כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.
מבוא
פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית 1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגןשל החולים 3,4. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה
- טיפול לדוגמה
- בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.
- הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).
- להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.
- צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופרנטנט. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
- משקעים חלבוניים
- מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולהמשיך אותו מאוחר יותר. - צנטריפוגה (10,956 × גרם<....
- מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.
לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. המשקעים החלו כאשר סופרנאטנט זה עורבב עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים). לאחר עמידה של 12 שעות, נוצר שקע כבד בתחתית הצינור. כאשר הוא הושעה מחדש עם חיץ Tris-HCl, המשקע החלבוני נעלם במהירות והתמוסס בחיץ, והופיע כנו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus14 טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות15,16. עד כה לא דווח על פרוטוקול טיהור זיקה של sFE. במחקר זה, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח בהצלחה בהתבסס על הידע של המבנה הגבישי שלו. בהשוואה לשיטות הטיהור המדווחות, שיטת טיה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197) ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 30% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| אמוניום פרסולפט | SINOPHARM | ||
| אמוניום סולפט | SINOPHARM | ||
| ארגינין-ספרוז 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| ברומוקסילנול כחול (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| חומצה הידרוכלורית | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| ליזין-ספרוז 4B | Solarbio | ליזין-אגרוז | |
| N,N,N',N'-טטרמתילאתילנדיאמין (TEMED) | מוכתם-סיגמא-אולדריץ | ||
| (10-170 kD) | ביוטיים | ||
| נתרן כלורי | סינופארם | ||
| נתרן דודציל סולפונאט (SDS) | סיגמא-אולדריץ | ||
| ' נתרן הידרוקסיד | SINOPHARM | ||
| תרומבין | מיילונביו | ||
| טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן | סולארביו | ||
| טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד | סולארביו | ||
| <חזק>ציוד | |||
| AKT מערכת טיהור חלבון GE | |||
| טהורמעקר קיטור בלחץ אנכי אוטומטי MLS-3750 | SANYO | ||
| מערכת הדמיה כימילומינסנציה | GE | ||
| משאבת זרימה קבועה BT-100 | QITE | ||
| חממת טמפרטורה קבועה | JINGHONG | ||
| צנטריפוגה מקוררת שולחנית 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG DGG-9140AD | SENXIN | ||
| הומוגנייזר זכוכית חשמלית DY89-II | SCIENTZ | ||
| איזון אנליטי אלקטרוני | DENVER | ||
| אמבט מים אלקטרו-תרמוסטטי DK-S12 | SENXIN | ||
| שייקר אופקי להסרת צבע | קיילין-בל | ||
| AF 103 | סקוטי | ||
| KQ-500E מנקה אולטרסאונד | ShuMei | ||
| בוחש מגנטי | Zhi wei | ||
| צנטריפוגה מיקרו מקוררת H1650-W | Cence | ||
| תנור מיקרוגל | Galanz | ||
| Milli-Q התייחסות | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| מד pH שולחני מדויק | |||
| מתנד מערבולת בגודל קטן | Kylin-Bell | ||
| מערכת אלקטרופורזה אנכית | ביו-רד | ||
| <חזק>חומר מתכלה | |||
| 200 ומיקרו; צינור L PCR (200 ומיקרו; L) | Axygene | ||
| (1.5 מ"ל) | |||
| (5 מ"ל) | |||
| (50 מ"ל) | |||
| (7 מ"ל) | Biosharp | ||
| (60 מ"מ) | NEST | ||
| (0.22 & מיקרו; m) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip Tip (1 מ"ל | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 ומיקרו; L) | Axygene | ||
| (200 ומיקרו; L) | של Axygene | ||
| יחידת מסנן אולטרה צנטריפוגלי TZAKZY | |||
| (4 מ"ל 3 KDa) | מגיב | ||
מקורות
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
