מאמר שיטה

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

DOI:

10.3791/65605

⸱

28 ביולי 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necrotizing enterocolitis (NEC) היא מחלת מעיים חמורה וקטלנית שקשה לחקור בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, שנותרה מובנת לחלוטין. הפתופיזיולוגיה של NEC כוללת הפרעה בצמתים ההדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, מוות של תאי אפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ודלקת לא מווסתת. הכלים המסורתיים לחקר NEC כוללים מודלים של בעלי חיים, קווי תאים ואורגנואידים של מעיים אנושיים או עכברים. בעוד שמחקרים המשתמשים במערכות מודל אלה שיפרו את הבנת התחום של פתופיזיולוגיה של מחלות, יכולתם לשחזר את המורכבות של NEC אנושי מוגבלת. כעת פותח מודל משופר במבחנה של NEC בטכנולוגיה מיקרופלואידית, בשם NEC-on-a-chip. מודל NEC-on-a-chip מורכב ממכשיר מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם ביילוד מוקדם, בתרבית משותפת עם תאי אנדותל אנושיים ובמיקרוביום מתינוק עם NEC חמור. מודל זה הוא כלי רב ערך למחקרים מכניסטיים על הפתופיזיולוגיה של NEC ומשאב חדש לבדיקות גילוי תרופות למחלות מעיים בילוד. בכתב יד זה יסופק תיאור מפורט של מודל NEC-on-a-chip.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necrotizing enterocolitis (NEC) משפיע על פגים, עם שכיחות של עד 10% אצל אלה שנולדו במשקל < 1500 גרם1. הפתופיזיולוגיה של NEC מורכבת וכוללת נזק לאפיתל המעי, הפרעה בצמתים הדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, חוסר ויסות חיסוני ומוות תאי אפיתל 2,3. הבנתנו את המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של NEC נותרה חלקית, ולמרות עשרות שנים של מחקר, עדיין אין טיפולים ממוקדים יעילים.

חסם משמעותי לקידום מחקר ה-NEC הוא הזמינות המוגבלת והגודל הקטן של רקמת המעי הראשונית שבודדה מתינוקות אנושיים. רקמת מעי שנכרתה מתינוקות עם NEC היא לעתים קרובות נמקית ופגומה קשות, מה שמסבך מחקרים על....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטרואידים נגזרו מדגימות מעיים קטנות מפגים (שנולדו בשבוע 22 עד 36 להריון) שהתקבלו בזמן הניתוח ל- NEC או למחלות מעיים אחרות עם אטיולוגיות לא דלקתיות. כל איסוף הדגימות ועיבודן בוצעו לאחר הסכמה מדעת ואישור מוועדות הביקורת המוסדיות באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (מספרי פרוטוקול IRB 201706182 ו-201804040) ואוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל (פרוטוקול IRB מספר 21-3134).

1. בידוד וציפוי של קריפטות מהמעי הדק של היילוד האנושי כדי להקים אנטרואידים

  1. הכנת מדיה
    1. הכן את כל חומרי ההדפסה הנדרשים כמתואר בטבלה 1. ודא טכניקה אספטית משמש להכנת כל המדיה. יש לסנן, לעקר מדיה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן בטמפ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטרואידים נזרעו על המכשיר המיקרופלואידי (איור 1) וגודלו בתרבית כפי שתואר לעיל. גדילת האנטרואידים במטריצת הידרוג'ל של תרבית תאים לפני הזריעה, ולאחר מכן ההתרחבות של חד-שכבה של תאי אפיתל המעי לאחר הזריעה, נוטרו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2). חד-שכבה חד-שכבתית של תאי אפיתל במעי נוצרה ולאחר מכן התפתחה למבנה בוגר דמוי וילוס תלת-ממדי (איור 2). מכשיר מיקרופלואידי זה שנזרע עם אפיתל מעיים בילוד שמקורו אנטרואידים ו- HIMECs ידוע בשם מודל.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת NEC-on-a-chip זו היא כלי חדש רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי למדל את הפתופיזיולוגיה של NEC. פלטפורמה זו מספקת מיקרו-סביבה מורכבת הדומה יותר לסביבת המעי in vivo מאשר דגמים קודמים על ידי שילוב מערכת תרבות משותפת עם זרימה ומתיחות לומינליות רציפות. התנאים האלה מקדמים את התפתחותה של ארכיטקטורה תלת-ממדית דמוית וילוס המרופדת על-ידי אפיתל מקוטב מאוד המורכב מתתי-סוגים בוגרים של אפיתל וצמתים הדוקים (איור 2)36. בנוסף, משטח האפיתל האפי נגיש בקלות לחשיפה לגירויים ניסיו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים הקשורים לכתב יד זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה נתמך על ידי R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ו-R01HD105301 (MG) מהמכונים הלאומיים לבריאות, מענק יוזמת צ'אן צוקרברג 2022-316749 (MG), פרס קריירה מוקדמת של קרן המחקר Thrasher Research Fund (LCF), מענק חוקר קריירה מוקדמת של התפתחות ילדים של UNC (LCF) באמצעות תמיכתם הנדיבה של תורמים לאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[Leu15]-Gastrin I HumanSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/תוסף F-12Gibco12634010
B-27 של חזיר, ללא סרום (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 קורא מיקרו-פלטות רב-מצביAgilent  7131000
מותג Methacrylate (PMMA) קובטים, Semi-MicroBrandTech759085D
פתרון שחזור תאיםקורנינג354270
CFX Opus מערכות PCR בזמן אמתBio-Rad12011319
עריסת שבבאמולציהN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
צלחות באר מרובות שטופלו ב-TC,   48 באר קורנינג3548
קולגן משליה אנושיתSigma-AldrichC5533
קולגנאז, סוג I, אבקתGibco17018029
מדיום תאי אנדותל אנושי שלם עם ערכה Cell BiologicsH-1168
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטיים, 15 מ"לFisher Scientific05-539-12
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטיים, 50 מ"לFisher Scientific05-539-8
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנתInvitrogen C10283
Countess II מונה תאים אוטומטיInvitrogen 
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, מפל כחול, 3000 מגה-וואט, אניוני, ליזין לתיקוןInvitrogen  D7132צבע חדירות 
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD8418
יחידות סינון PES חד פעמיות, 0.2um aPES ממברנהפישר סיינטיפיקFB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
סרום חמורSigma-AldrichD9663
Dulbecco′ s Modified Eagle ′ s בינוני - גלוקוז גבוהSigma-AldrichD5796
Dulbecco ′ s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0Corning46-034-CI
ER-1 מגיב להפעלת פני השטחEmulateER-1Chip Activation Reagent 1
ER-2 מגיב להפעלת פני השטח לחקותמגיב להפעלת שבבER-2
פיברונקטין חלבון אנושי, פלזמהGibco33016015
Fisherbrand  צלחות פטרי עם מכסה שקוף,ג'לטין
 Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
גנטמיצין Gibco15750060
HEPES, תמיסה נוזלית 1M (238.3 מ"ג/מ"ל)קורנינג25-060-CI
Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידרט InvitrogenH3570
קולגן אנושי מסוג Iסיגמא-אולדריץ'CC050
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במעי הדק אנושיתאי ביולוגיקהH-6054
מיקרוסקופ הפוךפישר סיינטיפיק03-000-013
איזוטמפ לשימוש כללי אמבטיות מים דלוקספישר סיינטיפיקFSGPD10
ל-גלוטמין Gibco25030-081
מרק לוריא (LB) אגר, מילרסופלקוL3027
תאי L-WRN קולקציית תרבות מסוג אמריקאיCRL-3276
גורם גדילה מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף מופחתת, ללא LDEV קורנינג356231מטריקס תרבית תאים
N-2 תוסף (100x)Gibco17502048
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'1009005
NAILSTAR UV LAMPNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC  מיקרו-נפח UV-Vis ספקטרופוטומטרThermo Scientific840-274200
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'72340
מודול רכזת Orb-HM1לחקותN/A
ParaformaldehydeThermoFisher047392.9L
פניצילין-סטרפטומיצין Gibco15140122
פוספט מאגר מלח (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805
קצות פיפטות TR LTS 1000µ L S 768A/8Rainin17014966
פוד מודול ניידלחקותN/A
סרום בקר עוברי בדרגת פרימיום (FBS) (מופעל בחום) Avantor Seradigm1500-500
ערכת תמלול הפוך של QuantiTect QIAGEN205313
גורם גדילה אפידרמלי עכברי רקומביננטי (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
צלחת בדיקה ביולוגית מרובעת עם ידיות, לא מטופלת TC קורנינג431111
SsoAdvanced אוניברסלי SYBR  Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV יחידת סינון עליונה צינור צנטריפוגהסטרילית MilliporeSE1M179M6
מסנני תאים סטריליים, 70umFisher Scientific22-363-548
מזרקים סטריליים, 10 מ"לפישר סיינטיפיק14-955-453
מספריים ישרים, עדינים וחדיםMiltex  מכשיריםMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD צנטריפוגהתרמו מדעית75016052
טריטון  X-100 סיגמא-אולדריץ'T8787חומר ניקוי
TRIzol ריאגנט Invitrogen15596026מגיב מיצוי RNA
תמיסת טריפן כחולה, 0.4% (w/v) ב-PBS, pH 7.5 ו-plusmn; 0.5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), ללא פנול אדום Gibco12604013Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrichT4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 מודול תרביתלחקותN/A
שבב-S1 שבב נמתח מדמה N/A AMQAX1000 2 תמיסת ציפוי מבוססת 100 מ"מ Fisher Scientific FB0875713

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344(2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3),....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים