור. ניתן לאחסן וקטור ב 4 ° C במשך מספר חודשים או -20 ° C במשך שנים.
    הערה: במידת הצורך, ניתן לחשב טיטרים באמצעות PCR כמותי (qPCR) על ידי כימות מספר הגנומים הווקטוריים (VG) בתוך חלקיקים עמידים ל-DNase. ככזה, טיטרים ניתנים ביחידות של VG / mL. וקטור המאוחסן במשך מספר חודשים ב 4 °C צריך להיות טיטרציה מחדש לפני השימוש כמו וקטור יכול לצבור ו / או לקשור דפנות צינור, הפחתת titer של התכשיר.

5. התמרה

  1. לוחית את סוג התא הרצוי (למשל, Huh7) בלוח של 96 בארות במפגש יעד של 50%-75%, בהתאם למשך ההתמירה. שטף גדול יותר עלול לגרום ליעילות מופחתת של התמרה AAV.
  2. הוסף וקטור (למשל, CMV.mScarlet) לתאים מבלי לדעת את הטיטר של ההכנה הגסה ליישומים שבהם המינון אינו רלוונטי, כגון בדיקת פאנל של קפסידים להתמרה בסוג תא חדש. בצע סדרת דילול 1:3 של התכשיר הגולמי במדיה נטולת סרום (SF) כדי לקבל את כמות הווקטור האופטימלית הדרושה ליישום. שואפים מדיה מצלחת 96 בארות ומוסיפים 50-100 μL של הכנה גולמית מדוללת לבארות. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO2.
    הערה: הסרום עשוי להכיל נוגדנים שיכולים לנטרל את וקטור ה-AAV ולהפחית את יעילות הטרנסדוקציה. עם זאת, ניתן להשתמש בסרום במהלך התמרה עבור סוגי תאים רגישים.
  3. יש להסיר את הווקטור לאחר 48 שעות לאחר הטרנסדוקציה (HPT) ולשטוף תאים פעם אחת במי מלח חוצצים של פוספט שחומם מראש (PBS). ניתן גם להסיר וקטורים ולהחליף אותם במדיה המכילה סרום תוך 2 hpt עבור סוגי תאים רגישים. עבור יישומים רבים, בצע דגירה לילה כדי להתמר תאים ולהחליף בארות עם מדיה טרייה המכילה סרום בבוקר. סוגי תאים חזקים, כגון Huh7 ו-U2-OS, אינם דורשים שינוי מדיה.
  4. לסיים את ההתמרה על ידי קיבוע תאים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות. ניתן להשתמש גם בשיטות סיום שונות על בסיס היישום (למשל, ליזיס). עבור רוב סוגי התאים, ביטוי שיא מתרחש על ידי 48 hpt ולכן הוא נקודת קצה ניסיונית נפוצה.

6. וריאציות על שיטת התמרה לפי סוג תא

הערה: סוגי תאים שונים דורשים תנאי תרבית שונים. לכן, תוספת של וקטור עבור transduction צריך להיות מותאם על פי הצרכים של סוג התא. להלן פרוטוקולי התמרה ספציפיים מאוד עבור סוגי התאים הכלולים בתוצאות המייצגות, הממחישים כמה וריאציות של פרוטוקולי התמרה שחוקר עשוי לרצות לנסות לצרכיו שלו.

  1. אורגנואידים של עכבר במעי הדק
    1. להפיק אורגנואידים של עכבר במעי דק (mSIOs) מהכנת קריפטת מעי דק מעכברי C57BL/6J. הטמע אורגנואידים ב-90% מטריצת קרום מרתף ותרבית בלוחות של 24 בארות המכילות מדיום גידול אורגנואידי (ללא אנטיביוטיקה) או מדיום קדם-טרנסדוקציה (50% מדיום מותנה Wnt3a [מיוצר בבית באמצעות תאי L Wnt-3A במדיום גידול אורגנואידים], ניקוטינאמיד 10 mM, מעכב ROCK 10 מיקרומטר ו-2.5 מיקרומטר CHIR99021) למשך מעבר אחד (5-7 ימים) לפני ההמרה ב-37°C ו-5% CO2.
    2. לפני הטרנסדוקציה, שוטפים אורגנואידים עם D-PBS, משבשים את כיפות מטריצת קרום המרתף על ידי פיפטינג, ומנתקים אורגנואידים לצברי תאים קטנים על ידי דגירה שלהם בתווך דיסוציאציה למשך 10 דקות ב 37 ° C ופיפטציה נוספת.
    3. עצור את תהליך הדיסוציאציה של התאים על ידי הוספת 5% FBS ב- DMEM/F-12 עם HEPES של 15 mM, העבר אשכולות תאים לצינורות צנטריפוגות ואסף אשכולות תאים באמצעות צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר של 1000 x גרם.
    4. השהה מחדש את אשכולות התאים בתווך התמרה (מדיום טרום התמרה המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן או מדיום גידול אורגנואיד המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן) והעבר ללוחות 48 בארות, ולאחר מכן תוספת של תכשירי גלם AAV אריזות CMV.mScarlet להתמרה.
    5. בצע התמרה של אורגנואידים על ידי צנטריפוגה של הצלחת במשך 1 שעות ב 600 x גרם ו 37 ° C ולאחר מכן לדגור ב 37 ° C במשך 6 שעות נוספות. לאסוף אורגנואידים מומרים בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1000 x גרם, טמפרטורת החדר, ולשים על קרח.
    6. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש אורגנואידים מותמרים במטריצת קרום מרתף 90% בתווך טרום התמרה או בתווך גידול אורגנואידי וטיפות זרעים של 20 μL לתוך באר אחת של זכוכית כיסוי קאמרית מחוממת מראש.
    7. לאחר הדגירה במשך 10 דקות באינקובטור, הטמיעו את הטיפה ב 350 μL של מדיום טרום התמרה או מדיום גידול אורגנואידי ודגרו ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור. קבע את יעילות ההמרה 2-5 ימים לאחר ההמרה על ידי הדמיה של האורגנואידים המומרים במיקרוסקופ קונפוקלי והערך את אחוז התאים הפלואורסצנטיים האדומים לכל אורגנואיד.
  2. תאי BeWo
    1. ב 24 שעות לפני הטרנסדוקציה, צלחת כוריוקרצינומה שליה אנושית BeWo תאים ב 10,000 תאים לכל באר של צלחת 96 באר. יש לדלל תכשירי AAV גולמיים באריזת CMV.mScarlet ביחס של 1:1 ב-F12-K BeWo בינוני ללא סרום, עד לנפח כולל של 50 μL לבאר. לשאוף בינוני מבאר ולהחליף עם AAV מדולל 50 μL לכל באר.
    2. דגרו על תאים בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (~18 שעות) ולאחר מכן הוסיפו 100 μL של מדיום BeWo F12-K המכיל 10% FBS כדי להעלות את הנפח הכולל ל-150 μL. לדגור על תאים למשך 6 שעות נוספות למשך 24 שעות לאחר ההתמרה (hpt).
    3. להדמיה, צבעו תאים חיים בצבע Hoechst למשך 30 דקות בתווך F12-K, ולאחר מכן החליפו את המדיום ב-DMEM נטול פנול המכיל 10% FBS, תוסף גלוטמקס 1x ותוסף נתרן פירובט 1x להדמיה. בצע דימות תאים חיים במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות ערכות מסננים DAPI (עבור הדמיית Hoechst) ו- mCherry (עבור הדמיית mScarlet) עם 37°C ו- 5% CO2.
  3. תאי Hepa1-6 ו- Huh7
    1. צלחת מורין Hepa1-6 תאי כבד ותאי כבד אנושיים Huh7 ב- DMEM (4.5 גרם / ליטר גלוקוז, 110 מ"ג / ליטר נתרן פירובט, 10% FBS) ב 5,000 תאים לבאר של צלחת 96 באר 24 שעות לפני טרנסדוקציה.
    2. הוסף 50 μL של תכשירי AAV גולמיים לא מדוללים אריזות CMV.mScarlet ישירות לתאים ודגרה ב 37 ° C במשך 48 שעות. יש לשטוף תאים פעם אחת ב-PBS, לקבע ב-4% PFA ולהכתים בצבע Hoechst למשך 10 דקות. בצע הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות ערכות המסננים DAPI (עבור הדמיית Hoechst) ו- mCherry (עבור הדמיית mScarlet).
  4. תאי C2C12 ו-HSkMC
    1. מיובלסטים לא ממוינים של מורין C2C12 ומיובלסטים של תאי שריר שלד ראשוניים אנושיים לא ממוינים (HSkMC) ב-5,000 תאים לבאר של צלחת בת 96 בארות, 72 שעות לפני ההתמרה.
    2. יש לדלל תכשירי AAV גולמיים באריזת CMV.mScarlet ל-1:1 ב-DMEM (4.5 גרם / ליטר גלוקוז, Penn/Strep, 20% FBS) עבור מיובלסטים C2C12 או מצע צמיחת שרירי שלד עבור מיובלסטים HSkMC. להבדיל מיובלסטים HSkMC למיובלסטים על ידי שינוי המדיה למדיה בידול.
    3. לדגור מיובלסטים ו myotubes בהכנות AAV מדולל במשך 24 שעות ב 37 ° C. צביעת תאים חיים עם צבע Hoechst למשך 10 דקות ותמונה במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות ערכות המסננים DAPI (להדמיית Hoechst) ו-mCherry (להדמיית mScarlet).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מציאת קפסיד אופטימלי להמרת תאים מתורבתים בעלי עניין
מגוון סוגי תאים הומרו כדי לקבוע את הטרופיזם של סרוטיפים שונים של קפסיד (איור 5). הסרוטיפים הטבעיים AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24, וגרסאות הקפסיד המהונדסות Anc80 25, DJ 26, LK0327 ו-KP1 28 נארזו עם גנום וקטורי המבטא mScarlet תחת מקדם CMV, ששובט בשיטות המפורטות בפרוטוקול זה. תכשירי וקטור גולמי ללא טיטציה דוללו באמצעי התרבית המתאימים, ותאים הומרו במשך 24+ שעות וצולמו (איור 5B). יעילות ההתמרה חושבה על ידי החלק היחסי של סך התאים שהיו mScarlet+, או שיעור התאים במישור z יחיד שהיו mScarlet+ (עבור אורגנואידים של עכבר במעי הדק; איור 5C). יעילות התמרה (תאי mScarlet+) אינה מסופקת עבור צינוריות מיו-צינוריות C2C12 ו-HSkMC ממוינות, אלא עבור מיובלסטים C2C12 ו-HSkMC לא ממוינים (איור 5A).

AAV2 ו-KP1 היו הסרוטיפים החזקים ביותר בקווי תאים שנבדקו (איור 5A). כמו כן נצפה כי סוגי תאים דומים שמקורם במינים שונים מומרים ביעילות משתנה. לדוגמה, Hepa1-6 (קו תאי כבד שמקורו במורין) מציג ירידה ניכרת בהתמרה בהשוואה ל-Huh7 (קו תאי כבד שמקורו בבני אדם) בעת שימוש ב-AAV2 (איור 5B). יתר על כן, תנאי מדיה שונים ממלאים תפקיד חשוב במהלך ההעברה. אורגנואידים של עכברים במעי דק (mSIOs) שגודלו בתרבית במצע קדם-טרנסדוקציה עוברים פחות טרנסדוקציה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית במצעי גדילה אורגנואידים (איור 5C). נוסף על כך, AAV2 מתמיר ביעילות מיובלסטים לא ממוינים של HSkMC ומיובלסטים של HSkMC ממוינים (איור 5B), אף על פי שניתוח כמותי של מיו-צינוריות הוא קשה ולכן אינו מסופק.

יעילות ההתמרה הגבוהה שנצפתה עבור סוגי תאים שונים באיור 5 מראה שניתן להשתמש בתכשירים וקטוריים גולמיים ביעילות כדי להתמיר מגוון סוגי תאים ללא שלבים נוספים כגון טיהור וטיטרציה. עם זאת, יש לשקול היטב בעת בחירת קפסיד כדי למקסם את העברת הטרנסגנים. קווי תאים וקפסידים רבים אחרים נבדקו בעבר ומתפרסמים, אם כי עם תכשירים וקטוריים מטוהרים12.

השפעה בלתי תלויה של חלקיק וקטורי בתנאי מדיה יכולה להשפיע על יעילות הטרנסדוקציה. עם זאת, מקובל כי טרופיזם (כלומר, ספיגה ספציפית לסוג התא וביטוי של וקטור) הוא תכונה שהיא ספציפית לקפסיד29. השוואה בין תכשירים גולמיים ומטוהרים התואמים למינון עדיין לא נצפתה כמשפיעה על הטרופיזם התאי. לכן, ניתן להשתמש בתכשירים וקטוריים גולמיים באופן דומה לווקטורים מטוהרים בתרבית תאים.

יעילות התמרה וקטורית AAV בקווי תאים; תרשים נתונים, תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
איור 5: התמרה וקטורית גולמית של סוגי תאים שונים. (A) אחוז mScarlet+ לאחר הוספה של וקטורי AAV שונים המכילים טרנסגן mScarlet . (B) תאים המבטאים mScarlet המועברים מסרוטיפ AAV 2. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (Hepa1-6, Huh7, C2C12 ו-HSkMC), 200 מיקרומטר (BeWo), 20 מיקרומטר (mSIO). קיצורים: hpt = שעות לאחר ההעברה. (C) אורגנואידים של עכברים במעי דק (mSIOs) טופלו ב-rAAV במצע קדם-התמרה או במצע גדילה אורגנואידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: דף עבודה של טרנספקציה פלסמיד משולש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: גליון עבודה לאופטימיזציה של PEI. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוט
פרוטוקול השיבוט אינו מוגבל לפלסמיד pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 המשמש לעיל וניתן לשנות אותו בקלות בהתבסס על צרכי הניסוי של החוקר. פלסמידים רבים המכילים ITR זמינים באינטרנט לרכישה. לדוגמה, פלסמידים המכילים גם Cas9 וגם אתר שיבוט sgRNA זמינים אך דורשים כמה שלבים נוספים כגון חישול אוליגונוקלאוטיד וטיפול PNK30. בנוסף, ניתן למצוא פלסמידים המכילים אתר שיבוט מרובה (MCS) עם ITR בלבד וללא אלמנטים רגולטוריים פנימיים31. אם רוצים להשתמש בפלסמידים שונים, אנזימי ההגבלה (RE) המשמשים לעיכול הם בדרך כלל המרכיבים היחידים שייתכן שיהיה צורך לשנות בפרוטוקול זה. עם זאת, מגבלה של rAAV היא קיבולת המטען המוגבלת שלה. בשל מגבלות פיזיות של הקפסיד, הגנום הווקטורי לא יעלה על 4.9 קילובייט, כולל ITR.

בעת בידוד פלסמיד מחיידקים, חיוני להשתמש בערכת midiprep או maxiprep נמוכה או נטולת אנדוטוקסין כדי להפחית את הנזק לתאים במהלך טרנספקציה או התמרה של פלסמיד משולש. פלסמיד מערכות miniprep מכיל לעתים קרובות זיהומים גבוהים יותר, ריכוזים מופחתים, ופחות DNA סליל, כל אלה יכולים להשפיע על הייצור במורד הזרם של rAAV ולכן אינו מומלץ.

זה קריטי להבין את המבנה והמאפיינים של ITR במהלך השיבוט. ראשית, קשה מאוד להשתמש ב- PCR באמצעות ITR. יש להימנע מעיצובי שיבוט הדורשים הגברה של PCR באמצעות ITR, ובנוסף להגביל את השימוש בטכניקת שיבוט ההרכבה של גיבסון. ככזה, שיבוט אנזים הגבלה הוא השיטה המועדפת לשיבוט לפלסמידים המכילים ITR. יתר על כן, פריימרים מסוימים לריצוף Sanger עשויים שלא להיות תואמים אם האזור הרצף מכיל את ITR. במקום זאת, מומלץ להשתמש בפריימרים שרצפים הרחק מה-ITR ולתוך גוף הגנום הווקטורי כדי לקבל תוצאות ריצוף מדויקות יותר. שנית, ITR מועדים למחיקות, סידורים מחדש ומוטציות כאשר הם הופכים לחיידקים להגברת פלסמיד32,33. כדי למתן אירועים אלה, מומלץ להשתמש בזני חיידקים מוכשרים חסרי רקומבינציה, כגון Stbl3, ולדגור עליהם בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי להאט את חלוקות התאים. לבסוף, נצפה כי מושבות קטנות יותר עשויות להתאים לשיבוטים ללא סידורים מחדש או מחיקות, שכן אלה ללא ITR עשויים להעניק יתרון צמיחה ולהיות גדולים יותר. לכן, מומלץ לבחור מושבות קטנות.

ייצור וקטורי
הייצור המוצלח של וקטור rAAV יכול להיות מושפע ממספר אלמנטים. גורם קריטי אחד הוא בריאותם של תאי HEK293 או 293T המשמשים להעברה. באופן כללי, מספרי מעבר נמוכים הם אידיאליים, מכיוון שתאים בעלי מעבר גבוה עשויים להציג שונות גנוטיפית ופנוטיפית שיכולה להפחית את רמות ה-rAAV. בנוסף, צפיפות תאי הזרע צריכה להיות 75%-90% מפגש לייצור יעיל. תאים דלילים מייצרים תפוקות וקטוריות נמוכות מכיוון שיש פחות תאים זמינים לייצור וקטורים, בעוד שתאים מגודלים לא יהיו נגועים ביעילות.

שינויים בין מגרשים מגיבים, מלאי תאים, ושונות כללית ממעבדה למעבדה תורמים להבדלים ביעילות הטרנספקציה ובטיטר הייצור. גורם אופטימלי אחד שיכול להוביל לשיפור הטיטר הוא יחס פלסמיד:PEI בתגובות טרנספקציה. חיוני להשתמש ב-PEI MAX טרי (בן < חודש). מומלץ להשתמש ביחס פלסמיד:PEI של 1:1 כנקודת התחלה, ואם יעילות הטרנספקציה או הטרנסדוקציה נראית גרועה, בדוק מספר יחסים שונים. אופטימיזציה של Titer היא הקלה ביותר אם משתמשים בטרנסגן עם קריאה חזותית, כגון CMV.Luc.IRES.EGFP reporter trangene המשמש כאן כחומר מוצא לשיבוט. כדי לבצע את האופטימיזציה, בצע את שלב 3 של הפרוטוקול באמצעות צלחת של 12 בארות והקטנת מסות הפלסמיד ונפחי הריאגנט בשניים (מסת הפלסמיד הסופית היא 2.6 מיקרוגרם). כוונן את נפח PEI בהתאם כך שיתאים ליחסים הנעים בין 1:0.75 ל-1:3, עם דרגות הולכות וגדלות של 0.25 (איור 6). לדלל כל תגובה עם 950 μL של מדיה SF לאחר 15 דקות. לנוחיותכם, ניתן להכין תערובת מאסטר המכילה את הפלסמידים המשולשים ולהכניס בנפרד לצינורות של 1.5 מ"ל לפני הוספת קובץ משלים 2 של PEI-see. קצור את הווקטור, התמיר תאים בעלי עניין ותמונה. הבאר עם יעילות ההולכה הגבוהה ביותר (שיעור תאי GFP+) מתאימה לטיטר הגבוה ביותר וליחס האופטימלי ביותר של PEI:DNA.

תרשים תהליך טרנספקציה של פלסמיד: הכן תערובת מאסטר, שנה יחסי PEI, התמר תאים, וקטור קציר.
איור 6: זרימת עבודה של אופטימיזציה של PEI. סכמה של השלבים הדרושים למיטוב PEI. יחסים מרובים של פלסמיד: PEI נבדקים כדי לקבוע את היחס האופטימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שיקולי קציר וטיטר
טכניקת ההקפאה/הפשרה המשמשת לקצירת וקטור rAAV מבליחה ביעילות תאי HEK293 באופן התואם את השימוש הישיר בליזט המזוקק כדי להתמיר תאים בתרבית. סרוטיפים מסוימים של rAAV, כגון AAV1, AAV8 ו-AAV9 משתחררים מתאים במהלך הייצור הווקטורי וניתן לקצור אותם מתווך התא בתרבית ללא מחזורי הקפאה/הפשרה34. השיטה המתוארת כאן מניבה בדרך כלל טיטרים בסדר גודל של 1 x 10 10 VG/mL בעת שימוש בקפסידים AAV2, ו- 1 x10 11 VG/mL עבור AAV8. בעוד טיטרים גבוהים יותר ניתן להשיג על ידי דטרגנט או ליזה כימית אחרת, אלה מזיקים לתאים בשימוש במורד הזרם דורשים rAAV להיות מטוהרים עוד יותר מן הליזט. טיטר תחתון הוא פשרה אחת שחוקר צריך לשקול כאשר הוא קובע אם תכשירים גולמיים מתאימים לצרכי המחקר שלהם, עם זאת, טיטרים נמוכים יותר באופן שולי המיוצרים על ידי השיטות המתוארות כאן יכולים להתמיר סוגי תאים רבים היטב (ראה תוצאות מייצגות). בנוסף ליעילות הטרנספקציה ובריאות התא, טיטרים וקטוריים משתנים בהתאם לקפסיד המשמש במהלך ייצור rAAV ולגודל ולרצף של הטרנסגן בתוך VG35.

בעת קצירת תכשירים וקטוריים גולמיים, DNA פלסמיד ששימש במהלך טרנספקציה פלסמיד משולש עשוי להיות נוכח, ולמרות שהוא נדיר, לגרום לטרנספקציה במורד הזרם במהלך הטרנסדוקציה. יתר על כן, VGs לא ארוזים עשויים להיקשר לחלק החיצוני של קפסידים ולעורר תגובה חיסונית מולדת לדנ"א חד-גדילי עירום וזר36,37. לכן, סוגי תאים רגישים עשויים לדרוש תכשירים וקטוריים להיות מעוכלים ומטוהרים DNase כדי להסיר VGs ופלסמיד לא ארוזים.

אם רוצים לחשב את הטיטר של תכשיר גולמי, ניתן לבצע qPCR כדי לכמת את מספר VG ארוז בתוך חלקיקים עמידים בפני DNase (DRP). בקצרה, כמות קטנה של הכנה גולמית מתעכלת DNase כדי להסיר DNA פלסמיד, חומצות גרעין מזהמות, או VG ארוז חלקית. לאחר מכן הדגימה כפופה ל-qPCR וה-VG המוגן בתוך DRPs מכומת, והתוצאה היא טיטר עם יחידות של גנום וקטורי לכל מ"ל של הכנה גולמית38. לא מומלץ לבצע טיטרציה וקטורית באמצעות בדיקות מבוססות ELISA המכמתות את הטיטרים של קפסיד. בהשוואה לנגיף AAV מסוג פראי, rAAV סובל משיעור של קפסידים ריקים וארוזים חלקית39. ELISA תכמת את כל הקפסידים ללא קשר לתכולת הגנום שלהם ותעריך יתר על המידה את היחידות המתומרות הקיימות בהכנה, הדורשת VG ארוז.

שיקולי התמרה
גורמים רבים משפיעים על התמרה של rAAV ויש לקחת בחשבון כל ניסוי חדש. בהתאם למקדם המניע את ביטוי הטרנסגנים, הופעת הביטוי יכולה להתרחש כבר 4 שעות לאחר הטרנסדוקציה (hpt), וביטוי שיא מושג בדרך כלל על ידי 48 hpt. חשוב לזכור את משך הזמן מהזריעה הראשונית של התאים ועד לנקודת הסיום של הניסוי. זאת כדי להעריך את המפגש ההתחלתי של התאים ולוודא שהם לא יגדלו יתר על המידה עד סוף הניסוי. אם התאים מתמזגים יתר על המידה, ההתנהגות התאית עשויה להשתנות עקב תגובת סטרס ויכולה לבלבל את תוצאות הניסוי. סוגי תאים מסוימים, כמו U2-OS, יכולים לסבול צמיחת יתר/עיכוב מגע די טוב. בנוסף, הם יכולים לעמוד בפרקי זמן ארוכים (48 שעות+) בתווך ממוזג ללא סרום - תוצר של פרוטוקול ייצור זה. עם זאת, סוגי תאים רגישים עשויים לדרוש הוספה בסרום או דילול של ההכנה הגולמית עם מדיום גידול מיוחד כדי לשמור על הבריאות במהלך ההעברה. יעילות התמרה מופחתת מעט משימוש במדיה המכילה סרום היא פשרה פוטנציאלית לבריאות התא ויש לשקול אותה על ידי החוקר.

בדרך כלל, עבור תאים המתחלקים במהירות, מפגש התחלתי של כ -50% הוא אופטימלי עבור יישומים שיסתיימו 48 hpt. עם זאת, ניתן להתאים את המפגש בהתאם לצרכי הניסוי. לא מומלץ להתמיר קווי תאים אימורטליים מסוג חד-שכבתי מעל 75% מפגש עקב ירידה ביעילות הטרנסדוקציה. רוב סוגי התאים בתרבית מומרים בהצלחה ובריאים לאחר דגירה של לילה עם תכשירי rAAV גולמיים, ולאחר מכן שינוי למדיה טרייה המכילה סרום בבוקר.

סרוטיפ קפסיד הוא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ייצור rAAV כדי להתמיר תא מטרה, שכן הקפסיד הוא הגורם העיקרי של טרופיזם תאי וביטוי טרנסגנים לאחר מכן13. AAV2 הוא סרוטיפ בשימוש נרחב בשל יכולתו להתמיר ביעילות סוגים רבים של תאים בתרבית12. ניתן לייחס תכונה זו של AAV2 לפרוטאוגליקנים של הפרין סולפט (HSPGs) המשמשים כגורם ההתקשרות העיקרי עבור AAV2 ולרמות הגבוהות של HSPGs על תאים בתרבית מההסתגלות לגידול בצלחת40. קפסידים אחרים, כגון AAV9, יעילים פחות בהתמרת סוגי תאים רחבים ועשויים להיות מוסברים על ידי גורמי התקשרות ההסתמכות שלהם שאינם באים לידי ביטוי בהגדרה זו41. לכן, אנו ממליצים על AAV2 כקפסיד הבחירה הראשונה בתאים בתרבית אם תא יעד רצוי לא נבדק בעבר עם rAAV בספרות.

שימו לב שמגבלה עיקרית של תכשירים וקטוריים גולמיים היא שהם אינם מתאימים להתמרה של מודלים של בעלי חיים. מחקרי In vivo דורשים הכנות לטיהור ולהערכת איכות.

ביטוי טרנסגנים ושיקולי אינטגרציה פוטנציאליים
rAAVs אינם מביאים באופן אמין לביטוי קבוע של הטרנסגן. עם הזמן, VGs יכולים להיות מושתקים וביטוי מהונדס עשוי להיסגר בעקבות כמה קטעים42. בנוסף, רוב ה-VGs נשארים אפיזומליים, ו-rAAVs אינם מכילים את חלבוני ה-Rep הנגיפיים שיתוווכו אינטגרציה תכופה בגנום המארח כמו בזיהום ליזוגני נגיפי מסוג פראי או יקדמו שכפול של VGs43. כתוצאה מכך, אפיזומים בתאים מותמרים ידוללו בסופו של דבר בין תאי הבת באמצעות חלוקות.

אינטגרציה ברמת הבסיס היא אפשרות לכל חומר הדנ"א המהונדס המועבר. עם זאת, VGs המכילים ITR נוטים לאינטגרציה בתדר גבוה יותר44. לכן, ביטוי קבוע של טרנסגן ניתן לראות בתת-קבוצה קטנה של תאים. משתמשים צריכים לשקול אפשרות זו במיוחד בעת שימוש ב- rAAV כדי לספק אנזימים חותכי DNA, כגון Cas9, מכיוון שהפסקות דו-גדיליות עלולות לגרום לתדירות גדולה עוד יותר של אינטגרציה וביטוי קבוע45. בעוד שזה הופך את rAAV למועמד טוב לאספקת תבניות תיקון מכוונות הומולוגיה לתיוג אנדוגני או הוספת גנים, יש לשקול את האפשרות של החדרת Cas919,46.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C.M. היא יועצת עבור Janssen Pharmaceuticals ומכהנת ב-SAB עבור NewBiologix. לכל שאר המחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לרוברט טג'יאן וחאווייר דרזק על תמיכתם והשימוש בציוד מעבדה. אנו מודים למארק קיי על תרומתו לפלסמידים KP1 ו- LK03 rep/cap, וללוק ונדנברגה על פלסמיד AAV4 rep/cap. המימון ניתן על ידי המכון הרפואי הווארד יוז (34430, R. T.) והמכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית תוכנית הכשרה EDUC4-12790. נ.ו. מודה על מימון ממרכז תאי הגזע בברקלי באמצעות מלגת סיבל לפוסט-דוקטורט ומקרן המחקר הגרמנית (DFG) באמצעות מלגת וולטר בנימין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Snapgene DNA צפייה בתוכנהSnapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40AddGene105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)AddGene104963
pAdΔ F6AddGene112867
LB Agar CarbenicillinSigma-AldrichL0418
Boekel Scientific Economy חממה דיגיטליתBoekel Scientific133000
LB בינוני, אבקהMP Biomedicals113002042
קרבנצילין (דיסודיום)GoldBioC-103-5
ניו ברונסוויק I26 שייקראפנדורףM1324-0000
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהקורנינג430828
צנטריפוגה 5810 REppendorf22627040
QIAGEN פלסמיד פלוס מידי ערכתQiagen12945
PCR לשלוף 8 רצועות צינורארה"ב Scientific1402-3900
Mastercycler NEXUSEppendorf6333000022
dNTPThermo Fisher Scientific18427013
5x Phusion BufferNEBB0518Sמסופק עם רכישת Phusion Polymerase
Phusion  DNA פולימראז NEBM0530S
טעינת ג'ל בנאמנות גבוהה, כתום (6X)NEBB7022S
DNA נקי & Concentrator-100ZymoD4029
Zymoclean ג'ל שחזור DNA ערכת ZymoD4001
NotHFNEBR3189S
EcoRI-HFNEBR3101S
CutSmart Buffer (10x)NEBB6004Sמסופק עם רכישת אנזים הגבלה
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific16500100
אתידיום ברומידסיגמא-אולדריץ'E1510
T4 DNA ליגאזNEBM0202S
T4 DNA ליגאז מאגר תגובהNEBB0202Sמסופק עם רכישת צינורות נעילה בטוחה T4 Ligase
Eppendorf (1.5 מ"ל)Eppendorf22363204
דיוק מיקרו-מעבד אמבט מיםתרמו מדעי51221046
צינורות תרבית פלסטיק סטרילייםפישר סיינטיפיק149566B
2.0 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהתומאס סיינטיפיק1149Y01
ZR פלסמיד מיני-פרפ - קלאסיZymoD4015
Xma1NEBR0180S
Sma1NEBR0141S
תאי HEK 293TATCCCRL-3216
פלקון 6 בארותקורנינג353046
Gibco  DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטתרמו-פישר11995065
Sanyo MCO-18AIC (UV) CO2 אינקובטורמרשל סיינטיפיקMCO-18AIC
PEI MAX (פוליאתילנימין הידרוכלוריד)Polysciences24765-100
מיקסר מערבולת ג'יני 2אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית102091-234
Sanyo מקפיא נמוך במיוחדSanyo14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 עם חלון שקוףVWR390-0384
מיקרוצנטריפוגות אפנדורףאפנדורף05-400-005
פלקון 96 בארותקורנינג353072
C57BL/6J עכבריJAX#000664
מדיום גידול אורגנואידSTEMCELL Technologies6005
תאי L Wnt-3AATCCCRL-2647
ניקוטינאמידסיגמאN0636-100G
מעכבROCK STEMCELLTechnologies 72302
CHIR99021STEMCELL Technologies72052
קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) קרום מרתףפישר356231
צלחת 24 בארותפישר08-772-1
D-PBSתרמו פישר סיינטיפיק14-190-250
TrypLE ExpressFisher12604013
DMEM/F-12 עם 15 מ"מ HEPESStemcell Technologies36254
פוליברןMillipore SigmaTR-1003-G
48 בארותצלחות פישר08-772-3D
תרמו סיינטיפיק  Nunc Lab-Tek Coverglass ChamberedFisher12-565-470
תאי BeWoATCCCCL-98
F-12K בינוניATCC30-2004
Hepa1-6ATCCCRL-1830
Huh7UC Berkeley BSD מתקן תרבית תאיםHUH-7
C2C12ATCCCRL-1772
HSkMCATCCPCS-950-010
צמיחת תאי שריר שלד בינוניתסיגמאC-23060
התמיינות שרירי השלד בינוניתסיגמאC-23061
Invitrogen  EVOS מיקרוסקופ פלואורסצנטי צבעונידיגיטלי פישר סיינטיפיק12-563-340
פרקין אלמר אופרה פניקספרקין אלמרHH14001000
PhenoPlate 96 בארותפרקין אלמר6055302
DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםתרמו-פישר31053028
תוסף GlutaMAXתרמו-פישר35050079
נתרן פירובטתרמו-פישר11360070
pAAV2/5 (חזרה/כובע)Addgene104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)Addgene
(Rep/Cap)Addgene
/9n (Rep/Cap)Addgene
Addgene92307
KP1 (נציג/כובע)מתנה על ידי פרופסור מארק קיי (אוניברסיטת סטנפורד)
LK03 (נציג/כובע)מתנה על ידי פרופסור מארק קיי (אוניברסיטת סטנפורד)
pAAV4 (נציג/כובע)מתנה על ידי פרופסור לוק ונדנברג (בית הספר לרפואה של הרווארד)
pAAV.Cas9.sgRNAAddgene61591
pAAV.MCSAddgene46954
gBlock (פרגמנט DNA סינתטי)IDT
צבע 112864-pAAV-DJ-N589X 130878-pAAV2 112865-pAnc80L65AAP

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456(2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42(2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74(2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662(2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85(2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AAVAAVAAVDNA

מאמרים קשורים