הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת רגישות לתרופות ספרואידיות בשורות תאי גזע של גליומה

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

2 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

מסכי רגישות לתרופות במבחנה הם כלים חשובים לגילוי שילובי תרופות אנטי-סרטניות. תאים הגדלים בכדורים מפעילים מסלולי איתות שונים ונחשבים למייצגים יותר של מודלים in vivo מאשר קווי תאים חד-שכבתיים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבדיקת תרופות במבחנה עבור קווים ספרואידים.

תקציר

מסכי רגישות לתרופות במבחנה הם כלים חשובים בגילוי טיפולים משולבים נגד סרטן. בדרך כלל, מסכי תרופות במבחנה אלה מבוצעים על תאים הגדלים בשכבה חד-שכבתית. עם זאת, מודלים דו-ממדיים (2D) אלה נחשבים פחות מדויקים בהשוואה למודלים תלת מימדיים (3D) של תאים ספרואידים; זה נכון במיוחד עבור קווי תאי גזע של גליומה. תאים הגדלים בכדורים מפעילים מסלולי איתות שונים ונחשבים למייצגים יותר של מודלים in vivo מאשר קווי תאים חד-שכבתיים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לסריקת תרופות במבחנה של קווים ספרואידים; קווי תאי גזע של עכברים וגליומה אנושית משמשים כדוגמה. פרוטוקול זה מתאר בדיקת רגישות וסינרגיה תלת מימדית לתרופה ספרואידית שניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם תרופה או שילוב תרופות גורם למוות תאי ואם שתי תרופות סינרגטיות. קווי תאי גזע של גליומה מותאמים כדי לבטא RFP. התאים מצופים בחיבור נמוך עגול היטב תחתון 96 לוחות, וכדורים מורשים להיווצר בן לילה. מתווספות תרופות, והצמיחה מנוטרת על ידי מדידת אות ה-RFP לאורך זמן באמצעות מערכת ההדמיה החיה Incucyte, מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוטמע בחממת תרבית הרקמה. ריכוז מעכב מקסימלי של חצי (IC50), מינון קטלני חציוני (LD50) וציון סינרגיה מחושבים לאחר מכן כדי להעריך רגישויות לתרופות לבד או בשילוב. האופי התלת מימדי של בדיקה זו מספק שיקוף מדויק יותר של צמיחת הגידול, התנהגותו ורגישויות לתרופות in vivo, ובכך מהווה את הבסיס למחקר פרה-קליני נוסף.

מבוא

גליובלסטומה היא ניאופלזמה הרסנית בדרגה גבוהה של המוח עם הישרדות כוללת של 5% לחמש שנים1. גליומות בדרגה גבוהה (HGG) כמו גליובלסטומה מייצגות את הגורם המוביל לתמותה הקשורה לסרטן באוכלוסיית הילדים2 והן אחד הגידולים העקשניים ביותר לטיפול גם במבוגרים3. למרות ההתקדמות המשמעותית בהבנתנו את המניעים המולקולריים של HGG, אפשרויות הטיפול נותרו מוגבלות3, מה שמדגיש את הצורך בשיטות סינון תרופות המנבאות בצורה מדויקת יותר רגישויות טיפוליות במרפאה.

תרביות תאים תלת מימדיות שימשו בעיקר למידול של התנהגות תאים רלוונטית מבחינה פיזיולוגית4. יתר על כן, ניתן לסכם את הארכיטקטורה התלת מימדית של מיקרו-סביבת הגידול במבחנה על ידי קביעת מבחני צמיחה תלת מימדיים5. גידול ספרואיד מפעיל גם מסלולי איתות שונים ולכן נחשב למייצג יותר של מודלים in vivo 6,7 בהשוואה לתרבית דו-ממדית. תאי גזע HGG לילדים וקווי תאי הגזע של גליומה NF1 של העכבר שלנו גדלים באופן טבעי כנוירוספרות, והשתמשו בקווי תאי גליומה NF1 של עכברים אלה במסך תרופות בתפוקה בינונית8. קווי הילדים המשמשים כאן נגזרו מ-HGG ילדים בחצי הכדור, קו האמצע והמוח הקטן ונרכשו ואופיינו באופן מלא על ידי רשת גידולי המוח לילדים (פרופילי מוטציות וביטוי גנים)9. קווים אלה שונו כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום גרעיני (RFP), המאפשר ניטור התפשטות והישרדות באמצעות מערכת ההדמיה החיה Incucyte. עוצמת אות ה- RFP מייצגת את מספר התאים הקיימים. ניתן להשתמש גם בפלואורופורים אחרים, כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).

כימותרפיה משולבת ללוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדות, לימפומות, ממאירויות אפיתל וסוגי סרטן רבים אחרים היא דרך יעילה למיגור גידולים ומניעת עמידות לתרופות לגורמים בודדים10,11. עם זאת, קיים מידע מוגבל על אילו חומרים לשלב כדי להשיג רגישויות טיפוליות ב-HGG, מה שמעודד שימוש במודלים ספרואידים מדויקים יותר בבדיקות סמים במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל נהלי הפרוטוקול אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים לילדים של פילדלפיה (IRB).

ציפוי תאים ספרואידים 1. 3D

  1. הכן מדיה של תאי גזע גליומה: כדי ליצור את המדיה הבסיסית, הוסף 50 מ"ל של תוסף הריבוי ו-5 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x (10,000 U/mL) למדיום הבסיסי (500 מ"ל). כדי ליצור מדיה של תאי גזע של גליומה, הוסף גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) לריכוז סופי של 20 ננוגרם/מ"ל ו-10 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה, לפי תיאור היצרן.
    הערה: ניתן להשתמש במדיה של תאי גזע גליומה למשך שבוע אחד כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. נתק תאים המבטאים RFP:
    הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בקו תאי הגזע NF1 HGG 5746 של העכבר.
    1. העבירו את כדורי הגליומה לצינור חרוטי של 15 מ"ל, וסובבו את כדורי הגליומה בצנטריפוגה (150 x גרם למשך 5 דקות). הסר את הסופרנטנט והוסף 300 מיקרוליטר של אקוטאז כדי להפריד כדורים (דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס).
    2. הוסף 1 מ"ל של מדיה של תאי גזע גליומה ושבש את הכדורים על ידי פיפטינג עדין. צנטריפוגה של התאים המנותקים למשך 5 דקות ב-150 x גרם, שואבים סופרנטנט וממיסים את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה של תאי גזע גליומה.
  3. מדוד את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים או המוציטומטר. בעת שימוש במונה תאים פלואורסצנטי, הוסף 18 מיקרוליטר של תרחיף התא ל-2 מיקרוליטר של כתם תפוז/פרופידיום יודיד. טען 12 מיקרוליטר של תרחיף זה בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים החיים/מתים הקיימים בתרחיף.
  4. לדלל את התאים לריכוז סופי של 2,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר של מדיה של תאי גזע מסוג גליומה.
    הערה: שינויים בריכוז התאים עשויים להיות תלויים בקו התא וניתן להתאים אותם בהתאם.
  5. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוצא 100 מיקרוליטר של תרחיף התא (2,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר) בכל באר של לוחית חיבור נמוכה תחתונה עגולה של 96 בארות על ידי פיפטינג הפוך.
    הערה: השתמש בלוחות חיבור נמוכים תחתונים עגולים; לוחות אלה יעוררו את היווצרות כדור גליומה בודד בכל באר. פיפטינג הפוך מונע היווצרות בועות, אשר יפריעו ללכידת התמונה של מערכת ניתוח התאים החיים.
  6. צנטריפוגה את הצלחות ב -150 x גרם למשך 5 דקות.
    הערה: צנטריפוגה היא צעד קריטי להתחלת היווצרות נוירוספירה תלת מימדית.
  7. דגירה למשך הלילה כדי לאפשר לכדור בודד להיווצר בכל באר.

2. הוספת תרופות לבדיקת סינרגיה (איור 1)

  1. ודא שכל באר בצלחת 96 הבארות מקבלת ריכוז ספציפי של שתי התרופות 1 ו-2. צור רשת שבה כל ריכוז של תרופה 1 משולב עם כל ריכוז של תרופה 2 בשכפול.
  2. בצע דילול סדרתי של שתי התרופות שעבורן תיקבע הסינרגיה (5 דילולים של תרופה 1 ו-7 דילולים של תרופה 2) באמצעות מדיה של תאי גזע של גליומה (איור 1A).
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסדרת דילול סדרתי של 50%; עם זאת, ניתן להשתמש בכל סדרת דילול.
    1. סדרת הדילול צריכה להיות מרוכזת פי 7 מהריכוז הסופי הרצוי בכל באר. לדוגמה, אם הריכוז הסופי הגבוה ביותר לתרופה 1 הוא 1 מיקרומטר, הפוך את הריכוז הראשון של סדרת הדילול לתרופה 1, 7 מיקרומטר (1 מ"ל, צינור B או I באיור 1A).
    2. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה של תאי גזע גליומה לכל צינור נוסף בסדרת הדילול (צינורות C-H ו-J-M, כפי שמוצג באיור 1).
    3. כדי ליצור את סדרת הדילול, יש לשאוב 500 מיקרוליטר מתערובת התרופה מצינור B או מצינור I ולהוסיף אותו לצינור הבא בסדרת הדילול Tube C או Tube J, בהתאמה (המכיל 500 מיקרוליטר של מדיה של תאי גזע גליומה). מערבבים היטב וחוזרים על הפעולה לצינור הבא בסדרת הדילול. בצע בקרת DMSO (צינור A) וודא שריכוז ה-DMSO זהה בכל התנאים.
      הערה: ניתן לבצע שינויים בריכוזי התרופות ובסדרות הדילול. הקפד לרשום את ריכוזי התרופה הנכונים בקובץ משלים 1 אם סדרת הדילול משתנה.
  3. לכל באר מ-96 לוחות הבאר, הוסף 20 מיקרוליטר של תרופה 1 ו-20 מיקרוליטר של תרופה 2 על ידי פיפטינג הפוך, כפי שמוצג באיור 1B, לנפח סופי של 140 מיקרוליטר לבאר; שילובי תרופות מוערכים בכפולות. אם אתה משתמש בניתוח במורד הזרם שסופק עבור IC50 ו-LD50, השתמש בפריסת התרופות כפי שמוצג באיור 1B.
    1. בבדיקה זו נמדדת גם ההשפעה של כל תרופה בפני עצמה (ללא נוכחות התרופה השנייה). הקפידו להוסיף 20 מיקרוליטר של מדיית בקרת DMSO (שפופרת A באיור 1B) לבארות התרופות הבודדות האלה כדי להביא את הנפח הסופי של כל באר ל-140 מיקרוליטר.
    2. ודא שהבארות אינן מכילות בועות, מכיוון שהדבר ישפיע על ההדמיה.
      הערה: ניתן לבצע שינויים בכרך הסופי; עם זאת, הקפד להתאים את הריכוזים בנקודה 2.2.
  4. הנח את הלוחות במצלמת החיה ועקוב אחר הצמיחה של כל כדור בכל באר באמצעות מודול הספרואיד, הגדרת כדור בודד, הדמיה הן של שדה בהיר והן של RFP בהגדלה פי 4.
  5. עקוב אחר הלוחות במשך 72 שעות, הדמיה של כל באר של הלוח במרווח זמן קבוע, בדרך כלל שעתיים.
    הערה: העלה מפת לוחית נכונה; זה יבטיח ניתוח נכון במורד הזרם (איור 1C).

3. חישוב IC50, LD50 וציון סינרגיה (איור 2 ואיור 3)

  1. נתח את עוצמת ה-RFP עבור כל באר וכל נקודת זמן באמצעות תוכנת ההדמיה החיה. פרמטרי הניתוח המשמשים מפורטים בקבצים המשלימים (קובץ משלים 2).
    הערה: ניתן להשתמש בפרמטרי ניתוח שונים לפי העדפה.
  2. ייצא את נתוני ה-RFP כ-Total Red Integrated RFP Intensity עבור כל באר, והקפד לייצא את הנתונים הגולמיים הלא מקובצים (איור 2A).
    הערה: אם משתמשים בתבנית המסופקת (קובץ משלים 1) לחישוב IC50 ו-LD50, חיוני לדבוק בנקודה 3.2
  3. קבע את הממוצע וסטיית התקן עבור כל שילוב תרופות של (1) שינוי הקיפול בהשוואה ל-DMSO בלבד (לחישוב זה, ערכי 0 שעות אינם נחוצים) ו-(2) ה-Log2 של שינוי הקיפול בהשוואה ל-0 שעות על ידי הדבקת הנתונים הגולמיים בגיליון האקסל המצורף (איור 2B וראה דוגמה בקובץ משלים 1).
  4. התאם את הריכוז המקסימלי של תרופות 1 ו-2 בגיליון האלקטרוני (איור 2B).
    הערה: הקפד להתאים את ריכוזי התרופות 1 ו-2; אחרת, יחושבו ערכי LD50 ו-IC50 שגויים.
  5. חשב ערכי IC50 באמצעות יישום תוכנה מתאים לניתוח נתונים (כאן נעשה שימוש ב-GraphPad). עבור חישוב ערך IC50, השתמש בשינוי הקיפול הממוצע ובשינוי הקיפול בסטיית התקן בהשוואה ל-DMSO שנקבע רק בשלב 3.4, והעתק את טבלאות IC50 של תרופות 1 ו-2 לתוכנת ניתוח הנתונים (Log (מעכב) לעומת תגובה מנורמלת, שיפוע משתנה) (איור 3A).
    1. השתמש רק בנתונים מבארות שאליהן נוסף קומפונד בודד לחישובי IC50. השתמש בערכי ריכוז התרופה של יומן בתוכנת ניתוח הנתונים, המחושבים אוטומטית בגיליון האלקטרוני המצורף.
  6. חשב ציון סינרגיה:
    1. השתמש בשינוי הקיפול הממוצע בהשוואה ל-DMSO רק של כל שילוב כדי לחשב את ציון הסינרגיה באמצעות חבילת תוכנה או אתר אינטרנט. לדוגמה, https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (פרמטרים: התאמת עקומת LL4, שיטת ZIP לחישוב ניקוד סינרגיה). קובץ משלים 1 מחשב אוטומטית את הערכים הדרושים ליצירת טבלת קלט הסינרגיה שניתן להעלות ל- SynergyFinder (איור 3B). דוגמה לטבלת קלט הסינרגיה מסופקת בקובץ משלים 3.
      הערה: ציון מעל 10 מציין סינרגיה, ציון אחד מתחת ל-10 מציין אנטגוניזם וערך בין -10 ל-10 מראה השפעות תוספות.
  7. חשב את ציון ה-LD50:
    1. עבור כל ריכוז של תרופה 1, חשב את ה-LD50 של תרופה 2. הקובץ המשלים מחשב אוטומטית את ערך ה-Log2 וסטיית התקן עבור כל ריכוז (איור 3C).
    2. הזן את הממוצע וסטיית התקן של שינוי קיפול Log2 בהשוואה ל-0 שעות, כמו גם את מספר השכפולים בתוכנת ניתוח הנתונים (במחקר זה, 2,) וחשב את ערך ה-LD50 וסטיית התקן LD50 על ידי קביעת הריכוז ב-1 (Log2 = -1 מייצג את ערך log2 שעבורו 50% מהאות הולך לאיבוד בהשוואה ל-0 שעות). בחישובים אלה, השתמש במודל Log (מעכב) לעומת תגובה, שיפוע משתנה 4 פרמטרים.
      הערה: תוכנת ניתוח הנתונים אינה מחשבת אוטומטית את ריכוז התרופה המתאים לערך log2 = -1; עם זאת, ניתן להוסיף ערך זה לחישובים המדווחים של תוכנת ניתוח הנתונים כמשוואה מוגדרת-משתמש (איור 3C). הקפד להשתמש בערכי ריכוז היומן בתוכנת ניתוח הנתונים, המחושבים אוטומטית בגיליון האלקטרוני המצורף. קובץ משלים 4 מציג את לוחות IC50 ו-LD50 בתוכנת GraphPad.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדוגמה, הוערכה הסינרגיה של טרמטיניב (מעכב MEK) ו-GDC-0941 (מעכב PI3K), המעכבים שני מסלולי אפקטור RAS במורד הזרם בקו תאי גזע של גליומה של עכבר 5746 (ביטוי RFP) (איור 4). איור 4A מראה את אותו כדור ב-0 שעות ו-72 שעות שטופל בשילוב של טרמטיניב ו-GDC-0941. תמונות אלה יוצאו ישירות מתוכנת ההדמיה החיה. IC50 ו-LD50 חושבו כמתואר ב-GraphPad (איור 4B,D), הסינרגיה חושבה באמצעות SynergyFinder (איור 4C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את מבחני סינון התרופות התלת-ממדיים ששימשו ביעילות להערכת פגיעויות תרופות במודלים ספרואידים של גליומה8. מערכת בדיקת ספרואידים תלת מימדית זו תוכננה במיוחד כדי לאפשר חקירה פרה-קלינית מדויקת יותר של כימותרפיה קומבינטורית עבור קווי תאי גליומה הגדלים בכדורים. עבור HGG, שיטה זו מספקת מסגרת לזיהוי נקודות תורפה פוטנציאליות לתרופות למחלה הרסנית זו. עם זאת, היישומים הפוטנציאליים של מערכת זו אינם מוגבלים לגליומה וניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להעריך טיפולים חד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לCELLTREAT229411צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן 15 מ"ל, סטריליים
96 באר צלחתS-bioMS9096UZ96 בארות צלחת חיבור נמוכה במיוחד
AccutaseSTEMCELL Technologies7922תמיסת ניתוק תאים
Acridine Orange / Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001חי / מת כתם לספירת תאים
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2Human recombinant bFGF
CellCounter Logos BiosystemsL20001LUNA-FL צנטריפוגה כפולה תאי פלואורסצנטי
Eppendorf5810Rתאי צנטריפוגה
וצלחות DMSOPierce20688ממס לתרכובות
EGFSTEMCELL טכנולוגיות78006.2EGF Eppendorf רקומביננטיים אנושיים
Costar07-200-534צינורות מיקרוצנטריפוגה
ExcelMicrosoftMicrosoft Excel
GDC-0941SelleckchemS1065תרופה 1
GraphPadGraphPadGraphPad פריזמה 9חישוב לוגו המוציטומטר IC50 ו- LD50
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוטמע בחממת תרבית הרקמה המצלמת כל באר במרווחי זמן ספציפיים.
תוכנת IncucyteSartoriusIncucyte 2022Bניתוח נתוני התפשטות
MediaSTEMCELL Technologies5702ערכת התפשטות NeuroCult (עכבר וחולדה) המכילה מדיום בסיסי ותוסף גדילה
פניצילין-סטרפטומיצין Gibco15140122אנטיביוטיקה להוסיף למדיה
TrametinibSelleckchemS2673תרופה 2
צינורות

מקורות

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סריקת תרופות על ספרואידיםתאי גזע של גליומהבדיקת רגישות לתרופותמודלים תאיים תלת-ממדייםטיפול שילוב תרופותבדיקת מוות תאימדד סינרגיהביטוי RFPדימות חיחישוב IC50

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.