שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.

Abstract

אירוע מרכזי בחלוקת תאי חיידקים הוא תהליך הספטציה, שבו החלבון FtsZ הוא מרכיב המפתח. FtsZ מתפלמר ויוצר מבנה דמוי טבעת (טבעת Z) במרכז התא המשמש כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים. מיקרוסקופ ברזולוציית על במודלים חיידקיים Escherichia coli ו - Bacillus subtilis הראה כי טבעת Z אינה רציפה, בעוד מחקרי הדמיה של תאים חיים הראו כי FtsZ נע לאורך הטבעת על ידי מנגנון המכונה הליכון. כדי ללמוד את הדינמיקה של FtsZ in vivo, מיקום תא מיוחד במצב אנכי נחוץ להדמיית המבנה המלא של הטבעת במישור XY. במקרה של דימות FtsZ בציאנובקטריה רב-תאית, כגון Anabaena sp. PCC7120, שמירה על החוטים במצב אנכי היא מאתגרת בגלל גודל התאים ואורך החוטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת אימוביליזציה אנכית של חוטי Anabaena sp. PCC 7120 באמצעות נקודת התכה נמוכה agarose ומזרקים, כדי להקליט את טבעת Z במוטציה המבטאת חלבון היתוך FtsZ-sfGFP. שיטה זו היא דרך מהירה וזולה לרשום דינמיקה של חלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Introduction

חלוקת תאי חיידקים היא תהליך שבו תא אם מייצר שני תאי בת, ברוב המקרים על ידי מנגנון המכונה ביקוע בינארי. אחד האירועים המוקדמים ביותר בתהליך המחיצה הוא לוקליזציה של FtsZ באמצע התא¹. חלבון זה, שהוא הומולוגי מבחינה מבנית לטובולין², נשמר ומופץ באופן נרחב ברוב החיידקים, והפילמור שלו יוצר מבנה כיווץ המכונה טבעת Z³. טבעת זו משמשת כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים ויחד הם יוצרים מנגנון מולקולרי הנקרא דיוויזום. מספר מחקרים הראו כי טבעת Z היא דינמית מאוד וכי פרוטופילמנטים FtsZ נעים על ידי הליכון ^4,5,6. כדי לחקור את טבעת Z בניסויי קיטועי זמן, מומלץ להקליט את אתר החלוקה במישור XY לרזולוציה טובה יותר ולדגימה מהירה. על מנת להשיג זאת, יש צורך לפתח שיטות אימוביליזציה של תאים אנכיים הכוללות בדרך כלל ננו-ייצור של מלכודות תאי מיקרו-חורים והתקנים מיקרופלואידים מורכבים⁷.

ציאנובקטריה הם מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים המסווגים כגראם-שליליים על ידי המורפולוגיה התאית שלהם. עם זאת, מבחינה פילוגנטית הם קרובים יותר לחיידקים גראם-חיוביים⁸. לאורגניזמים אלה יש גנים של חלוקת תאים הנפוצים בחיידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים, אך הדיוויזום שלהם מכיל גם יסודות ייחודיים⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (להלן Anabaena sp.) הוא ציאנובקטריה נימית בעלת מישור חלוקה אחד והיא מודל לחקר חלוקת תאים בציאנובקטריה רב-תאית. בזן זה, ניתן היה לקבוע את המיקום של FtsZ באמצע התאים¹⁰. עם זאת, אין מחקרים המראים את הדינמיקה in vivo של FtsZ במודל זה. במעבדה שלנו, באמצעות הזדווגות תלת-הורית ורקומבינציה הומולוגית, השגנו מוטציה מופרדת לחלוטין של Anabaena sp. המבטאת את חלבון FtsZ המאוחה ל-sfGFP, שהחליף את הגן ftsZ האנדוגני המלא. פיתחנו שיטת אימוביליזציה מהירה ופשוטה של תאים המעדיפה את הכיוון האנכי של חוטי הזן המוטנטי לניסויים בהילוך מהיר כדי לדמיין את חלבוני החלוקה בציאנובקטריה נימה. שיטה זו אינה זקוקה להתקנים מיקרופלואידים שיכולים להיות יקרים וקשים לפיתוח. לדוגמה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לדמיין את טבעת Z במוטציה FtsZ-sfGFP באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Protocol

1. שיקולים ובחירת המודל הסלולרי

הערה: לציאנובקטריה יש אוטופלואורסצנטיות חזקה עקב נוכחות פיגמנטים פוטוסינתטיים. אות זה נמצא בחלק האדום של הספקטרום, ולכן החלבונים הפלואורסצנטיים המתאימים להדמיה בציאנובקטריה הם אלה הרחוקים מהפליטה האדומה. לדוגמה, GFP, YFP, ונוס, טורקיז ו- BFP.

1. בחר רכיב דיוויזומי הקיים בזן הציאנובקטריאלי נימה המטרה. לצורך הניסויים יש צורך לבנות מוטציה ציאנובקטריאלית נימית המבטאת את הרכיב הדיוויזום שנבחר המאוחה לחלבון פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה, מוטנט Anabaena sp. המבטא FstZ-sfGFP, כדוגמה. זן זה הושג על ידי הזדווגות תלת-הורית עם E. coli¹¹.
2. בדוק את רמת ההפרדה של המוטציה שבה ייעשה שימוש. בדוגמה, ההפרדה נקבעה על ידי הגברת PCR של גן המטרה. מוטנט FtsZ-sfGFP המשמש בפרוטוקול זה הוא זן מופרד לחלוטין החסר את הגן הפראי ftsZ.

2. תנאי גידול

1. יצירת תת-תרבית חדשה של המוטנט באמצעות תרבית של 10 מ"ל בפאזה נייחת (גדלה במשך כ-14 יום באור קבוע, ב-25 מעלות צלזיוס, עבור Anabaena sp.) והוספה ל-90 מ"ל של מדיום BG11 בתוספת אנטיביוטיקה (ספקטינומיצין וסטרפטומיצין 10 μl ml-1 עבור מוטנט FtsZ-sfGFP).
2. לגדל את תרבית התאים החדשה באור קבוע ובטמפרטורה האופטימלית עד שמגיעים לשלב המעריכי. מוטנט FtsZ-sfGFP של Anabaena sp. גדל ב 25 ° C במשך 7 ימים לפני הכנת המדגם.

3. הכנת מדגם במטריצת אגרוז

1. קח 2 מ"ל של תרבות הצמיחה הומוגנית.
2. צנטריפוגה בגודל 2,500 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. בינתיים, בצלוחית של 50 מ"ל, מחממים 30 מ"ל של 3% נקודת התכה נמוכה אגרוז בתווך נוזלי BG11. השתמשו במיקרוגל בעוצמה בינונית ובדקו את התמיסה כל 15 שניות עד להמסה מלאה. מניחים בצד להתקרר ל-37°C.
   הערה: Autoclave הפתרון של agarose כדי למנוע זיהום.
4. לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו 1.9 מ"ל של הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בנפח הנותר על ידי פיפטציה לפחות שלוש פעמים למעלה ולמטה.
5. מערבבים את התאים המרחפים מחדש עם 900 μL של תמיסת אגרוז 3% על ידי פיפטציה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים.
   הערה: תמיסת האגרוז חייבת להיות נוזלית אך לא חמה מדי כדי למנוע נזק לתאים. השלב הבא חייב להתבצע מהר ולפני שתמיסת האגרוז יוצרת ג'ל כמו עקביות =.
6. שואפים את מטריצת האגרוז במזרק 1 מ"ל בזהירות. חשוב להימנע מיצירת בועות בזמן שהדגימה נשאפת עם המזרק.
   הערה: לפני שלב זה, ודא כי קצה המזרק נחתך כדי לחסל את חור הכניסה הצר.
7. תן לתערובת הדגימה-אגרוז להתמצק על ידי הצבת המזרק במצב אופקי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
8. הסר את מטריצת agarose בזהירות באמצעות הבוכנה ולשים אותו על משטח נקי ושטוח.
9. חותכים את המדגם מוצק לפרוסות, בטווח עובי של 0.5 - 1 מ"מ, שמירה על שלמות המטריצה.
   הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, חתכו את מטריצת האגרוז באמצעות אזמל או סכיני גילוח דקים.
10. מניחים את הפרוסות זו לצד זו על כיסוי. מספר הדיסקים על coverslip יהיה תלוי בממדים שלה.
    הערה: עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר, מומלץ להשתמש בתא תא המיועד לניתוח מיקרוסקופיה (למשל, תאים מגנטיים Attofluor או Chamlide). תאים אלה מאפשרים רכישת הדגימה תוך הימנעות מהתייבשות. בדוגמה זו הדגימות מוכנות על גבי כיסויים מעוגלים (25 מ"מ) באמצעות תא Attofluor.
11. הוסף 2 מ"ל של תמיסת אגרוז 3% מומסת על הדגימה שהונחה בתא כדי למנוע התייבשות.
12. המתן עד שתמיסת האגרוז מתמצקת לחלוטין ליצירת ג'ל.

4. רכישת תמונות

1. תקנן את הפרמטרים כדי לדמיין את החלבון הפלואורסצנטי המעניין את הזן המוטנטי במיקרוסקופ קונפוקלי. ודא כי המיקרוסקופ יכול לזהות הן את autofluorescence ואת הסמן הפלואורסצנטי שנבחר.
2. דמיינו את הדגימה בקונפורמציית השדה הבהיר עם הגדלה מרבית, וחפשו חוט להט בכיוון אנכי כפי שמוצג באיור 1.
3. מצא את אתר החלוקה המעניין באמצעות סריקה ראשונית באמצעות האות האוטופלואורסצנטי לאורך מישור Z.
4. השתמש בפרמטרים של סמן החלבון הפלואורסצנטי כדי לדמיין את האות של החלבון המעניין באתר החלוקה.
5. לבצע ניסויים בהילוך מהיר בהתאם למודל הביולוגי ולחלבון המעניין. לדוגמה, במקרה הזה בוצעו ניסויים בהילוך מהיר של 10 שניות ב-50 שניות כדי לתעד את הדינמיקה של FtsZ לאורך טבעת Z ב-Anabaena sp. (איור 2).

Results

הדמיה של טבעת Z ב Anabaena sp. באמצעות שיטת immobilization אנכי
כדי ללמוד את הדינמיקה של רכיבי טבעת Z בחיידקים, יש צורך לרכוש תמונות בתאים בכיוון אנכי. במצב זה, ניתן לדמיין את טבעת Z ואת החלבונים העיקריים של divisome כדי לפקח על דינמיקה של חלבונים על ידי מיקרוסקופ time-lapse. הכנת הדגימה הקלאסית לחיידקים אינה פועלת עבור ציאנובקטריה נימה. במקרה של Anabaena sp., החוטים מכוונים במצב שאינו מאפשר לדמיין את טבעת Z. בנוסף, לא ניתן לשמור על החוטים משותקים לצורך הדמיה נכונה של חלבוני חלוקת הת...

Discussion

חקר הדינמיקה של חלבונים דיוויזומים הוא ללא ספק אתגר. בפרט, בציאנובקטריה נימה, אחד האתגרים הוא הדמיה של טבעת Z במישור האופקי, שעבורה התאים חייבים להיות בכיוון אנכי. השיטה שתיארנו כאן מאפשרת את מיקום טבעת Z במישור XY לביצוע הניתוחים השונים. זוהי השיטה הפשוטה הראשונה עבור ציאנובקטריה נימה המאפשרת הדמיה מלאה של טבעת Z.

למרות שפרוטוקול זה הוא פשוט ומהיר, יש לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך שלב הכנת הדגימה במטריצת האגרוז, שכן נקודת ההתכה הנמוכה חייבת להיות בטמפרטורה מתאימה כדי להיות נוזלית מספיק לערבוב ע...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מזרק 1 מ"ל	צ'ינגדאו אגנה טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ	-	מזרק הפלסטיק הרפואי החד פעמי עם מחט 1 מ"ל המשמש בדרך כלל לשאיבת נוזל או נוזל הזרקה, בניסוי זה הוא משמש ליניקת הדגימה והפיכתה לפילמור.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	מצלמת התא Attofluor היא מחזיק כיסוי עמיד ופרקטי המיועד לצפייה בדגימות תאים חיים במיקרוסקופים זקופים או הפוכים.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler עם 96 בארות בלוק	CORNING	THERM-1001	ה-MaxyGene II Thermal Cycler החדש הגביר את המהירות והתכונות המתקדמות, ומספק את ביצועי הפרימיום שלמדת לצפות ממוצרי המותג Axygen. תכנות גמיש ייחודי. זמני ריצה מהירים. זרימת עבודה משופרת בהשוואה למחזורי שיפוע מסורתיים. קצבי הגברה של עד 5° ג/שנייה מכסה מחומם מתכוונן מכיל רצועות, צינורות ומיקרופלטות.
משקפי כיסוי פישרברנד: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	עשוי מזכוכית בורוסיליקט אופטית משובחת, בעובי וגודל אחידים. צורה מעגלית. עמיד בפני קורוזיה.
נקודת התכה נמוכה agarose	Promega	V3841	Agarose, נקודת התכה נמוכה, דרגה אנליטית, אידיאלית ליישומים הדורשים שחזור של שברי DNA שלמים לאחר אלקטרופורזה של ג'ל.
מיקרוסקופ LSM 880 מבית Zeiss Airyscan			Zeiss Airyscan LSM 880 הוא מיקרוסקופ מוקד סריקת לייזר שיכול לרכוש תמונות מתחת למגבלת הרזולוציה (רזולוציה רוחבית ~ 120 ננומטר ורזולוציה צירית ~ 350 ננומטר). הגלאים רגישים מאוד ומאפשרים לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה במהירות גבוהה.
מיקרוצנטר ואקוט; fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	להאיץ את תהליכי הכנת הדגימה השגרתיים עד פי 17,000 וגרם עם המיקרו-צנטריפוגה הסטנדרטית שלנו, הזמינה בקירור. מיקרו-צנטריפוגות אלו מציעות פרודוקטיביות, רב-תכליתיות, בטיחות ונוחות במכשיר מעבדה קומפקטי וקל לשימוש.
מיקרוסקופ Timelapse של ניקון		ניקון-מיקרוסקופ	סריקת לייזר C2 של ניקון הוא מיקרוסקופ אידיאלי לזמן ארוך טווח, מכיוון שבזכות תא הדגירה שלו ניתן לשמור דגימות בתנאים אופטימליים במשך יותר מ-8 שעות.
סכיני גילוח דקים Schick Super Chromium	Farmazon	מק"ט: 401146	סכיני הגילוח הדקים משמשים לחיתוך מטריצת האגרוז, ומאפשרים לנו להשיג את הדיסקים עם הדגימה תוך שמירה על שלמות המטריצה.