מאמר שיטה

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

DOI:

10.3791/65573

⸱

14 ביולי 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול קונבנציונלי בהתחדשות עצם באמצעות תאי גזע מזנכימליים (MSCs) קשה ליישום על פגמים בעצם גדולים מהגודל הקריטי מכיוון שאין לו מנגנון לגרימת אנגיוגנזה. השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מ-MSCs גורמת לאנגיוגנזה וליצירת עצם in vivo באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית (ECO). לכן, גישה זו בתיווך אקולוגי עשויה להיות טיפול מבטיח להתחדשות עצם בעתיד. היבט חשוב ביישום הקליני של גישה זו בתיווך אקולוגי הוא קביעת פרוטוקול להכנת מספיק סחוס להשתלה כדי לתקן את הפגם בעצם. במיוחד לא מעשי לתכנן מסה אחת של סחוס מושתל בגודל המתאים לצורת פגם העצם בפועל. לכן, הסחוס להשתלה חייב להיות בעל תכונה של יצירת עצם באופן אינטגרלי כאשר חלקים מרובים מושתלים. הידרוג'לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית כדי לעמוד בדרישות הקליניות. למרות שהידרוג'לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC in vitro ו- ECO in vivo, חומר הפיגום האופטימלי שיענה על הצרכים של יישומים קליניים טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא מרכיב חיוני במטריצה החוץ תאית של הסחוס והיא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית. כאן, אנו מראים כי הידרוג'ל HA יש תכונות מצוינות לתמוך בהתמיינות חוץ גופית של רקמת סחוס מבוססת MSC ולקדם היווצרות עצם אנדוכונדרלית in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצם אוטולוגית היא עדיין תקן הזהב לתיקון מומים בעצם עקב טראומה, מומים מולדים וכריתה כירורגית. עם זאת, להשתלת עצם אוטוגנית יש מגבלות משמעותיות, כולל כאב תורם, סיכון לזיהום ונפח עצם מוגבל שניתן לבודד מהחולים 1,2,3,4. ביו-חומרים רבים פותחו כתחליפי עצם, המשלבים פולימרים טבעיים או סינתטיים עם חומרים מינרליים כגון סידן פוספט או הידרוקסיאפטיט 5,6. היווצרות עצם בחומרים מהונדסים אלה מושגת בדרך כלל באמצעות החומר המינרלי כחומר ראשוני כדי לאפשר לתאי גזע להתמיין ישירות לאוסטאובלסטים באמצעות תהליך ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש בעכברים עירומים זכרים בני 4 שבועות. אכלסו ארבעה עכברים בכלוב תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 22-24°C ו-50%-70% לחות יחסית. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ודנטלית של טוקיו (מזהה אישור: A2019-204C, A2020-116A ו- A2021-121A).

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

  1. הכן מדיום גידול תאי גזע מזנכימלי (מדיום גידול MSC) על ידי הוספת ערכת התוספת של מדיום גידול MSC למדיה הבסיסית של MSC ואחסן אותה ב -4 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו את מדיום הנשר המותאם של דולבקו ואת מדיום F12 (DMEM/F-12) של Dulbecco על ידי הוספת 10% סרום בק....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הידרוג'ל HA בעטוף MSC גודלו בתרבית בתווך כונדרוגני בתוספת TGFβ3, גורם לכונדרוגנזה41 (שלב 4.1). השווינו את התכונות של HA עם אלה של קולגן, אשר הוכח כיעיל ביצירת שתלי סחוס מלאכותיים מבוססי MSC עבור ossification endochondral, כפי שתואר קודם38. MSCs לא ממוינים לא נכללו כבקרות שליליות במחקר זה מכיוון שהוכח כי MSCs לא ממוינים דורשים משטחים מינרליים כמצע ראשוני ליצירת עצם על ידי התמיינות אוסטאוגנית (כלומר, אוסיפיקציה תוך ממברנלית)7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בחומרי פיגומים מתאימים המקדמים את המעבר מסחוס היפרטרופי לעצם הוא גישה מבטיחה להרחבת שתלי סחוס היפרטרופיים מהונדסים מבוססי MSC ולטיפול במומי עצם בגודל משמעותי מבחינה קלינית. כאן, אנו מראים כי HA הוא חומר פיגום מצוין לתמיכה בהתמיינות של רקמת סחוס היפרטרופית מבוססת MSC במבחנה ולקידום היווצרות עצם אנדוכונדרלית in vivo38. יתר על כן, in vivo, מבני HA הוכחו כמאפשרים איחוי של מבנים מרובים שהושתלו באותו כיס ליצירת עצם משולבת אחת. מכיוון שהאינטראקציה של MSCs עם חומרי פיגומים.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי (KAKENHI) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מס. JP19K10259 ו- 22K10032 ל- MAI).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25w/v% טריפסין-1mmol/L EDTA.4Na תמיסתFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphateNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
גורם גדילה פיברובלסטי בסיסיReprocellRCHEOT002 
אלבומין סרום בקרFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess מונה תאים אוטומטי עם שקופיות תא ספירת תאים וכתם כחול טריפן 0.4%InvitrogenC10283
דקסמתזוןMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429גלוקוז גבוה
Dulbecco's Modified Eagle's תערובת בינונית/תזונתית F-12 HamMerckD6421
סרום בקר עובריHycloneSH30396.03
Gentamicin sulfateFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 מ"ג/מ"ל
מחולל HaccpperTechnoMaxCH-400-5QB50 חל"מ מים חומצה היפוכלורית
תאי גזע מזנכימליים אנושייםLonzaPT-2501
ערכת פיגומים לתרבית תאי HyStemMerckHYS020
IL-1ßתוסף PeproTechAF-200-01B
ITS-GFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741ופעמים; 100
L-Alanyl-L-GlutamineFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200 ממול/ליטר (וזמנים; 100)
L-prolineNacalai Tesque29001-42
L-ThyroxineMerckT1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		LonzaPT-3001
פרפיןFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100 מ"לMedicago09-2051-100
TGF-β 3 ProteintechHZ-1090
Vetorphaleמשחת
VisiocareSAVAVET/SAVA Healthcare
β-גליצרופוספטFUJIFILM Wako Pure Chemical 048-34332

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bone RegenerationArtificial CartilageHyaluronic Acid HydrogelsCartilage DifferentiationIn Vivo Bone FormationChondrogenic DifferentiationScaffold MaterialsAngiogenesis Induction

מאמרים קשורים