מבחן בטיחות האיום החברתי מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית כמדד ללמידה מותנית מרתיעה ויכולת אפליה בין איום חברתי לבטיחות, שתיהן משמשות לזיהוי פרטים רגישים ללחץ ועמידים ללחץ בתוך קבוצה אחת של עכברים זכרים מובסים חברתית כרונית.
לחץ חברתי הוא גורם מרכזי להתפתחות הפרעות נפשיות. כדי לשפר את הערך התרגומי של מחקרים פרה-קליניים, חוויית הלחץ החברתי והשפעתה ההתנהגותית על עכברים צריכה להיות דומה לבני אדם. תבוסה חברתית כרונית (CSD) משתמשת בסוג של לחץ חברתי הכולל התקפות פיזיות ואיומים חושיים כדי לגרום לתפקוד לקוי של הנפש הדומה להפרעות רגשיות אנושיות. כדי לחזק את המרכיב הפסיכו-סוציאלי של CSD, יושם פרוטוקול CSD של 10 ימים שבו התקפות פיזיות יומיות מתוקננות לשלושה פרקים של 10 שניות ואחריו שלב חושי של 24 שעות. לאחר השלב החושיהעשירי , פרוטוקול CSD מלווה בבדיקה התנהגותית מעודנת הנקראת מבחן בטיחות איום חברתי (STST). מבחני התנהגות לאחר לחץ צריכים לקבוע כיצד ובאיזו מידה השפיע גורם הלחץ החברתי על ההתנהגות. STST מאפשר לעכברים זכרים מובסים חברתית כרונית לקיים אינטראקציה עם 2 פרטים זכרים חדשים (מטרות חברתיות): מטרה חברתית אחת מהזן התוקף שבו נתקלו במהלך ימי CSD והשנייה מזן חדש. שניהם מוצגים בו זמנית בתאים שונים של זירת מבחן תלת קאמרית. המבחן מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית כדי למדוד למידה מותנית מרתיעה מוצלחת ויכולת אפליה של איום חברתי-בטיחות. התפתחות ההימנעות החברתית כלפי שני הזנים משקפת תגובה מרתיעה כללית ולפיכך מדידה של רגישות ללחץ. בינתיים, התפתחות ההימנעות החברתית כלפי הזן התוקף בלבד משקפת אפליה בין איום לבטיחות ובכך מדד לחוסן מפני לחץ. לבסוף, היעדר הימנעות חברתית כלפי הזן התוקף משקף למידה מותנית מרתיעה לקויה. הפרוטוקול נועד לחדד את המודלים העכבריים המשמשים כיום של רגישות/חוסן ללחץ על ידי הכללת קריטריונים תרגומיים, במיוחד אפליה בין איום לבטיחות והכללה של תגובה מרתיעה, כדי לסווג קבוצה אחת של בעלי חיים מובסים חברתית כרונית לתת-קבוצות עמידות ורגישות, ובסופו של דבר לקדם גישות תרגום עתידיות.
מתח מוגדר כהפרעה של הומאוסטזיס הנגרמת על ידי גירויים פיזיים או פסיכולוגיים1. לחץ הוא גורם סיכון מרכזי ידוע להתפתחות הפרעות נפשיות כגון הפרעת דחק פוסט טראומטית, דיכאון וחרדה 2,3. בפרט, לחץ חברתי נחשב גורם סיכון מרכזי להתפתחות הפרעות נפשיות הקשורות ללחץ4. סוג אחד של לחץ חברתי שזכה לחשיבות מיוחדת במחקר הוא לחץ כפיפות חברתית5. עכברים, כמו בני אדם, מסוגלים למערך עשיר של התנהגות חברתית6, מה שהופך אותם מתאימים לחקירות הקשורות ללחץ חברתי. במסגרת המעבדה, כאשר עכברים בוגרים שוכנים בקבוצה, הם מקימים מבנה חברתי הכרוך בהיווצרות דרגות7. בהתאם לכך, מודל המושבה תוכנן לחקור את ההשפעות של היררכיות חברתיות טבעיות בקבוצות מעורבות של עכברים8. במהלך השנים פותחו וריאציות של מודל המושבה כדי לנצל את לחץ הכפיפות החברתית, כולל מודלים של קבוצות חד-מיניות, מודל אי-היציבות החברתית ומודל המושבה הפולשת. בשנים האחרונות, לעומת זאת, גרסה אחת מסוימת המכונה מודל התושב-פולש הגברי הפכה פופולרית בספרות, ומפשטת את המורכבות החברתית לשני עכברים: תושב ופולש. בעל החיים המעניין, המכונה פולש, מוכנס לכלוב של מגדל גדול יותר, מבוגר יותר ופנסיונר, המכונה תושב או תוקפן. לאחר מכן התושב תוקף פיזית את הפולש כשיטת עימות, ומבסס היררכיה חברתית שבה הדייר דומיננטי והפולש כפוף. כאשר עימותים הם אירועים חד פעמיים, הם מסווגים כ”אקוטיים” (“מודל התבוסה החברתית החריפה”), בעוד שעימותים חוזרים ונשנים הנמשכים מספר ימים (בדרך כלל 10) ידועים כ”כרוניים” (“מודל התבוסה החברתית הכרונית”). במודל התבוסה החברתית הכרונית (CSD), ההתקפות הן לסירוגין ובדרך כלל מוגבלות לתקופה של 5-10 דקות9, המכונה השלב הפיזי. לאחר השלב הפיזי, הפולש והדייר מוחזקים למשך הלילה באותו כלוב, מופרדים לשניים באמצעות קיר רשת, המאפשר את כל צורות האינטראקציה למעט מגע פיזי. תצורה זו, המכונה השלב החושי, גורמת ללחץ באמצעות הופעה מתמשכת של איום במקום עימות פיזי ישיר. בשנת 2018, ואן דר קוג’י ועמיתיו הציגו טיפול בתבוסה חברתית כרונית שונה כדי להתמקד במרכיב הפסיכו-סוציאלי של המודל על ידי סטנדרטיזציה והגבלה קפדנית של השלב הפיזי10. המודל המתוקן מגביל התקפות פיזיות לשלושה פרקים של 10 שניות עם תושבים שונים, המתרחשים במרווחים של 15 דקות בין פרקים של השלב החושי. לאחר האפיזודה הפיזית השלישית, השלב החושי נמשך בן לילה. מחזור זה חוזר על עצמו במשך 10 ימים רצופים עם תושבים חדשים בכל פרק. הטיפול המותאם משפר את תוקפו התרגומי של מודל התבוסה החברתית הכרונית ככל שהנזק הפיזי של הפולש ממוזער, והשונות בתוצאות ממשכי זמן דיפרנציאליים של התקפות פיזיות מצטמצמת.
מכיוון שמודל CSD משמש לחקר מחלות הקשורות ללחץ (למשל, דיכאון, חרדה, הפרעת דחק פוסט-טראומטית), נבחרים מבדקים פוסט-התנהגותיים, כולל, אך לא רק, מבדקים התנהגותיים של תוקפנות, זיכרון ואנהדוניה. בשנים האחרונות, מבחני התנהגות פוסט-CSD בעכברים מעריכים לעתים קרובות כיצד ובאיזו מידה חברותיות מושפעת9. חברותיות מוגדרת כהעדפה מולדת של עכברים לקיים אינטראקציה חברתית במקום להימנע מקשר חברתי. מכיוון שחברותיות כפופה להשפעות לחץ, נקבעו בדיקות המעריכות אך ורק את התפתחות ההימנעות החברתית. להימנעות חברתית הנגרמת על ידי לחץ יש רלוונטיות תרגומית מכיוון שהיא מייצגת את אחד הסימפטומים ההתנהגותיים העיקריים של חרדה חברתית ודיכאון בבני אדם11. בדומה לבני אדם, לא כל העכברים מפתחים הימנעות חברתית בעקבות טיפול CSD, מה שמרמז על נוכחות של אינדיבידואליות בתגובת מתח. כהן ועמיתיו הציעו קריטריונים התנהגותיים מנותקים כגישה מבטיחה לחקר הנוירוביולוגיה של אינדיבידואליות12. בחירת בעלי חיים על בסיס התנהגות מביאה לחלוקת קבוצות, ומדגישה את הבסיס למחקרי גן-סביבה. לאחר מכן, תת-קבוצות שונות מראות לעתים קרובות העשרה ברורה של וריאנטים/שינויים גנטיים ספציפיים, אשר בתורם יכולים להיחקר בתנאים סביבתיים שונים13. בהתאם לכך, האינדיבידואליות בהתפתחות ההימנעות החברתית נוצלה כדי לחלק את הקבוצה היחידה של עכברים זכרים מובסים חברתית כרונית לשתי תת-קבוצות: רגישים ללחץ (נמנעים חברתית) ועמידים ללחץ (לא נמנעים חברתית 9,14). עם זאת, יש לשקול את הפרשנות של פנוטיפ ההימנעות החברתית בעכברים כהתנהגות לא מסתגלת או אדפטיבית בהקשר הכולל הן של הטיפול (כאן CSD) והן של הבדיקה ההתנהגותית שלאחר הטיפול. בנוסף, המבחן ההתנהגותי של הבחירה לאחר הטיפול יעריך באופן אידיאלי היבטים אחרים של חברותיות ולא רק התפתחות הימנעות חברתית. עבודתנו האחרונה חשפה את מעורבותה של למידה מותנית בהימנעות חברתית הנגרמת על ידי CSD15. באופן ספציפי, הימנעות חברתית הנגרמת על ידי CSD היא תגובה מותנית מרתיעה כלפי התכונות המאפיינות את המתח של התושבים המשמשות כגירוי מותנה לגירוי הבלתי מותנה, כלומר התקפות התושבים. יתר על כן, בתוך תת-הקבוצה הנמנעת חברתית, פרטים מסוימים יכולים להבחין בין התכונות של זן התושבים המרתיע לבין אלה של זנים חדשים בטוחים אחרים, בעוד שפרטים אחרים מראים הימנעות חברתית כללית לשני הזנים. אנו מציעים כאן מבחן התנהגותי מזוקק לאחר CSD: מבחן האיום החברתי-בטיחות (STST)15. שלא כמו מבחני אינטראקציה חברתיתאחרים 9, STST מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית כמדידה של התגובה המותנית המרתיעה הנכונה (כלומר, למידה מותנית מוצלחת) ויכולת אפליה של איום חברתי-בטיחות, שתיהן מנוצלות לזיהוי אנשים רגישים ללחץ ועמידים ללחץ בתוך קבוצה אחת של עכברים זכרים מובסים חברתית כרונית. ההערכה של אפליה בין איום חברתי לבטיחות לעומת הכללה של תגובה מרתיעה מרחיבה את הקריטריונים התרגומי המשמשים לסיווג הקבוצה היחידה של בעלי חיים מובסים חברתית כרונית לתת-קבוצות עמידות ורגישות.
כל ההליכים בוצעו בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית בנוגע לטיפול ושימוש בבעלי חיים להליכי ניסוי ואושרו על ידי הרשויות המקומיות (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). איור 1 מייצג ציר זמן סכמטי.
1. טיפול
2. מבחן לאחר הטיפול: מבחן בטיחות איום חברתי (איור 2)
3. ניקוד וניתוח
הערה: רק מבחן הטיפול שלאחר הלחץ, כלומר STST מקבל ציון ומנותח (ולא טיפול בלחץ CSD).
הפרוטוקול ההתנהגותי כאן מתאר את מבחן האיום החברתי-בטיחות, המשמש לחלוקת קבוצה אחת לטיפול לאחר CSD לשלוש תת-קבוצות שונות, המשמש כשיטה לחקור את הביולוגיה הבסיסית של רגישות וחוסן ללחץ ולבחון טיפולים פוטנציאליים. יש לשקול בזהירות את ההקשר הביולוגי ואת הפרטים הטכניים כדי להנחות תכנון ניסוי יסודי.
תנאי דיור שונים יכולים לשנות את רמות החברותיות של התוקפנות, מה שעשוי להשפיע על התוצאות המתקבלות מהבדיקה שלאחר הטיפול28,29,30. תנאים אלה כוללים דיור יחיד של כל בעלי החיים עם הגעתם ו -24 שעות לפני הבדיקה שלאחר הטיפול, כמו גם דיור יחיד של קבוצת הביקורת במהלך 10 ימי הטיפול. יתר על כן, אפקט הלחץ CSD יכול להיפגע אם קבוצת הביקורת נלחצת בטעות. זה יכול לנבוע מחשיפת קבוצת הביקורת לריחות וקולות הנגרמים מלחץ של קבוצת הטיפול במהלך 10 ימי הטיפול, כמו גם קבוצת הביקורת שהייתה עדה לטיפול31. לכן, רצוי לשמור את קבוצת הביקורת ואת קבוצת הטיפול שוכנו בחדרים שונים. יתר על כן, בשל מעורבותה של למידה מותנית15צעדים מסוימים הם קריטיים לקבלת תוצאות בדיקה לאחר הטיפול הדומות לאלה המתוארות כאן., זה כולל ביצוע הטיפול במבוגרים צעירים במשך 10 ימים וכן ביצוע הבדיקה שלאחר הטיפול 24 שעות לאחר מנוחה (ראה שלב 2.1 בפרוטוקול). למידה מותנית יכולה להיות שונה בעכברים צעירים (או מבוגרים יותר). באופן דומה, ביצוע הטיפול במשך פחות או יותר מ -10 ימים פירושו פחות או יותר התניה של החיה, בהתאמה. שינויים במשך הטיפול יכולים לגרום לגדלים שונים של תת-קבוצות. בנוסף, רצוי שבאותו ניסוי, אותו נסיין יבצע את הטיפול ואת הבדיקה שלאחריו על כל בעלי החיים או שתהיה הפרדה בין הנסיינים המבצעים את הטיפול לבין אלה המבצעים את הבדיקה שלאחר הטיפול הדומה בכל בעלי החיים. הסיבה לכך היא שהנסיין/ים מייצג חלק מההקשר הכולל של ההתניה (טיפול CSD) והבדיקה (מבחן איום חברתי-בטיחות לאחר הטיפול) עבור החיה; לכן, כל בעלי החיים באותו ניסוי צריכים להיחשף לאותו הקשר לאורך כל הניסוי. בנוסף, התנהגותם של בעלי חיים במהלך הבדיקה שלאחר הטיפול יכולה להיות מבולבלת על ידי רמזי ריח32. ניקוי עם אתנול 5% בין בעלי חיים מתקנן את רמזי הריח. עם זאת, הימנעו מניקוי בין שני השלבים של הבדיקה שלאחר הטיפול (התרגלות ובדיקות) בקרב אותו בעל חיים. הסיבה לכך היא ששלב ההרגלה נועד בחלקו להכיר לבעל החיים את הזירה, כך שבשלב הניסויים, התנהגותו של בעל החיים מונעת בעיקר על ידי הנוכחות החדשה של המטרות החברתיות החדשות. לפיכך, ניקוי בין שני השלבים יכול לפגוע ברמזי הריח המסומנים על ידי בעל החיים בשלב ההתרגלות, ולהפוך את הזירה לפחות מוכרת בשלב הבדיקה של הבדיקה שלאחר הטיפול33. יתר על כן, עדיף שיהיו ארבעה מארזי רשת לכל זירה, שניים מהם מיוחסים לשלב ההתרגלות (תמיד בשימוש ריק) ושניים לשלב הבדיקה (תמיד בשימוש עם המטרות החברתיות), על מנת לכבות את הריח השיורי הפוטנציאלי של המטרות החברתיות CD-1 ו- 129/Sv במארזי הרשת משלב הבדיקה לשלב ההרגלה. סילוק שאריות הריח במארזי הרשת הוא קריטי מכיוון שהוא יכול להשפיע על חקירת מכלאות הרשת על ידי בעל החיים בשלב ההרגלה, לשנות את תוצאות מדד האינטראקציה החברתית ובכך לחלק את קבוצת הטיפול לשלוש תת-קבוצות33. באופן דומה, מומלץ לייחס מטרות חברתיות ספציפיות לבדיקה שלאחר הטיפול ולשמור עליהן בתנאים דומים כאשר אינן בשימוש. הסיבה לכך היא שעירוב מטרה חברתית אחת בטיפולים ובבדיקות אחרות יכול להשפיע על התנהגות המטרה המתאימה במתחם הרשת במהלך הבדיקה שלאחר הטיפול. לדוגמה, שימוש במטרה החברתית CD-1 בניסויים אחרים כתושב לטיפול ב- CSD יכול לשנות את רמות התוקפנות שלו ביחס ל- 129/Sv כאשר נעשה בו שימוש במבחן בטיחות האיום החברתי לאחר הטיפול. הבדלים ברמות התוקפנות יכולים לאותת על רמזים שונים לבעל החיים המעניין במהלך הבדיקה שלאחר הטיפול, וליצור הטיה מועדפת שאינה מיוחסת ללמידה מותנית מ-10 ימי הטיפול. לכן, שני היעדים החברתיים שיש להם חוויות דומות לפני השימוש במבחן שלאחר הטיפול יכול לעזור סטנדרטיזציה של ההתנהגות ואת הרמזים של שניהם בזמן להיות במתחם הרשת. אמצעי נוסף למניעת ההשלכה של הטיה מועדפת כולל שימוש במטרות חברתיות מבוגרות וגדולות יותר מאשר בעל החיים המעניין15מאשש את הרמז העיקרי כתכונות המאפיינות את הזן, ולא את הגיל או הגודל., למטרה זו, הבדיקה שלאחר הטיפול משתמשת בזן 129/Sv כדי להשוות את הזנים CD-1 ו- C57BL6/J. לזן 129/Sv יש צבע פרווה שונה משניהם. זה יהיה מעניין לבדוק זנים שונים של צבעי פרווה שונים ולראות כיצד התוצאות בבדיקה שלאחר הטיפול מושפעות15.
תבוסה חברתית כרונית היא אחד המודלים החזקים ביותר להפרעת דחק פוסט-טראומטית, דיכאון ומחלות אחרות הקשורות ללחץ34. יש לו אטיולוגי מצוין – 35, מנבא – , מפלה, פרמקולוגי – ותוקף פנים 8,36. כאן, פרוטוקול CSD שונה בעכברים זכרים שהוצג על ידי ואן דר קוג’י ועמיתיו שמטרתו לחזק את המרכיב הפסיכו-סוציאלי של הלחץ המושרהמתואר 10. פנוטיפ ההימנעות החברתית הוא חזק, אמין וקל לבדיקה ובעל רלוונטיות אתולוגית ותוקף פנים חזק34. בניגוד למבחני אינטראקציה חברתית אחרים9, STST מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית ויכולת אפליה של איום חברתי-בטיחות16. התוצאות של STST משמשות לזיהוי תת-קבוצות רגישות ללחץ ועמידות ללחץ בתוך קבוצה אחת של עכברים מובסים חברתית כרונית, מה שעולה בקנה אחד עם הראיות בבני אדם המאפיינות אנשים עמידים עם אפליה בין איום לבטיחות ואנשים רגישים עם הכללת תגובה מרתיעה16. סיווג זה יכול להיות מלווה במניפולציות ניסיוניות כדי לעזור לפענח את הבסיס העצבי של עמידות ורגישות ללחץ באופן כללי וספציפי לאפליה בין איום לבטיחות לעומת הכללה של תגובה מרתיעה16,37. למרות עשרות שנים של מחקר ושיפורים מסוימים בטיפול, הפרעות נפשיות הקשורות ללחץ עדיין נפוצות בבני אדם. עם זאת, על ידי התמקדות בהטרוגניות בין אנשים שונים בתגובה לאותו גורם דחק, יש שינוי פרדיגמה מביצוע מחקר מוכוון מחלות בלבד לביצוע מחקר מוכוון מחלות ובריאות בו זמנית. שינוי פרדיגמה זה עשוי לסייע בפיתוח גישות מניעה38,39 חדשניות ולזהות אסטרטגיות טיפול ממוקדות משופרות.
מגבלה של המודל היא שרק גברים נחקרו. מכיוון שה-STST מבוסס על מודל CSD, שפותח על בסיס התנהגות עכברים זכרים בטבע40, הבדיקה לא הוערכה בשל התאמתו לעכברים נקבות. בדיקה תואמת עם נקבות עכברים תהיה כזו שעוקבת אחר טיפול בלחץ שנוצר על שני המינים או על נקבות בלבד. נדרשים מחקרים נוספים כדי להרחיב את הממצאים הללו שדווחו מעכברים זכרים לנקבות. יתר על כן, התוצאות הצפויות המדווחות כאן הן מעכברים בוגרים צעירים. זה יוסיף להבנתנו לדעת כיצד (אם) הממצאים משתנים על ידי שימוש בגילאים שונים. יש לציין כי מחקר שנערך לאחרונה מצא כי התנהגות הימנעות חברתית בעקבות CSD דומה בין עכברים מקבוצות גיל שונות41. באופן דומה, משתנים נוספים שיש לקחת בחשבון הם משך הטיפול, אם הוא שונה מ-10 ימים, וזמן הבדיקה ההתנהגותית, אם הוא נערך יותר מ-24 שעות לאחר מנוחה. בסך הכל, המודל משכלל באופן משמעותי את המודלים הנוכחיים של עכברים של רגישות/חוסן ללחץ ותורם לקידום גישות תרגום עתידיות.
The authors have nothing to disclose.
Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
Camera for video recording | Basler AG, Germany<br/> An der Strusbek 60-62<br/> 22926 Ahrensburg | ace Classic<br/> acA1300-60gc | If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH<br/> Fichtenstr. 123<br/> 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv | Part-No. 10504 | |
Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6,<br/> 44579 Castrop-Rauxel | 3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River:<br/> Strain name: CD-1®IGS Mouse<br/> 129S2/SvPasCrl | Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |