מאמר שיטה

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

DOI:

10.3791/65732

⸱

7 ביולי 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול מגרורות ריאה הכוללת פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, ולאחר מכן זיהוי תאי גידול מחודשים באיברים שלישוניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות - ההתפשטות המערכתית של סרטן - היא הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. למרות שנהוג לחשוב על גרורות כתהליך חד-כיווני שבו תאים מהגידול הראשוני מפיצים ושולחים גרורות לזרעים, תאי גידול בגרורות קיימות יכולים גם להפיץ מחדשוליצור נגעים חדשים באתרים שלישוניים בתהליך המכונה "גרורות מגרורות" או "זריעת גרורות לגרורות". זריעת גרורות לגרורות עלולה להגביר את העומס הגרורתי ולפגוע באיכות חייו ובהישרדותו של החולה. לכן, הבנת התהליכים העומדים מאחורי תופעה זו חיונית לשכלול אסטרטגיות הטיפול בחולים עם סרטן גרורתי.

מעט ידוע על זריעת גרורות לגרורות, בין היתר בשל מגבלות לוגיסטיות וטכנולוגיות. מחקרים על זריעת גרורות לגרורות מסתמכים בעיקר על שיטות ריצוף, שעשויות להיות לא מעשיות עבור חוקרים החוקרים את העיתוי המדויק של אירועי זריעת גרורות לגרורות או מה מקדם או מונע אותם. זה מדגיש את היעדר מתודולוגיות המאפשרים את המחקר של זריעת גרורות לגרורות. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו - ותאר כאן - פרוטוקול כירורגי מוריני להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, המאפשר סימון ספציפי ומעקב אחר גורל של תאי גידול העוברים מהריאה לאתרים שלישוניים. למיטב ידיעתנו, זוהי השיטה היחידה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול וזריעת גרורות לגרורות מהריאות שאינה דורשת ניתוח גנומי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן1. סרטן גרורתי מתעורר כאשר תאים מהגידול הראשוני מתפשטים בכל הגוף ומתרבים לגידולים הניתנים לגילוי קליני באיברים מרוחקים 2,3.

למרות שנהוג לחשוב על גרורות כתהליך חד-כיווני שבו תאי הגידול מתפשטים מהגידול הראשוני ומאכלסים איברים מרוחקים4, עדויות קליניות וניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שקיים תהליך מורכב ורב-כיווני יותר. הוכח כי תאי גידול במחזור הדם יכולים לזרוע מחדש את הגידול הראשוני (אם הוא עדיין במקום)5,6,7,8,9, ותאי גידול ממוקדים גרורתיים קיימים יכולים לנסוע לאתרים שלישוניים וליצור נגעים חדשים 10,11,12,13 . ואכן, עדויות מניתוחים גנומיים שנערכו לאחרונה מצביעות על כך שחלק מהנגעים גרורתיים אינם נובעים מהגידול הראשוני, אלא מגרורות אחרות - תופעה המכונה "גרורות מגרורות" או "זריעת גרורות לגרורות"14,15,16. זריעת גרורות עד גרורות יכולה להנציח את תהליך המחלה גם לאחר הסרת הגידול הראשוני, להגדיל את הנטל הגרורתי ולפגוע באיכות החיים וההישרדות של החולה. לכן, הבנת התהליכים שמאחורי זריעת גרורות לגרורות חיונית לשכלול אסטרטגיות הטיפול בחולים עם מחלה גרורתית.

למרות ההשלכות הקליניות החמורות, מעט ידוע על זריעת גרורות לגרורות, בין היתר בשל מגבלות לוגיסטיות וטכנולוגיות. מחקרים בבני אדם מוגבלים על ידי מיעוט דגימות קליניות. כריתה קלינית וביופסיה של נגעים גרורתיים אינן שכיחות, כמו גם ביופסיה של איברים בריאים לכאורה, שבהם עשויים לארוב תאי גידול בודדים מופצים. משמעות הדבר היא כי מחקרים בבני אדם אפשריים בדרך כלל רק באמצעות דגימות נתיחה מאנשים שהגידולים העיקריים שלהם עדיין במקומם או שנכרתו בעבר אך עדיין זמינים לחוקרים. כאשר דגימות כאלה זמינות, יש לבצע ניתוחי שושלת של התקדמות הסרטן בשיטות ריצוף14. עם זאת, ריצוף בתפזורת של גידולים ראשוניים תואמים וגרורות אינו בעל הרגישות הדרושה למעקב מקיף אחר שושלת. לדוגמה, ריצוף בתפזורת של נגע אחד עשוי לחשוף תת-שיבוט שאינו ניתן לגילוי באף אחד מהנגעים התואמים לו. במקרה זה, לא ניתן יהיה לקבוע את מקורו של תת-שיבוט זה. ייתכן שהוא היה נוכח בגידול הראשוני או גרורות אחרות בתדירות נמוכה מגבול הגילוי, או שהוא נוצר לאחר הקולוניזציה הראשונית של הנגע הגרורתי שבו נמצא. ריצוף תא בודד מספק רגישות מוגברת, אך עלותו הגבוהה מגבילה את היישום בקנה מידה גדול של טכניקה זו. האופי הרטרוספקטיבי של מחקרים אלה פירושו גם שהם מספקים תובנה מוגבלת לגבי אירועים גרורתיים חולפים ונוף המחלה בנקודות זמן שונות.

במודלים של בעלי חיים, ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה מאפשרת כעת מיפוי פילוגנטי פרוספקטיבי ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה 17,18,19,20. טכניקות אלה משתמשות בעריכת גנום CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאים עם ברקוד מתפתח - מוטציות תורשתיות המצטברות עם הזמן. לאחר הריצוף, ניתן לעקוב אחר השושלת של כל תא בהתבסס על הפרופיל המוטציוני של הברקוד 17,18,19,20 שלו. ואכן, טכנולוגיה כזו כבר משמשת למיפוי זריעת גרורות לגרורות. במאמר שפורסם לאחרונה, Zhang et al. הראו כי תאי סרטן השד והערמונית בגרורות עצם מאדים מהעצם לזרע גרורות משניות באיברים מרובים21.

בעוד שלשיטות חדשניות אלה יש פוטנציאל גדול ליצור מפות פילוגנטיות מפורטות ברזולוציה גבוהה של התקדמות הסרטן, הן מאוד לא מעשיות עבור אלה החוקרים את העיתוי המדויק של אירועי זריעת גרורות לגרורות ומה מקדם או מונע אותם. מילוי פערי הידע הללו חיוני לשכלול ההבנה והטיפול שלנו בסרטן גרורתי, אך ניכר מחסור בטכנולוגיות שיאפשרו מחקרים כאלה. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו לאחרונה - ומציגים כאן - טכניקה חדשנית המאפשרת לנו לסמן באופן ספציפי תאים סרטניים באמצעות פוטוהמרה באתר גרורתי (הריאה) ולאחר מכן לזהות אותם מחדש באיברים שלישוניים. באמצעות טכניקה זו, הראינו לאחרונה כי תאי סרטן השד אכן מתאדים מגרורות ריאה ואיברים שלישוניים של זרעים13. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לקבוע את העיתוי של אירועי הפצה מחדש בתוך חלון צר ולכמת תאים סרטניים redisseminated, להקל על המחקר של organotropism של תאים redisseminated ומה מקדם/מונע הפצה חוזרת.

בעוד שפוטו-המרה ומערכות cre/lox מקומיות המחליפות לצמיתות חלבון פלואורסצנטי אחד בחלבון פלואורסצנטי אחר שימשו בעבר לסימון ומעקב אחר תאי הגידול 11,22,23, למיטב ידיעתנו, שום גישה לסימון מרחבי-זמני של תאי הגידול לא הותאמה למיקוד הריאה - אחד האתרים הנפוצים ביותר של גרורות בקרב גברים ונשים שאובחנו עם כל אחד מ-14 סוגי הסרטן הנפוצים ביותר 24. כל סוג תא סרטני וכל פרוטוקול ליצירת גרורות ריאה ניתן להשתמש עם ההליך שלנו, מה שהופך אותו שימושי באופן נרחב עבור חוקרי גרורות. כל התאים הסרטניים המשמשים ליצירת גרורות ריאה צריכים לבטא חלבון הניתן להמרה או להחלפת אור, וחוקרים יכולים לבחור באיזה חלבון להשתמש בהתבסס על הצרכים והמשאבים הספציפיים שלהם. במחקר זה, השתמשנו ב-6DT1 תאי סרטן שד שביטאו ביציבות את החלבון הפלואורסצנטי Dendra2 (6DT1-Dendra2) הניתן להמרה לאור ירוק-לאדום,25 המתויג להיסטון H2B. הזרקנו 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 תאים לתוך כרית שומן החלב הרביעית של נקבות עכברי Rag2-/- עכברים. גידולים ראשוניים היו מוחשיים בין 12 ל -16 ימים לאחר ההזרקה ולא נכרתו במשך הניסוי. גרורות ריאה ספונטניות התפתחו בין 19 ל -26 ימים לאחר הזרקת תאי הגידול. ניתוחי פוטוקונפורמציה בוצעו בין 26 ל -29 ימים לאחר הזרקת תאי גידול. עכברים הוקרבו עד 72 שעות לאחר הניתוח עקב עומס גרורות ריאתיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכללת אלברט איינשטיין לרפואה.

לפני הניתוח, גרורות ריאה אמורות להיווצר בעכברים באמצעות תאים סרטניים המבטאים חלבון הניתן להמרה / פוטו-המרה; פורסמו מספר פרוטוקולים ליצירת גרורות ריאה 26,27,28.

1. הכנה לניתוח

  1. הכן אזורי עבודה נפרדים להכנת עכבר (הסרת שיער ואינטובציה), ניתוח והתאוששות.
  2. לעקר את כל כלי הניתוח באוטוקלאב.
    הערה: מכיוון שטכניקה של טיפים בלבד משמשת לניתוח זה, ניתן להשתמש במעקר חרוזים חמים כדי לעקר מכשירים להליכים הבאים.
  3. הפעל את פלטפורמת הניתוח המחוממת ואפשר לה להגיע ולהתייצב ב 37-40 מעלות צלזיוס.
  4. יש להשרות הרדמה עם 5% איזופלורן, ולאחר מכן להוריד את האיזופלורן ל-3%. בצע בדיקות צביטת בוהן מעת לעת לאורך כל ההליך כדי להעריך את הלימות ההרדמה.
  5. הניחו את העכבר המורדם במצב דקוביטוס צדדי ימני. הסירו את שיער החזה/פלג הגוף השמאלי העליון (ראו איור 1A) על-ידי מריחת קרם דה-פילטורי על האזור. הרטיבו חתיכת גזה או מגבת נייר במים ונגבו את השיער ואת קרם השיער. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד להסרת כל השיער משדה הניתוח.
    הערה: אין להשאיר קרם depilatory על העכבר במשך יותר מ 20 שניות, כמו זה יכול להזיק לעור.
  6. קשר כפול ~ 3 מ"מ מעל בסיס קטטר 22 G עם תפר משי 2-0. השאירו זנבות באורך 2 אינץ'.
  7. אינטובציה העכבר עם קטטר זה כפי שתואר קודם29,30. כדי לאשר אינטובציה מוצלחת, חבר נורת ניפוח לקצה הצנתר וסחט בעדינות.
    הערה: עכברים שעברו אינטובציה בהצלחה יחוו עליית חזה דו-צדדית עם לחיצת נורה.
  8. הדקו היטב את תפר המשי 2-0 סביב חוטם העכבר באמצעות קשר כפול כדי לשמור על צנתר האינטובציה במקומו.

2. ניתוח לחשיפת הריאה

הערה: בצע את כל שלבי הניתוח (איור 1), כולל המרת אור, במכסה מנוע או בארון זרימה למינרי כדי למנוע זיהום של שדה הניתוח.

  1. שטפו ידיים עם סבון חיטוי ולבשו כפפות סטריליות חדשות.
    הערה: מכיוון שטכניקה של טיפים בלבד משמשת לניתוח זה, ניתן להשתמש גם בכפפות לא סטריליות. מומלץ לחטא כפפות לא סטריליות בחומר חיטוי על בסיס אלכוהול.
  2. להכין מינון של 0.1 מ"ג / ק"ג של buprenorphine (0.03 מ"ג / מ"ל) ולהזריק תת עורית עבור שיכוך כאבים.
    הערה: משככי כאבים מולטימודאליים, כולל חוסמי כאב מקומיים ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות, יש להשתמש בשילוב עם buprenorphine אם הם לא צפויים להפריע לביולוגיה של עניין.
  3. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי עיני העכבר כדי למנוע נזק לקרנית.
  4. הניחו את העכבר במצב דקוביטוס צדדי ימני על משטח הניתוח המחומם.
  5. חבר את מכונת ההנשמה לצנתר האינטובציה. יש להקפיד להחזיק את הצנתר יציב, שכן אפילו תנועות קלות עלולות להפריע למיקום הצנתר ולהוביל לאוורור לקוי.
  6. שימו לב לחזה יציב, מבוקר הנשמה, דו-צדדי עולה ויורד.
  7. הצמידו את הגפיים למשטח הניתוח באמצעות סרט תיוג. ייצבו את שדה הניתוח על-ידי הנחת פיסת נייר דבק נוספת לאורך גבו של העכבר ואבטחת העור הגבי והפרווה למשטח הניתוח (איור 1A).
  8. פתח את כלי הניתוח המעוקרים.
  9. החל פתרון chlorhexidine על העור של העכבר כדי לעקר את אתר הניתוח.
  10. זהה את השטח ~ 7 מ"מ משמאל לעצם החזה ו~ 7 מ"מ מעל השוליים התת-קוסטליים. הרימו את העור מעל אזור זה בעזרת מלקחיים ובצעו חתך מעגלי ~ 10 מ"מ באמצעות מספריים חדים לניתוח מיקרו, תוך הקפדה לחתוך רק את העור.
  11. הסירו את הרקמה הרכה מעל כלוב הצלעות (איור 1B). צרוב כל כלי גדול בשני הקצוות עם עט cautery.
    הערה: בנוסף לכריתת כל הרקמה הרכה הנמצאת מתחת לחתך המעגלי בקוטר 10 מ"מ בעור, הסרת רקמה רכה נוספת שאינה שרירית מההיקף מקלה על שלבים עתידיים של ההליך.
  12. ביד אחת, השתמש במלקחיים כדי להריםאת הצלע 6 או 7. עם היד השנייה, השתמשו בלהב יחיד של מספריים מנתחים זעירים קהים – בזווית מקבילה לדופן בית החזה, קצה מעוגל הפונה כלפי מטה – וחדרו בזהירות את השריר הבין-קוסטליה-6 אוה-7 כדי להיכנס לחלל בית החזה (איור 1C). סובבו בעדינות את המספריים לפי הצורך וחתכו כדי לבצע חתך ~ 10 מ"מ בחלל הבין-קוסטלי, תוך הקפדה להימנע מלגעת ברקמת הריאה ולחתוך את הצלעות.
  13. פריקה עדינה של אוויר דחוס לכיוון החתך הבין-קוסטלי כדי להגדיל את החלל בין הריאה לקיר החזה. יש לפרוק את האוויר תחילה בפרק כף היד או ביד כדי למצוא את חוזק הזרימה המתאים ולנקות את הזרבובית מכל פסולת, ולאחר מכן בפרצים קצרים בחתך כדי למנוע פגיעה בריאות.
  14. ביד אחת, השתמש במלקחיים כדי להריםאת הצלע 6 או 7. עם היד השנייה, להחזיק את retractor סגור ולהכניס אותו לתוך חתך intercostal. כוונו את להבי הריאה כך שיהיו מקבילים לדופן בית החזה, תוך הקפדה להימנע מלגעת בריאה עצמה (איור 1D).
  15. ברגע שהמחזיר נמצא במקומו, שחררו לאט את הידית, ואפשרו למושך להיפתח ולחשוף את הריאה (איור 1E). איור 2A מראה תמונות מייצגות של גרורות ריאה חשופות לפני המרת פוטו, כולל איך הן נראות לעין בלתי, ובתעלות הפלואורסצנטיות FITC (ירוקות, לא פוטומרות) ו-TRITC (אדומות, פוטו-מומרות) תוך שימוש בתאורת שדה רחב.

3. המרת פוטו גרורות ריאה

הערה: פרטים ווריאציות על השלבים הבאים ניתן למצוא בדיון.

  1. יש למרוח בעדינות 2-3 טיפות PBS סטריליות המחוממות ל-37°C על רקמת הריאה החשופה כדי למנוע התייבשות.
  2. מניחים חתיכת נייר אלומיניום סטרילי עם מגרעת קטנה מעל העכבר. מקם את המגרעת ישירות מעל רקמת הריאה החשופה וגודל אותה כך שתחשוף רק את החלק הפתוח של בית החזה וכמה מילימטרים של הרקמה הרכה והעור שמסביב כדי להבטיח המרה של הריאה החשופה בלבד.
  3. מניחים קופסה עם מגרעת מעל העכבר ורדיד אלומיניום. ודא כי המגרעת היא ישירות מעל הריאה החשופה.
  4. הניחו את מנורת המרת האור ישירות מעל המגרעת שעל הקופסה (איור 1F).
  5. הפעל את מנורת הפוטו-המרה ואפשר 6 דקות של הארה רציפה של רקמת הריאה החשופה.
    הערה: עקוב אחר הסימנים החיוניים של העכבר באמצעות תוכניות ניטור פיזיולוגיות על מכונת ההנשמה.
  6. לאחר המרת הצילום, כבה את המנורה והסר את המנורה, הקופסה ומסיכת רדיד האלומיניום מהעכבר.

4. נוהל סגירת דופן החזה

  1. חזור על שלב 2.13 כדי להפריד את הריאה מקיר החזה.
  2. אחזו בזהירות בידית המשליפה וסחטו כדי לסגור את הלהבים.
  3. תמרן את retractor סגור מתוך החלל intercostal, בזהירות כדי למנוע נגיעה ברקמת הריאה.
  4. באמצעות תפר משי 5-0, סגרו את החתך הבין-קוסטלי בעזרת תבנית תפר רציפה פשוטה המשלבת את הצלע משני צידי החתך (איור 1G). משכו את התפר בחוזקה כדי לוודא שקצוות הפצע מתאפסים ולבסס מחדש את שלמות דופן בית החזה (איור 1H). היזהר לא להדק את התפר יתר על המידה כמו זה עלול לקרוע את השרירים intercostal.
  5. אבטחו את התפר על ידי קשירת שני קצוות התפר יחד פי 4. חותכים את זנבות התפרים קרוב ככל האפשר לקשר.
  6. סגור את העור עם סיכות כירורגיות.
  7. הסר אוויר עודף מחלל בית החזה עם מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28 גרם מחוברת. אתר את תהליך הקסיפואיד באופן מישושי, והכנס את המחט ממש מתחת, מתקדם לכיוון כתף שמאל כדי להיכנס לחלל בית החזה דרך הסרעפת. למשוך בחזרה על מזרק ~ 1 מ"ל; הסר את המחט מהעכבר ופרוק את האוויר מהמזרק. חזור על תהליך זה 3-4x.
    הערה: יש להקפיד לא לנקב איברים פנימיים. יתר על כן, חשוב להשתמש מזרק 1 מ"ל ולחזור על ההליך 3-4x במקום להשתמש מזרק נפח גדול יותר ולנסות להסיר את כל האוויר בבת אחת. שימוש במזרק בנפח גדול יותר עלול לגרום לוואקום גדול מדי בחלל בית החזה ולהוביל להתנפחות ונזק לרקמת הריאה.
  8. כבה את האיזופלורן.
  9. יש להמשיך באוורור עם 100% חמצן עד שהעכבר מראה סימני התעוררות.
  10. ברגע שהעכבר מראה סימני התעוררות, נתקו את צנתר האינטובציה ממכונת ההנשמה, חתכו את התפר סביב החוטם והוצאו את העכבר.
  11. שחרר את העכבר והעבר אותו לכלוב נקי הממוקם ~ 2 מטר מתחת למנורת חום. יש לפקח עד להתאוששות מלאה. אם העכבר מראה סימנים של קשיי נשימה או חוסר ניידות, להרדים אותו עם 5% איזופלורן במשך 5 דקות, להבטיח הרדמה נאותה על ידי התבוננות באובדן רפלקסים על צביטת הבוהן, ולהרדים באמצעות נקע צוואר הרחם.
  12. ברגע שהעכבר מתעורר לחלוטין מההרדמה ומתחיל לנוע, הכינו מנה נוספת של 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין והזריקו אותו תת עורית לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
  13. לאחר הניתוח, יש לוודא שהעכברים שוכנו בנפרד. לספק אנטיביוטיקה במי השתייה (enrofloxacin, ריכוז סופי 0.4 מ"ג / מ"ל).
  14. ב-3 הימים שלאחר הניתוח יש לבדוק את העכבר פעמיים ביום לאיתור סימני מצוקה. לטיפול בכאב, יש לתת 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין (0.03 מ"ג/מ"ל) תת עורית כל 4-6 שעות. הרדימו את העכבר אם הוא מראה סימנים של זיהום, חוסר תנועה או קשיי נשימה. לאחר היום השלישי, עכברים ניתן לבדוק פעם ביום.

5. עיבוד דגימה וזיהוי תאים פוטומרים באמצעות ניקוי רקמות

  1. בין 3 ל 5 ימים (או משך הזמן הרצוי) לאחר ניתוח photoconversion, להרדים את העכבר עם 5% isoflurane, להפחית isoflurane מ 5% ל 2.5% לאחר זירוז, להבטיח הרדמה נאותה על ידי התבוננות אובדן רפלקסים על צביטת הבוהן, ולבצע זילוח transcardial מסוף עם 10 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר, ואחריו 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde מקורר ל 4 ° C כפי שתואר קודם31.
  2. לאסוף את האיברים המעניינים ולנקות אותם אופטית כפי שתואר קודם31.
  3. דמיינו את הרקמות שנוקו במיקרוסקופ בהיר כפי שתואר קודם לכן31. לחלופין, מקם את הרקמות המנוקות בצלחת תחתית זכוכית ותמונה בתעלות FITC ו- TRITC כדי להמחיש תאים ירוקים (שאינם פוטומרים) ואדומים (פוטומרים) באמצעות דיסק קונפוקלי, מסתובב או מיקרוסקופ רב-פוטונים.

6. עיבוד דגימה וזיהוי של תאים פוטומוסבים באמצעות פירוק רקמות

  1. מרדימים את העכבר עם 5% איזופלורן למשך 5 דקות, מבטיחים הרדמה נאותה על ידי התבוננות באובדן רפלקסים על צביטת הבוהן, ומקריבים באמצעות נקע צוואר הרחם 3-5 ימים לאחר הפוטו-המרה.
  2. לאסוף ולעכל את האיברים המעניינים כפי שתואר קודם13.
  3. צלחת את הרקמות מעוכלות ומניחים אותם באינקובטור לדבוק לילה כפי שתואר קודם13.
  4. למחרת, צייר את התאים המצופים בערוצי FITC ו- TRITC כדי להציג באופן חזותי תאים ירוקים (שאינם פוטומרים) ואדומים (פוטומרים) כפי שתואר קודם לכן13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבי הניתוח המתוארים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. בקיצור, העכבר מורדם, והשיער מוסר מבית החזה השמאלי. לאחר מכן העכבר מונשם ומאוורר, מה שמאפשר לעכבר לקבל חמצן בזמן שחלל בית החזה פתוח. רקמות רכות מוסרות כדי לחשוף את כלוב הצלעות, וחתך נעשה בשרירintercostal 6 או 7. מחזיר מוכנס לפרצה הבין-קוסטלית ומשוחרר כדי לפזר את הצלעות הסמוכות ולחשוף את הריאה השמאלית וכל גרורות פוטו-המרה עליה. לאחר מכן הריאה והגרורות נחשפות לאור כחול כדי לצלם את הנגעים החשופים. לאחר הפוטו-המרה, מסירים את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של תאי גידול בריאה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לסמן באופן סלקטיבי תאים סרטניים בריאה ולעקוב אחר גורלם על ידי זיהויים מחדש בכל הגוף בנקודת זמן מאוחרת יותר, מה שמקל על חקר גרורות מגרורות ריאה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לדמיין תאים פוטו-מומרים במוח, בכבד ובריאה הימנית של עכברים שעברו את הניתוח עם פוטו-המרה, מה שמצביע על כך שתאים אלה חזרו מגרורות הריאה שהומרו לאתרים שלישוניים אלה. לא מצאנו תאים אדומים באיברים של עכברים שלא עברו פוטו-המרה, מה שמצביע על כך שאוטופלואורסצנטיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לווייד קובה על עזרתו בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (S10RR029545), ורה דסמארה והילרי גוזיק ממתקן הדימות האנליטי על הכשרתן ועזרתן במיקרוסקופיה, מרכז הסרטן ע"ש איינשטיין מונטיפיורי, המכון הלאומי לסרטן (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), מרכז גרוס ליפר ביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת סר הנרי וולקום לפוסט-דוקטורט (221647/Z/20/Z), ופרס METAvivor לפיתוח קריירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0-30 V, 0-3 A ספק כוחMPJA9616 PS
12 VDC, 1.2 A ספק תקע לא מוסדרMPJA17563 PD
28 G 1 מ"ל BD מזרק אינסוליןBD329410
400 ננומטר מנורת מערך דיודות פולטות אורLedEngin Inc.897-LZPD0UA00מנורת המרת צילום, בנויה בהתאמה אישית (חלקים בודדים כלולים להלן)
5-0 תפר משי קלוע עם מחט חיתוך RB-1Ethicon, Inc.774B
9 ס"מ 2-0 עניבת משיEthicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890Rxאנטיביוטיקה המשמשת במי שתייה
BuprenorphineHospira0409-2012-32משככי כאבים
(מכלולי כבלים) 2.5 JK-ST 72 אינץ' ZIP CDMouser172-0250
תמיסת כלורהקסידיןDurvet7-45801-10258-3כלורהקסידין תמיסת חיטוי
מיכל אוויר דחוסFalconDPSJB-12
מספריים מיקרו חיתוך עדינים במיוחד 4 "ישר חד / חד 24 מ"מRoboz כירורגיRS-5912חד מיקרו חיתוך מספריים
מאיר סיבים אופטייםO.C. White CompanyFL3000בשימוש במהלך אינטובציה
עכבר ערכת קוטרי תאומיםמכשיר הרווארד726067עט קוטרי
נביטה 500CellPoint ScientificGER  5287-120Vמעקר חרוזים
Graefe מלקחייםRobozRS-5135
נוריות הספק גבוה - צבע יחיד אולטרה סגול 90 וואטעכברLZP-D0UA00
מנורת חום אינפרא אדוםBraintree ScientificHL-1
Isoflurane SOL 250 מ"ל PVLCovetrus29405
וופורייזר איזופלורןSurgiVetVCT302
מחזיק מחט ג'ייקובסון עם מנעולKalson כירורגיT1-140
סרט תיוגפישר סיינטיפיקS68702
מחזירי אור תאורת LED CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PINMouser928-C11395TM
אפליקטורים ארוכים של קצה כותנהMedline Industries MDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4 / Celeron עד 3.4GHz / מיסב כדורי / ליבת נחושת / מאוורר קירור מעבדCompUSA#S457-1023
מספריים מיקרו חיתוך 4 "ישר קהה /קהה Roboz כירורגיRS-5980מספריים מיקרו חיתוך קהה
מכונת הנשמה לעכבריםקנט סיינטיפיק PS-02PhysioSuite
Nair תחליב להסרת שיעראמזוןB001RVMR7Kקרם אפילציה
Personnet מיני מפסקRobozRS-6504מפסק
פוספט חוצץ מי מלח 1xפישר סיינטיפיק14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 lentivirus
Puralubeהנרי Schein Animal Health008897מעמד
אינטובציה לעיניים מכרסמיםBraintree ScientificRIS 100
נורת ניפוח ריאות של בעלי חיים קטניםמכשיר הרווארד72-9083
SurgiSuite פלטפורמה כירורגית רב תכליתית לעכברים, עם התחממותקנט סיינטיפיקSURGI-M02פלטפורמה כירורגית מחוממת
מובילי בדיקה 48 אינץ' עופרת בדיקה בננה - שחורעכבר565-1440-48-0
מובילי בדיקה 48 אינץ' עופרת בדיקה בננה - עכבר אדום565-1440-48-2
קטטר קנה הנשימה Exelint International2674622 G קטטר
סגירת פצעים ערכה וטרינריתClay AdamsIN015ערכת הידוק כירורגית וטרינרית
כבלים של מאלחם מערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  5. Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575(2019).
  6. Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
  7. Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
  9. Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
  10. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  11. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  12. Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100(2020).
  13. Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340(2021).
  14. Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
  15. Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
  16. Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944(2017).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804(2018).
  19. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907(2016).
  20. Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499(2017).
  21. Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
  22. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  23. Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
  24. Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
  25. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  26. Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  27. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  28. Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
  29. Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  30. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  31. Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419(2022).
  32. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  33. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  34. Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
  35. Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
  36. Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
  37. Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
  38. Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
  39. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
  40. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
  41. Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
  42. Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
  43. Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154(2020).
  44. Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Dendra2

מאמרים קשורים