הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

4.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65774

⸱

20 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  , 
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

תקציר

רשת המיקרוטובולים היא מרכיב חיוני במערכת העצבים. מוטציות בחלבוני בקרה רבים של מיקרוטובולים קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירולוגיות, כגון חלבון טאו הקשור למיקרוטובולים למחלות נוירודגנרטיביות, חלבון ניתוק מיקרוטובולים ספסטין וקטנין 60 גורמים לשיתוק ספסטי תורשתי ולהפרעות נוירו-התפתחותיות, בהתאמה. זיהוי רשתות מיקרוטובולים בנוירונים הוא יתרון להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות. עם זאת, הגודל הקטן של תאי עצב והסידור הצפוף של צרורות מיקרוטובולים אקסונליים הופכים את הדמיה של רשתות המיקרוטובולים למאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה לדיסקציה של הצומת העצבית-שרירית של הזחל ותאי שריר, כמו גם צביעה חיסונית של α-טובולין וחלבון Futsch הקשור למיקרוטובול כדי לדמיין רשתות מיקרוטובולים בדרוזופילה מלנוגסטר. הצומת העצבית-שרירית מאפשרת לנו לצפות הן במיקרוטובולים קדם-סינפטיים והן לאחר סינפטיים, והגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובולים. כאן, על ידי מוטציה וביטוי יתר של קטנין 60 בדרוזופילה מלנוגסטר, ולאחר מכן בחינת רשתות המיקרוטובולים בצומת העצבית-שרירית ובתאי השריר, אנו חושפים במדויק את תפקיד הבקרה של קטנין 60 בהתפתחות עצבית. לכן, בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

מבוא

מיקרוטובולים (MTs), כאחד המרכיבים המבניים של השלד הציטו-שלד, ממלאים תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל חלוקת תאים, גדילה ותנועתיות של תאים, הובלה תוך-תאית ושמירה על צורת התא. דינמיקה ותפקוד של מיקרוטובולים מווסתים על ידי אינטראקציות עם חלבונים אחרים, כגון MAP1, MAP2, טאו, קטנין וקינסין 1,2,3,4,5.

בנוירונים, מיקרוטובולים חיוניים להתפתחות ותחזוקה של אקסונים ודנדריטים. הפרעות במיקרוטובולים מובילות לתפקוד לקוי ואפילו למוות של נוירונים. לדוגמה, במוחם של חולי אלצהיימר, זרחן יתר של חלבון טאו מפחית את יציבות רשת המיקרוטובולים, וגורם לאי סדירות נוירולוגית6. לפיכך, בחינת רשתות מיקרוטובולים תתרום להבנת ההתפתחות העצבית והפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות.

הצומת העצבית-שרירית (NMJ) היא סינפסה היקפית הנוצרת בין מסוף אקסון נוירון מוטורי לבין סיב שריר, שהיא מערכת מודל מצוינת ורבת עוצמה לחקר המבנה והפונקציות הסינפטיות7. פוטש הוא חלבון בדרוזופילה שהוא הומולוגי לחלבון קושר המיקרוטובולים MAP1B שנמצא ביונקים8. הוא מתבטא רק בתאי עצב וממלא תפקיד בהתפתחות הכפתורים הסינפטיים 8,9 של NMJ. בצרורות נימה מסוג פראי שרצים לאורך מרכז תהליכי NMJ מדמיינים על ידי הכתמה חיסונית עם אנטי-פוטש. כאשר מגיעים לקצה של NMJ, צרור זה יש את היכולת או ליצור לולאה המורכבת microtubules או לאבד את המבנה נימה שלה, וכתוצאה מכך מראה מפוזר ניקוב10. לולאות מיקרוטובולים קשורות לקונוסי גדילה מושהים, מה שמרמז על כך שמערך המיקרוטובולים יציב11. לכן, אנו יכולים לקבוע בעקיפין את התפתחות המיקרוטובול היציב ב- NMJ על ידי צביעת פוטש. הגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובול. הגורמים המשפיעים על יציבות רשת המיקרוטובולים ניתן למצוא על ידי ניתוח הצפיפות והצורה של מיקרוטובולים. במקביל, ניתן להצליב את מצב רשת המיקרוטובולים של תאי שריר עם התוצאה של NMJ כדי לקבל מסקנות מקיפות יותר.

פרוטוקולים רבים שימשו לחקר הרשת והדינמיקה של מיקרוטובולים. עם זאת, מחקרים אלה התמקדו לעתים קרובות במחקרי מבחנה 12,13,14,15,16. לחלופין, כמה ניסויים in vivo השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לזהות את שלד הציטו-שלד17. על פי הקישור הספציפי של נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית או צבעים כימיים לחלבונים או לדנ"א, השיטות המוצגות כאן מאפשרות זיהוי של רשתות מיקרוטובולים ב- NMJ ברמה של נוירונים בודדים in vivo, עם תוצאות שאומתו על ידי תצפיות בתאי שריר. פרוטוקול זה הוא פשוט, יציב וניתן לחזרה כאשר הוא משולב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה הזמינים ב- Drosophila melanogaster, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות פנוטיפיות ובדיקות גנטיות לתפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דיסקציה של זחלים

הערה: תמיסת הניתוח תמיסת מלח דמוית המולימפה (HL3.1)18 ותמיסת הקיבוע 4% פרפורמלדהיד (PFA)19,20 משמשים בטמפרטורת החדר מכיוון שהמיקרוטובולים מתפרקים כאשר הטמפרטורה נמוכה מדי.

  1. בחר זחל נודד 3rd instar עם מלקחיים קהים ארוכים. שטפו אותו עם HL3.1 והניחו אותו על צלחת הדיסקציה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
    הערה: זחל נודד 3rd instar מזוהה על ידי spiracle קדמי מסועף וזוחל סביב הצינור בערך 96 שעות (25 ° C)21.
  2. מקמו את הזחל עם הצד הגבי או הגחוני כלפי מעלה. זהה את הצד הגבי על ידי שתי קנה הנשימה הארוך ואת הגחון על ידי חגורות הדנטיקולה הבטן.
    1. בהתאם לרקמה להתבונן, לבחור דיסקציה גבית או גחון. זה יאפשר תצוגה מדויקת ומפורטת יותר של תחום העניין הספציפי. עבור NMJ ותצפית תאי שריר, חתכו את אזורי הזחל, הגב והגחון, בהתאמה.
  3. נעצו את ווי הפה ואת הזנב. כוונן את הפינים כדי לשמור על הזחל במצב מורחב. הוסיפו טיפה של HL3.1 לזחל כדי למנוע ממנו להתייבש.
    הערה: Ca2+ -free HL 3.1 ניתן להשתמש כדי למזער את התכווצות השרירים במהלך דיסקציה.
  4. השתמש במספריים המנתחים כדי לבצע חתך רוחבי קטן קרוב לקצה האחורי, אך אל תחתוך את הקצה האחורי. לאחר מכן חותכים לאורך קו האמצע הגחוני לכיוון הקצה הקדמי.
  5. הכניסו ארבע סיכות חרקים בארבע פינות הזחל. התאימו מחדש את סיכות החרקים כך שהזחל יימתח באופן מקסימלי לכל הכיוונים.
  6. השתמש במלקחיים כדי להסיר איברים פנימיים מבלי לפגוע בשרירים.

2. קיבעון

  1. הוסף 100 μL של PFA (4%) כדי לטבול פגרים במשך 40 דקות כאשר הפגרים עדיין נעוצים על צלחת הניתוח.
    אזהרה: אמצעי הגנה יעילים ננקטים כדי למנוע מגע ישיר עם העור או שאיפה, שכן PFA מהווה סכנה.
  2. פרקו את הפינים והעבירו את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל. יש לשטוף את PFA במי מלח חוצצים פוספט 1x המכיל 0.2% Triton X-100 (0.2% PBST) כדי למלא צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל למשך 10 דקות על שייקר הסרת הצבע במהירות 15 סל"ד. חזור על תהליך הכביסה 5x.

3. אימונוציטוכימיה

  1. יש לטבול את הפגרים בחומר חוסם (סרום עיזים 5% ב-0.2% PBST) ולחסום למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הסר את החומר החוסם והחלף אותו ב- 200 μL של הנוגדן הראשוני (למשל, אנטי α-טובולין, 1:1000; אנטי פוטש, 1:50) מדולל עם 0.2% PBST ב 4 ° C למשך הלילה. לדמיין microtubules שריר על ידי immunostaining עם חד שבטי אנטי α-tubulin. Anti-Futsch יכול לשקף בעקיפין את המורפולוגיה microtubule ב NMJ.
  3. לאחר הדגירה של הנוגדן הראשוני, יש לשטוף את הזחלים עם 0.2% PBST למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 5x.
  4. לדגור על הזחלים עם 200 μL של נוגדן משני (למשל, עז נגד עכבר-488, 1:1000) מדולל עם 0.2% PBST בטמפרטורת החדר במשך 1.5 שעות בחושך.
  5. לאחר מכן, הוסיפו צבע גרעיני כגון TO-PRO(R) 3 יודיד (T3605) בריכוז של 1:1000 לתוך צינור הדגירה למשך 30 דקות בעת צביעת המיקרוטובולים בחושך20,22.
  6. יש לשטוף את הנוגדן המשני ואת הצבע הגרעיני עם 0.2% PBST למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 5 פעמים בחושך.

4. הרכבה

  1. הניחו את פגר הזחל ב-0.2% PBST על מגלשת זכוכית והתאימו אותו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. ודא שהמשטח הפנימי של פגר הזחל פונה כלפי מעלה וכל פגרי הזחל מסודרים כרצונך.
  2. יש לספוג את עודפי תמיסת PBST בעזרת מגבון ולהוסיף בעדינות טיפה של אמצעי הרכבה נגד דהייה.
  3. הניחו פתק כיסוי על המגלשה כדי לכסות את הזחלים המנותחים לאט ובעדינות כדי למנוע בועות.
  4. יש למרוח לק סביב הכיסוי. מקם את המגלשה בחלל החשוך כדי להפחית את הנחתת הפלואורסצנט.

5. רכישת תמונות

  1. כדי לקבל את התמונות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, בחר את מטרת טבילת השמן 60x (צמצם מספרי 1.42) או דומה, והתאם את עוצמת הלייזר ואורך הגל בהתבסס על הניסוי.
  2. כדי לזהות את ה-NMJ, צלמו תמונות בשריר 4 במקטע A3 (כפי שמוצג במיקום באיור 1F). בחר מדפסת לייזר של 488 ננומטר כדי להפעיל את α-tubulin או Futsch ו- 543 ננומטר כדי להפעיל את מסלול ההדמיה של HRP. התאימו את הפרמטרים לגודל מסגרת של 800 פיקסלים x 800 פיקסלים, זום דיגיטלי של 2.0 ומרווח הדמיה של 0.8 מיקרומטר ב-NMJ (איור 2).
  3. כדי לזהות את המיקרוטובולים בשריר, צלמו תמונות של שריר 2 במקטע A3-A5 (כפי שמוצג במיקום באיור 1G), מאחר שיש לו פחות ענפים בקנה הנשימה. בחר לייזר 488 ננומטר להפעלת α-טובולין ולייזר 635 ננומטר להפעלת מסלול ההדמיה T3605. התאימו את הפרמטרים לגודל מסגרת של 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים, זום דיגיטלי של 3.0 ומרווח הדמיה של 0.4 מיקרומטר בתאי שריר (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדגמנו הליך שלב אחר שלב להדמיית רשת המיקרוטובולים הן בצמתים עצביים-שריריים (NMJs) והן בתאי שריר. לאחר דיסקציה בהתאם לתרשים הסכמטי (איור 1A-E), מתבצעת צביעה חיסונית, ולאחר מכן התמונות נצפות ונאספות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי (איור 1F,G).

ארגון מיקרוטובולים קדם-סינפטי ופוסט-סינפטי של NMJ יכול להיות מסומן עם אנטי-α-טובולין, ועל-ידי בחירת עובי השכבה של המיקרוסקופ הקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן מתואר פרוטוקול לדיסקציה וצביעה חיסונית של דרוזופילה , זחלים, צמתים עצביים-שריריים ותאי שריר. ישנן מספר נקודות חיוניות שיש לקחת בחשבון. ראשית, הימנעות מפגיעה בשרירים הנצפים היא חיונית במהלך תהליך הדיסקציה. ייתכן שכדאי לתקן את הפילה לפני הסרת איברים פנימיים כדי למנוע מגע ישיר בין המלקחיים לשרירים. כדי למנוע נזק לשרירים או הפרדה מהאפידרמיס של הזחל, חשוב לוודא שמהירות השייקר לא תעלה על 15 סל"ד במהלך השטיפה והדגירה. בנוסף, יש צורך בשליטה מדויקת על הארכת העור כדי להבטיח צילום ברור ומלא של המורפולוגיה של NMJ. מומלץ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר יינג שיונג על הדיונים וההערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) ל- C. M. (31500839).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104לדלל 1:200
הרכבה משופרת נגד דהייה בינוניתBeyotimeP0128M
FV10-ASW מיקרוסקופ קונפוקלינוגדן נגד עכבר אולימפוס
עז, Alexa Fluor 488 מצומדThermo FisherA-11001לדלל 1:1,000
מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר LSM 710Zeiss
מספריים מיקרו66vision54138B
עכבר נוגדניםפוטש מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה   22C10לדלל 1:50
נוגדן אנטי-אלפא;-טובולין עכברSigmaT5168לדלל 1:1,000
ParaformaldehydeWako168-20955ריכוז סופי: 4% במאגר PB
נירוסטה סיכות MinutienEntomoravia0.1 מ"מ קוטר
סטריאומיקרוסקופ SMZ161מוטי
מיקרוסקופ BX41אולימפוס
טקסס עז מצומדת אדומה אנטי-HRPג'קסון ImmunoResearchמדלל 1:100
TO-PRO(R) 3 יודידInvitrogenT3605לדלל 1:1,000
שייקר הסרת צבע העברה TS-8מכשירי מעבדה Kylin-BellE0018
TritonX-100BioFroxx1139
פינצטה Dumont500342
נגד פלואורסצנטי סטריאוסקופי

מקורות

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204(2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488(2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202(2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צומת עצב-שריר של דרוזופילהדינמיקה של מיקרוטובולייםKatanin 60צביעת אלפא-טובוליןמיקרוסקופיה קונפוקליתסריקה גנטיתפרוטוקול לצביעה אימונוהיסטוכימיתהפרעות התפתחותיות נוירולוגיות
שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.