Method Article

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים הנמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית. מכיוון שתאי MSC שמקורם ברקמה סומטית מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, שינויי איכות ובטיחות ביולוגית, בעשר השנים האחרונות חלה עלייה גדולה במאמצים לייצר MSCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). מאמצים קודמים ואחרונים בהתמיינות של hiPSCs ל- MSCs התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו- (2) שימוש בתרבית חד-שכבתית. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות מייצגות אלה בהפקת MSC מ- hiPSCs. כל שיטה מציגה את יתרונותיה וחסרונותיה, לרבות זמן, עלות, יכולת התפשטות תאים, ביטוי סמני MSC ויכולת התמיינות שלהם במבחנה. פרוטוקול זה מדגים כי שתי השיטות יכולות להפיק MSCs בוגרים ופונקציונליים מ- hiPSCs. שיטת החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר, ואילו שיטת EB מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים שמקורם במזודרם1. MSCs נמצאים כמעט בכל רקמות החיבור2. מאז MSCs התגלו לראשונה בשנת 1970 ובודדו בהצלחה ממח עצם בשנת 1987 על ידי Friedenstein et al.3,4,5, מגוון של רקמות סומטיות אנושיות (כולל עובריות ובוגרות) שימשו לבידוד MSCs כגון עצם, סחוס, גיד, שריר, רקמת שומן, סטרומה תומכת hematopoietic 1,2,6,7 . MSCs מפגינים יכולות שגשוג גבוהות ופלסטיות כדי ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקת hiPSCs

  1. הפשרת hiPSC
    1. הוציאו את התאים מהחנקן הנוזלי והפשירו במהירות תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את תאי ההפשרה לצינור 15 מ"ל שהוכן עם 3 מ"ל של אמצעי תחזוקה iPSC (טבלת חומרים). מערבבים בעדינות את המדיום.
    2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant, ובעדינות resuspend את התאים ב 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה iPSC עם 10 מיקרומטר Y-27632 (פיפטה התאים למעלה ולמטה 2-3 פעמים).
    3. מעבירים את תרחיף התאים לצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה בג'ל מטריצה חוץ-תאי מופחת גורם גדילה (GFR) (1:100) ו-2 מ"ל מדיום תחזוקה iPSC עם תוספת מראש של 10 מיקרומטר Y-27632 (כ-4 x 104 תאים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול (איור 1A), hiPSCs התמינו ל-MSCs באמצעות שיטות היווצרות EB ותרבית חד-שכבתית. במהלך ההתמיינות, התאים הראו מורפולוגיות מייצגות שונות (איור 1B,C).

כפי שניתן לראות באיור 1B, מושבות hiPSCs מציגות מורפולוגיה קומפקטית טיפוסית לפני התמיינות עם גבול ברור המורכב מתאים צפופים. EBs כדוריים אחידים נוצרו לאחר ניתוק hiPSCs ותרבית במשך 24 שעות על השייקר. במהלך היום הראשון עד היום השביעי ש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה נבדקו שתי שיטות מייצגות להבחנה בין hiPSCs ל-MSCs: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. שתי השיטות היו מסוגלות לגזור MSCs מ hiPSCs. MSCs שמקורם ב-hiPSC אושרו על-ידי מורפולוגיית התא .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת מאו והו, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ערכת צביעה אדומה אליזריןBeyotime  ביוטכנולוגיהC0148S
אנטי-אנושי-CD105 (PE)Biolegend323206
אנטי-אנושי-CD34 (FITC)Biolegend343503
אנטי-אנושי-CD45 (APC)Biolegend304011
אנטי-אנושי-CD73(APC)Biolegend344006
אנטי-אנושי-CD90 (FITC)Biolegend328108
חומצה אסקורביתSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
שייקר רמת פחמן דו חמצניקריסטלCO-06UC6
חרוזי פיצויBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
דקסמתזוןביוטיים  ביוטכנולוגיהST1254
DMEM/F12  בינוניServicebioG4610
סרום בקר עובריHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
ג'לטיןסיגמא-אולדריץ'G2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
אנושי IgG1 בקרת איזוטיפ APCBioLegend403505
בקרת איזוטיפ IgG1 אנושית FITCBioLegend403507
בקרת איזוטיפ IgG1 אנושי PEBioLegend403503
TGF-ובטא אנושיים; 1תא גזע78067
אנושי TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  ביוטכנולוגיהST1398
אינדומתציןSolarbioSI9020
אינסוליןביוטיים  ביוטכנולוגיהP3376
iPSC אמצעי תחזוקהSTEMCELL Technology85850
ITS תוסף מדיהBeyotime  ביוטכנולוגיהC0341-10mL
Matrigel, גורם גדילה מופחתBD Corning354230
Oli Red O ערכת צביעהBeyotime  ביוטכנולוגיהC0158S
פרוליןסולארביוP0011
נתרן פירובטThermoFisher11360-070
TGF ובטא; 3NovoproteinCJ44
ToluidineSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
חיבור נמוך במיוחד 6 בארות צלחתCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHycloneSH30265
&-glycerophosphateSolarbioG8100
ערכת צביעה כחולה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

Related Articles