Method Article

התקנה מהירה של מיקרו-מערך רקמות והדמיית שטח אריחים במיקרוסקופ הדמיה של קרן יונים מרובת באמצעות ממשק אריח/SED/מערך

DOI:

10.3791/65615

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University, 2Immunology Graduate Program, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דימות קרן יונים מרובת יונים (MIBI) משמש לעתים קרובות להדמיה של מיקרו-מערכים של רקמות ואזורי רקמה רציפים ומרוצפים, אך התוכנה הנוכחית להגדרת ניסויים אלה מסורבלת. ממשק האריחים/SED/מערך הוא כלי גרפי אינטואיטיבי ואינטראקטיבי שפותח כדי לפשט ולהאיץ באופן דרמטי את הגדרת הפעלת MIBI.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דימות קרן יונים מרובבת (MIBI) היא טכניקת מיקרוסקופיה מבוססת ספקטרומטריית מסות מהדור הבא, המייצרת 40+ תמונות פלקס של ביטוי חלבונים ברקמות היסטולוגיות, ומאפשרת דיסקציה מפורטת של פנוטיפים תאיים וארגון היסטו-ארכיטקטוני. צוואר בקבוק מרכזי בפעולה מתרחש כאשר משתמשים בוחרים את המיקומים הפיזיים על הרקמה להדמיה. ככל שההיקף והמורכבות של ניסויי MIBI גדלו, הממשק שסופק על ידי היצרן וכלי צד שלישי הפכו למסורבלים יותר ויותר להדמיית מיקרו-מערכים גדולים של רקמות ואזורי רקמות רעפים. לפיכך, שכבת ממשק גרפית מבוססת אינטרנט, אינטראקטיבית, מה-שאתה-רואה-הוא-מה-שאתה מקבל (WYSIWYG) - ממשק אריח/SED/מערך (TSAI) - פותחה עבור משתמשים להגדרת מיקומי הדמיה באמצעות מחוות עכבר מוכרות ואינטואיטיביות כגון גרירה ושחרור, לחיצה וגרירה וציור מצולע. נכתב על פי תקני אינטרנט שכבר מובנים בדפדפני אינטרנט מודרניים, הוא אינו דורש התקנה של תוכניות חיצוניות, הרחבות או מהדרים. ממשק זה, שמעניין את מאות משתמשי MIBI הנוכחיים, מפשט ומאיץ באופן דרמטי את ההתקנה של ריצות MIBI גדולות ומורכבות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דימות קרן יונים מרובת יונים (MIBI) היא טכניקה לצילום 40+ חלבונים בו זמנית על קטעי רקמה היסטולוגיים ברזולוציהשל עד 250 ננומטר 1,2,3. לאחר שמקטע רקמה היסטולוגי מוכתם באמצעות נוגדנים המתויגים במתכות יסוד טהורות איזוטופית, מכשיר MIBI מבצע ספקטרומטריית מסות יונים משנית כדי לכמת בו זמנית את כל האיזוטופים - ובכך לבטא את כל 40+ האנטיגנים - בנקודות בודדות ברקמה. תמונות 40+ plex המתקבלות של ביטוי חלבונים, המבוצעות על פני רשתות של מיליוני כתמים, מאפשרות לשרטט גבולות תאים ולזהות סוגי תאים ספציפיים תוך שמירה על הקשר מרחבי 1,2,3,4. טכניקה זו שימשה מאות משתמשים בכ-20 אתרים כדי לחקור את הרכב התאים, פרופילים מטבוליים ו/או ארכיטקטורה של עשרות סוגי רקמות כחלק מבדיקת התגובה החיסונית לגידולים, דלקת רקמות הנגרמת על ידי גורמים זיהומיים, נוירופתולוגיה של דמנציה וסבילות חיסונית בהריון 5,6,7,8,9, 10,11.

צוואר בקבוק מרכזי בהפעלת מכשיר MIBI הוא הגדרת שדות ראייה (FOVs) - 200 x 200 מיקרומטר2 עד 800 x 800 מיקרומטר2 אזורים של הרקמה - להדמיה. MIBI מצלם FOV אחד בכל פעם, עד 800 x 800 מיקרומטר2, ולכן הדמיה של אזורים גדולים יותר דורשת תפירת FOV מרובים יחד. הדמיה של מיקרו-מערך רקמות (לדוגמה, שמונה רקמות עגולות באיור 1A) כרוכה בהצבת FOV מרובים במרווחים זה מזה. כדי להגדיר FOVs, ממשק היצרן מספק 1) תמונת מצלמה אופטית של השקופית עם כוונת שמתאימה בערך לקואורדינטת ההדמיה שצוינה (איור 1A) ו-2) תמונה של גלאי אלקטרונים משני (SED) שמראה את האזור המדויק בקואורדינטה, לפי הדיווחים מדויק בטווח של 0.1 מיקרומטר (איור 1B). ראשית, המשתמש ממקם בערך FOV יחיד באמצעות התמונה האופטית. מכיוון שרזולוציית התמונה היא רק כ- 60 מיקרומטר לפיקסל, אם המיקום מבוטל בשני פיקסלים (2 פיקסלים x 60 מיקרומטר לפיקסל), FOV סטנדרטי של 400 מיקרומטר יושבת ב- 30%. לכן, המשתמש חייב להשתמש בתמונת SED כדי לכוונן את המיקום - רצף מייגע של תריסר צעדים הכוללים חלונות קופצים מרובים, הקלדת קואורדינטות בתיבות טקסט, דחיפה איטית של SED עם לחצני בקרת כיוון, ולעתים קרובות אפילו כתיבת קואורדינטות על נייר (איור משלים 1). יש לחזור על תהליך זה עבור כל נקודה של מיקרו-מערך רקמת ליבה (TMA) של 100+. כלים מסוימים של צד שלישי יכולים לעזור עם המיקום הגס הראשוני12. עם זאת, הם עדיין דורשים קצת ידע בתכנות, והמיקום הסופי עדיין נעשה באמצעות תהליך תריסר השלבים. כמו כן, קשה מאוד למקם רשתות של FOV סמוכות, אשר ייתפרו מאוחר יותר יחד לתמונה פנורמית מרוצפת.

לפיכך, ממשק אריח/SED/מערך (TSAI) פותח במטרה לאפשר למשתמשים למקם במהירות מספר רב של FOV באמצעות ממשק גרפי אינטואיטיבי ואינטראקטיבי. TSAI מורכב משני מרכיבים עיקריים: 1) ממשק משתמש גרפי מבוסס אינטרנט (Web UI) למיקום מהיר של נקודות TMA ואריחי רקמות, ו-2) אינטגרציות לממשק בקרת המשתמש של MIBI ליצירת תמונת SED פרושה והתאמת מיקומי FOV. אם משתמשים רק בתמונה האופטית, ניתן למקם FOV רבים באופן גס ולאחר מכן לכוונן אותם במהירות באמצעות כלי הניווט/כוונון של FOV (איור 2, TSAI, ענף שמאלי). עם זאת, אם מבוצעים אריחי SED, ניתן למקם FOV במדויק על תמונת ה-SED הפרושה ללא צורך בהתאמות נוספות במצב SED (איור 2, TSAI, ענף ימני). כלים אלה, שמעניינים את מאות משתמשי MIBI הנוכחיים, הופכים את הריצוף ואת מיקום ה-TMA לפשוטים מאוד אפילו עבור משתמשים מתחילים ומפחיתים את הגדרות ריצת ה-MIBI המורכבות ממספר שעות לכמה עשרות דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טעינת TSAI

  1. הפעל את TSAI על-ידי פתיחת https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai בדפדפן האינטרנט של מחשב בקרת המשתמש MIBI.
    1. מופע זה של TSAI מכיל קביעות מוגדרות מראש מותאמות אישית שאינן חלות על כל המכשירים. בעת השימוש בו, בנה אריחים רק מתבנית FOV(s) כפי שנוצר להלן בשלב 2.6. TSAI פועל באופן מקומי בתוך דפדפן האינטרנט, ושום נתוני תמונה, .json או שם קובץ אינם נשלחים לשרת או מאוחסנים בו.
  2. לחלופין, הגדר TSAI בכל אתר אינטרנט עם הגדרות קבועות מראש מותאמות אישית לכל מכשיר.
    1. עבור אל https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai והורד את ספריית mibi_tsai_standalone. לחלופין, הורד את קובץ הקידוד המשלים 1 .zip ופתח את התוכן לספרייה שכותרתה mibi_tsai_standalone.
    2. פתח mibi_tsai_standalone/_resources/index.js בכל עורך טקסט.
    3. במידת הצורך, ערוך את גודל ה- FOV, בחירת זמן השהייה / התזמון, גודל הרסטר, FOV JSON והגדרות מוגדרות מראש מומלצות ב- index.js כך שיתאימו להגדרות המכשיר. זה חל בעיקר על מכשירים מותאמים אישית, אך יש לבדוק זוגות בחירת זמן / תזמון ללא קשר. שמור index.js.
    4. העלה mibi_tsai_standalone לכל שרת אינטרנט הנגיש דרך האינטרנט, לדוגמה, אתר אינטרנט של מעבדה או אתר אינטרנט המתארח באוניברסיטה.
    5. פתח את mibi_tsai_standalone/index.html בדפדפן האינטרנט של מחשב בקרת המשתמש MIBI.

2. טעינת שקופית MIBI ויצירת קובץ תבנית

  1. היכנס למעקב הניסויים MIBI (ממשק אינטרנט שסופק על-ידי היצרן לניהול מטה-נתונים הקשורים לסריקה) בדפדפן האינטרנט.
  2. בכרטיסיה שקופיות , הוסף שקופית חדשה והוסף מקטע חדש (איור משלים 2A-B). בכרטיסייה משאבים , בחר או צור חלונית סמן (איור משלים 2C).
  3. בכרטיסייה מקטעים , הוסף את המקטע החדש לחלונית (איור משלים 2D).
  4. היכנס לממשק בקרת המשתמש של MIBI בדפדפן האינטרנט. טען את שקופית MIBI על-ידי לחיצה על Exchange Sample ובחירת השקופית החדשה (איור משלים 3A).
  5. צור תבנית FOV על-ידי לחיצה על הוסף FOV (איור משלים 3B) והגדרת מידות המסגרת, גודל FOV, זמן השהייה, מצב הדמיה ומזהה מקטע.
  6. יצא (הורד) את רשימת FOV לקובץ .json (איור משלים 3C). הורד את התמונה האופטית כקובץ .png (איור משלים 3D).

3. רישום מנוע אופטי בשלב התמונה

  1. פתח את ממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI בדפדפן האינטרנט. אם רישום משותף לא בוצע בעבר, תפריט הרישום האופטי אמור להיפתח באופן אוטומטי. אם זה בוצע והוא מספיק, אל תחזור על שלבים אלה.
  2. פתח את תפריט רישום משותף אופטי . לחץ על העתק קוד רישום משותף אוטומטי ללוח (איור משלים 4A).
  3. פתח את ממשק בקרת המשתמש של MIBI בדפדפן האינטרנט. הקש Ctrl+Shift+J כדי לפתוח את מסוף הדפדפן, או לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הדף ולחץ על בדוק ולאחר מכן פתח את הכרטיסיה קונסולה (איור משלים 4B).
  4. הדבק את הקוד בקונסולה והקש Enter. לחץ על הקישור שנוצר במסוף (איור משלים 4C). פעולה זו תטען את הרישום המשותף בממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI ותשמור אותו כקובץ cookie, כך שהוא יימשך ואין צורך לחזור עליו אלא אם כן יש שינוי בחומרת המכשיר.

4. סריקת SED מרוצפת

  1. טען את .png התמונה האופטית ואת קבצי .json משלב 2.6 על-ידי גרירתם ושחרורם בממשק המשתמש האינטרנטי של TSA.
  2. פתח את תפריט SED Tiler ולחץ על תיבת טקסט בשורה העליונה (איור משלים 5A).
  3. לחץ (± גרור) על התמונה האופטית כדי לבחור בפינה השמאלית העליונה של סריקת SED (איור משלים 5B).
  4. הקש על מקש D או לחץ על תיבת טקסט בשורה השנייה בתפריט SED Tiler.
  5. לחץ על (± גרור) על התמונה האופטית כדי לבחור בפינה השמאלית התחתונה עבור סריקת SED.
  6. בתפריט SED Tiler , לחץ על Copy SED Scan and Shift Correction Code to Clipboard (Supplementary Figure 5C).
  7. פתח את ממשק בקרת המשתמש של MIBI בדפדפן האינטרנט. הדבק את הקוד בקונסולה והקש Enter (איור משלים 5D).
  8. הכנס את ה- MIBI למצב SED בהגדרת QC - 300 מיקרומטר, עבור לאזור שלא יירכש, והתאם את הרווח, המיקוד והסטיגמה.
    1. התאם את הבהירות והניגודיות של תמונת SED מבלי לשנות את הרווח. הקש B כדי להגביר את הבהירות או Shift+B כדי להקטין אותה. הקש C כדי להגדיל את הניגודיות או Shift+C כדי להקטין אותה. הקש Shift+V כדי לאפס הן את הבהירות והן את הניגודיות.
  9. הקש Shift+T כדי להתחיל בסריקת SED הפרושה.
  10. בסיום, הוא אמור לשמור באופן אוטומטי קובץ .png חדש של תמונת ה-SED הפרושה (איור 3). ניתן להוסיף תווים לתחילת שם הקובץ, אך אין לשנות חלק אחר של שם הקובץ.
  11. אם אריחים מסוימים אינם ממוקדים או שנסרקו באופן לא תקין בדרך אחרת, סרוק אותם מחדש.
    1. הקש Shift+R כדי להוסיף אריח לתור הסריקה מחדש. תיפתח תיבת דו-שיח שתנחה את המשתמש עבור השורה והעמודה של האריח. המספרים צמודים לאפס, וכך נכנסים 8,0 תורים בשורה התשיעית, העמודה הראשונה.
    2. לאחר הוספת כל האריחים הרלוונטיים לתור, הקש Shift+T כדי לסרוק מחדש. בסיום, הוא אמור לשמור באופן אוטומטי קובץ .png חדש של תמונת SED הפרושה.
  12. שלב קריטי: בדוק את סריקת ה-SED הפרושה לאיתור אי-התאמות גדולות (איור 3C-D). אם קיים, פנה לתמיכה של היצרן כדי לכוונן את המנוע ואת אלומת ההדמיה או נסה לתקן תוכנה ידנית באמצעות פקדי המקלדת בשלבים 4.12.1 עד 4.12.9 (איור משלים 6A).
    1. כדי לבדוק את יישור המנוע בשלב SED, עבור לאזור בשקופית ללא רקמה. הקש Shift+5 כדי לצרוב חמישה FOV של 400 מיקרומטר בתבנית לוח דמקה (איור משלים 6B-C) או Shift+9 כדי לצרוב תבנית של 3 x 3 של FOV של 400 מיקרומטר (איור משלים 6D-E).
    2. אם עמודות FOV רחוקות מדי זו מזו, הקש 1 והגדר את הערך x f(x) לערך עשרוני שלילי, בדרך כלל בין -0.0025 ל- -0.1.
    3. אם FOV בשורה השלישית מוזז שמאלה יחסית ל- FOV בשורה הראשונה, הקש 2 והגדר את הערך x f(y) לעשרוני חיובי, בדרך כלל בין 0.0025 ל- 0.1.
    4. אם FOV של העמודה השלישית מוזז כלפי מטה ביחס ל- FOV של העמודה הראשונה, הקש 3 והגדר את הערך y f(x) לעשרוני שלילי, בדרך כלל בין -0.0025 ל- -0.1.
    5. אם שורות FOV רחוקות מדי זו מזו, הקש 4 והגדר את הערך y f(y) לערך עשרוני שלילי, בדרך כלל בין -0.0025 ל- -0.1.
    6. חזור באופן איטרטיבי על שלבים 4.12.1 עד 4.12.5 עד שלוח המשבצות ותבניות 3 x 3 יוצרים רשת ישרה בערך (איור משלים 6C, E).
    7. הקש S לשמירת תמונת .png של דוגמת המילוי עם ערכי התיקון בשם הקובץ.
    8. גרור ושחרר קובץ .png זה בממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI כדי לטעון את הערכים ולשמור אותם בקובץ ה- Cookie של הדפדפן.
    9. בצע סריקות SED פרושות כדי לבדוק את המקדמים. בהתבסס על אותם עקרונות כמו בשלבים 4.12.2 עד 4.12.5, בצע התאמות נוספות במקדמים כדי לתקן אי-התאמות בתמונות האריחים של SED.
  13. אם ה-SED המרוצף מספיק, הקש Escape. חזור לממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI.
  14. גרור ושחרר את קובץ .png SED המרוצף באריחים אל ממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI (איור משלים 5E).
  15. לחץ על הכרטיסייה SED והתאם את הזום (איור משלים 5F).
  16. כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של התמונה ו/או אפשרויות ציור, כגון עובי קו וגודל סמן, השתמש בתפריט אפשרויות השקופיות שמעל לתמונת SED.
  17. קיצורי מקשים זמינים ורובם מוצגים לצד פקדי התמונה: הקש Z כדי להגדיל את התצוגה ו- Shift+Z כדי להקטין את התצוגה. הקש B כדי להגביר את הבהירות או Shift+B כדי להקטין אותה. הקש C כדי להגדיל את החדות או Shift+C כדי להקטין אותה. הקש Shift+V כדי לאפס הן את הבהירות והן את הניגודיות. הקש L כדי להחליף תוויות מעל האריחים. הקש O כדי להחליף בין מעגלי רדיוס של 5 מ"מ המשורטטים סביב אתרי המיקוד.

5. מיקרו-מערך רקמות (TMA)

  1. אם אתם מגדירים FOV לרשת של נקודות TMA, הגדירו תחילה את דוגמת המילוי של נקודות FOV לשכפול. באריח הרלוונטי של העמודה אריחים, התאם את העמודות והשורות (איור 4A) וסמן/בטל את סימון התיבות במפה (איור 4B), וכן התאם הגדרות FOV אחרות לפי הצורך.
  2. באריח הרלוונטי, לחץ על TMA כדי לפתוח את תפריט האפשרויות של TMA (איור 4C). הגדר את מספר השורות והעמודות של כתמי TMA (איור 4D). במידת הצורך, הוסיפו קידומת למתן שם (איור 4E) וערכו את מספור השורות והעמודות הפותחות (איור 4F).
  3. בתמונת השקופית, לחץ על ארבע הפינות של TMA (איור 4G-J). לחצו וגררו את הפינות המעוגלות כדי להתאים את מיקום הכוונת כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לנקודות ה-TMA.
  4. לחץ על Build TMA מתפריט האפשרויות של TMA (איור 4K).
  5. רחף מעל כל אריח בעמודת האריחים כדי לבדוק את מיקומו. כדי להתאים, לחץ על העבר (איור 4L). לאחר מכן לחץ וגרור על תמונת השקופית או הקש על מקשי החצים של לוח המקשים.
    1. החזק את מקש Shift לחוץ תוך כדי הקשה על מקשי החצים כדי להתרחק עוד יותר. החזק את מקש Alt (Windows) או את מקש Opt (Mac) לחוץ בעת הקשה על מקשי החצים כדי לעבור מרחק קצר יותר.
    2. כאשר האפשרות העבר נבחרת, הקש T כדי לבטל את סימון תיבת הסימון לצד שם האריח, להסיר אותו מהתצוגה ולהשמיט אותו מכל קובץ .json שייווצר לאחר מכן. לחלופין, בטל את הסימון בתיבת הסימון ישירות עם העכבר (איור 4M) או הסר אותה לחלוטין על-ידי לחיצה על מחק.
    3. כשבוחרים במקש MOVE, הקישו 2, 4 או 8 כדי להגדיר את גודל FOV ל- 200 μm, 400 μm או 800 μm, בהתאמה, ומידות הרסטר ישתנו באופן יחסי כך שרזולוציית ההדמיה תישאר ללא שינוי.
    4. כאשר האפשרות העבר נבחרת, הקש A כדי לעבור לאריח הקודם או הקש D כדי לעבור לאריח הבא.
    5. כדי להתאים הגדרות אריח אחרות, לחץ על לחצן ≡ כדי להרחיב את תפריט ההגדרות אם הוא אינו גלוי.

6. שטח/אריח מצולע

  1. אם הגדרת FOV כך שיכסה אזור רציף של רקמה, התאם תחילה את הגדרות FOV לפי הצורך באריח הרלוונטי של העמודה אריחים.
  2. באריח הרלוונטי, לחץ על מצולע (איור 5A). לחץ על תמונת השקופית כדי להגדיר את הקודקודים/פינות של האזור שירוצפו באריחים (איור 5B-C). לחץ פעמיים כדי לסגור את המצולע ולכסות את האזור ב-FOV (איור 5D).
  3. גלול לתחתית העמודה אריחים ולחץ על לחצן ≡ (^ כאשר הוא מורחב, איור 5E) באריח המצולע החדש כדי לראות את מפת האריח.
  4. הפעל או כבה אריחים בודדים על-ידי לחיצה על מפת האריחים (איור 5F), או על-ידי לחיצה על Clicker (איור 5G) ולחיצה על FOV הפרושים בתמונת השקופית.
  5. כדי לבטל רכיבי FOV מרובים, לחץ על מחק ולאחר מכן לחץ וגרור על FOV הפרושים בתמונת השקופית (איור 5H).
  6. כדי להפעיל FOV מרובים, לחץ על Clicker (איור 5G) ולאחר מכן לחץ וגרור על האזורים הריקים בתמונת השקופית המכוסה על-ידי מפת האריחים.
  7. כדי להוסיף את השורות למעלה, לחץ על לחצן ▲ (איור 5I). כדי להוסיף עמודות משמאל, לחץ על הלחצן ◄ (איור 5J).
  8. כדי להתאים את מיקום האריח, לחץ על הזז (איור 5K). לאחר מכן לחץ וגרור על תמונת השקופית, הקש על מקשי החצים של המקלדת או השתמש בפקדים אחרים המתוארים בשלבים 5.5.1 עד 5.5.5.

7. ניווט FOV והתאמה

  1. אם אריחי SED אינם מיושרים או אם כוונת התמונה האופטית אינה משקפת את מיקום מנוע הבמה בפועל, התאם את מיקומי ה-FOV במצב SED בממשק בקרת המשתמש של MIBI בעזרת פקדי המקלדת הבאים.
  2. פתח את תפריט הניווט/כוונון FOV מתחת לתמונת השקופית (אופטית או SED). לחץ על העתק קוד ניווט FOV ללוח.
  3. פתח את ממשק בקרת המשתמש של MIBI בדפדפן האינטרנט. הכנס את MIBI למצב SED והתאם את הרווח, המיקוד והסטיגמה.
  4. הקש Ctrl+Shift+J כדי לפתוח את מסוף הדפדפן, או לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הדף ולחץ על בדוק ולאחר מכן פתח את הכרטיסיה קונסולה.
  5. הדבק את הקוד בקונסולה והקש Enter. הקוד ינווט באופן אוטומטי ל-FOV הראשון ולמיקום ה-FOV המדויק המוצג בתמונת SED של ממשק בקרת המשתמש MIBI.
  6. התאם את הבהירות והניגודיות של תמונת SED מבלי לשנות את הרווח. הקש B כדי להגביר את הבהירות או Shift+B כדי להקטין אותה. הקש C כדי להגדיל את הניגודיות או Shift+C כדי להקטין אותה. הקש Shift+V כדי לאפס הן את הבהירות והן את הניגודיות.
  7. כדי לכוונן את ההגדלה של SED, הקש M (200 μm ), , (400 μm), . (800 μm) או / (מרבי) מקשים.
  8. כדי להזיז את FOV, הקש על מקשי החצים של המקלדת. שמור את המיקום על-ידי הקשה על W. החזק את מקש Shift לחוץ תוך כדי הקשה על מקשי החצים כדי להתרחק עוד יותר. החזק את מקש Alt (Windows) או את מקש Opt (Mac) לחוץ בעת הקשה על מקשי החצים כדי לעבור מרחק קצר יותר. שים לב שרק R1C1 מכל אריח נתון ניתן להזזה.
  9. כדי להפעיל או לבטל FOV, הקש T. כדי לשנות את גודל ה- FOV, הקש 2 (200 מיקרומטר), 4 (400 מיקרומטר) או 8 (800 מיקרומטר). מידות הרסטר ישתנו באופן יחסי כך שרזולוציית ההדמיה תישאר זהה.
  10. לשמירת קובץ תמונה של תמונת SED ושכבת-על של כוונת, הקש S. כדי לשמור טיוטה של ההתאמות בקובץ .txt, הקש X.
  11. כאשר תרצה, הקש D כדי לעבור ל- FOV הבא, או A כדי לחזור ל- FOV הקודם. חזור על שלבים 7.6 עד 7.11 עבור כל FOVs.
  12. בסיום עם כל רכיבי FOV, הקש X או Escape. ההתאמות יישמרו בקובץ .txt ויועתקו ללוח.
  13. חזור לממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI. גרור ושחרר את קובץ .txt לממשק המשתמש האינטרנטי של TSAI או הדבק את ההתאמות בתיבת הטקסט בתפריט הניווט/התאמה של FOV.
  14. לחצו על 'התאמה ' להחלת התאמות על האריחים בעמודה 'אריחים'.

8. JSON יצירה וייבוא של קבצים

  1. מתחת לעמודה אריחים, תחת פלט, בדוק את רשימת האריחים ואת זמן הפעולה המשוער (איור משלים 7A).
  2. תחת קבוצה, בחר אפשרות עבור קיבוץ FOV (איור משלים 7B). לקיבוץ אין השפעה על קובץ .json בסדר רציף.
    1. עבור קובץ .json אקראי, קיבוץ FOV לפי אריח יסדר FOV כך שכל FOVs בתוך אריח נתון יישארו יחד, למרות שהאריחים מסודרים בסדר אקראי.
    2. עבור קובץ .json אקראי, האפשרות אל תקבץ FOV תסדר באופן אקראי FOV כך שרכיבי FOV מאריחים שונים יהיו מעורבבים.
    3. אם צוין מיקוד אוטומטי בהפעלה, FOV יקובצו באופן אוטומטי לפי אתר המיקוד האוטומטי הקרוב ביותר.
  3. תחת פיצול, בחר אפשרות לפיצול לקובצי .json מרובים (איור משלים 7C).
    1. האפשרות אל תפצל תשמור את כל ה-FOV בקובץ .json אחד בלבד.
    2. פיצול על ידי כל # FOVs יפצל FOVs על פני קבצי .json מרובים, כאשר כל קובץ מכיל את המספר שצוין של FOVs.
    3. פיצול בכל # שעות # דקות יפצל FOV על פני קבצי .json מרובים, כאשר זמן הריצה המשוער של כל קובץ הוא בערך פרק הזמן שצוין.
  4. הצג וסדר מחדש את סדר FOV בקובצי .json על-ידי פתיחת התפריט Rearrange (איור משלים 7D). כדי להזיז FOV, לחץ וגרור אותו למיקום הרצוי. ה- FOV האחרים יתארגנו מחדש באופן אינטראקטיבי סביב ה- FOV הנגרר.
  5. כדי לשמור את הקבצים .json, לחץ על כפתור(י) FOVs מתחת לתפריט סידור מחדש. .json הרצף מסדר FOV לפי אריח, לאחר מכן שורה, ואז עמודה (איור משלים 7E). .json האקראי מחלק באופן אקראי FOV בתוך הקבוצות כפי שנבחר בשלב 8.2 (איור משלים 7F).
  6. לשמירת תמונה של הרקמה בעזרת FOVs ואפשרויות התצוגה שהוחלו (תוויות אריחים, בהירות, ניגודיות וכו'), לחצו על 'שמור תמונה פרושה' (איור משלים 7G). אפשרות זו שימושית לעתים קרובות לשמירת רשומות ולשיתוף עם משתפי פעולה.
  7. חזור לממשק בקרת המשתמש של MIBI. לחץ על ייבוא FOVs ובחר בקובץ .json שנוצר. התאם את המיקוד, הסטיגמה והזרם לפי הצורך ולחץ על התחל הפעלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TSAI מספק שתי שיטות להגדרת FOV (איור 2). משתמשים רק בתמונה האופטית (איור 2, TSAI, ענף שמאלי), בדומה לשיטות קיימות אחרות. השיטה השנייה - יצירת תמונת SED פרושה - ייחודית ל-TSAI (איור 2, TSAI, ענף ימני). TSAI מצייר FOV באופן מדויק על תמונה זו, ומבטל את הצורך להשקיע שעות בדחיפת FOV למקומם במצב SED של ממשק היצרן. עם זאת, יש להגדיר כראוי את מקדמי התיקון עבור אריחי SED, אחרת מיקומי ה- FOV המתקבלים עשויים שלא להיות מדויקים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דימות קרן יונים מרובת יונים (MIBI) היא טכניקה רבת עוצמה לניתוח פנוטיפים תאיים מפורטים והיסטוארכיטקטורת רקמות 5,6,7,8,9,10,11. המאמצים החישוביים סביב MIBI התמקדו בעיקר בעיבוד הנתונים לאחר ההדמיה, אך מעט נעשה כדי לשפר את השימושיות של תוכנת המכשיר עבור יישומים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H. Piyadasa נתמך על ידי מלגת המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) (MFE-176490). ב. אוברלטון נתמך על ידי מלגת הקרן הלאומית למדע (NSF) (2020298220). צאי נתמך על ידי מלגת קרן דיימון ראניון לחקר הסרטן (DRG-118-16), המחלקה לפתולוגיה של סטנפורד, קרן אנליס גרמברג ו-NIH 1U54HL165445-01. תודות נוספות מגיעות לד"ר אייברי לאם, ד"ר דוידה פרנצ'ינה ומאקו גולדסטון על עזרתם לבדוק ולאתר באגים בתוכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מחשב MIBIIonpath
MIBIcontrol (תוכנה)Ionpath
MIBIscopeIonpathMultiplexed Ion Beam Imaging (MIBI) מיקרוסקופ
MIBIslideIonpath567001שקופית מוליכה עבור ממשק MIBI
Tile / SED / Array (TSAI) (תוכנה https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, C. C., et al. Multiplexed Ion Beam Imaging: Insights into Pathobiology. Annu Rev Pathol. 17, 403-423 (2022).
  2. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Sci Adv. 5 (10), 1-16 (2019).
  3. Elhanani, O., Keren, L., Angelo, M. High-Dimensional Tissue Profiling by Multiplexed Ion Beam Imaging. Methods Mol Biol. 2386, 147-156 (2022).
  4. Greenwald, N. F., et al. Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning. Nat Biotechnol. 40 (4), 555-565 (2022).
  5. Risom, T., et al. Transition to invasive breast cancer is associated with progressive changes in the structure and composition of tumor stroma. Cell. 185 (2), 299.e18-310.e18 (2022).
  6. McCaffrey, E. F., et al. The immunoregulatory landscape of human tuberculosis granulomas. Nat. Immunol. 23 (2), 318-329 (2022).
  7. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal–fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  8. Hartmann, F. J., et al. Single-cell metabolic profiling of human cytotoxic T cells. Nat Biotechnol. 39 (2), 186-197 (2021).
  9. Patwa, A., et al. Multiplexed imaging analysis of the tumor-immune microenvironment reveals predictors of outcome in triple-negative breast cancer. Commun Biol. 4 (1), 852(2021).
  10. Keren, L., et al. A Structured Tumor-Immune Microenvironment in Triple Negative Breast Cancer Revealed by Multiplexed Ion Beam Imaging. Cell. 174 (6), 1373.e19-1387.e19 (2018).
  11. Vijayaragavan, K., et al. Single-cell spatial proteomic imaging for human neuropathology. Acta Neuropathol. Commun. 10 (1), 158(2022).
  12. GitHub - angelolab/toffy: Scripts for interacting with and generating data from the commercial MIBIScope. (n.d.). , https://github.com/angelolab/toffy (2023).
  13. Web Hypertext Application Technology Working Group (WHATWG). (n.d.). HTML Living Standard. , from https://html.spec.whatwg.org/multipage (2023).
  14. ECMA International. (n.d.). ECMAScript 2022 Language Specification. , https://www.ecma-international.org/publications-and-standards/standards/ecma-262 (2023).
  15. World Wide Web Consortium (W3C). (n.d.). Cascading Style Sheets (CSS). , from https://www.w3.org/Style/CSS/Overview.en.html (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Ion Beam ImagingTissue MicroarrayTiled Area ImagingSED Array InterfaceProtein Expression ImagingHistologic Tissue AnalysisWeb User InterfaceOptical CoregistrationField Of ViewTMA Spot Positioning

Related Articles