מקור המזון של Caenorhabditis elegans במעבדה הוא Escherichia coli חי. מכיוון שחיידקים פעילים מטבולית, הם מציגים משתנה מבלבל במחקרים מטבוליים ותרופתיים ב- C. elegans. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ למחקר בגנטיקה, התפתחות, הזדקנות, מטבוליזם והתנהגות. מכיוון ש-C. elegans צורכים תזונה של חיידקים חיים, הפעילות המטבולית של מקור המזון שלהם יכולה לבלבל ניסויים המחפשים את ההשפעות הישירות של התערבויות שונות על התולעת. כדי להימנע מההשפעות המבלבלות של חילוף החומרים של חיידקים, חוקרי C. elegans השתמשו בשיטות רבות כדי להשבית חיידקים מבחינה מטבולית, כולל קרינה אולטרה סגולה (UV), הרג חום ואנטיביוטיקה. טיפול UV הוא בעל תפוקה נמוכה יחסית ולא ניתן להשתמש בו בתרבית נוזלית מכיוון שיש לבדוק כל צלחת להרג חיידקים מוצלח. שיטת טיפול שנייה, קוטלת חום, משפיעה לרעה על המרקם והאיכות התזונתית של החיידק, מה שמוביל למעצר התפתחותי של C. elegans. לבסוף, טיפול אנטיביוטי יכול לשנות ישירות את הפיזיולוגיה של C. elegans בנוסף למניעת צמיחת חיידקים. כתב יד זה מתאר שיטה חלופית לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד (PFA). טיפול PFA מצליב חלבונים בתוך תאי חיידקים כדי למנוע פעילות מטבולית תוך שמירה על מבנה התא ותכולת התזונה. שיטה זו היא בעלת תפוקה גבוהה וניתן להשתמש בה בתרבית נוזלית או בצלחות מוצקות, שכן בדיקת צלחת אחת של חיידקים שטופלו ב- PFA לגדילה מאמתת את כל האצווה. ניתן להשתמש בהשבתה מטבולית באמצעות טיפול PFA כדי לחסל את ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי על מחקרים של תוספי תרופות או מטבוליטים, עמידות ללחץ, מטבוליזם והתנהגות ב- C. elegans.
מבוא
Caenorhabditis elegans הוצע במקור כאורגניזם מודל בשנת 19651 ומאז אומץ באופן נרחב במחקרים על גנטיקה, התפתחות, התנהגות, הזדקנות ומטבוליזם2. בשל גודלם הגדול והציפורן השקופה שלהם, C. elegans מתאים במיוחד לסינון בתפוקה גבוהה עם כתבי פלורסנט3. מחזור החיים הקצר שלהם, הרבייה ההרמפרודיטית וההומולוגיה הגנטית שלהם עם בני אדם הופכים גם את C. elegans למערכת מודל רבת ערך למחקרים על התפתחות4 וביולוגיה של הזדקנות5. יתר על כן, C. elegans הם יחסית קל לתחזוקה. ניתן לגדל תולעים בתרבית נוזלית או על צלחות אגר מוצקות ולצרוך תזונה של חייד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חיסון חיידקים
- הכינו ציר לוריא (LB) על ידי המסת 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב-950 מ"ל מים מזוקקים.
- התאם את ה- pH של LB ל- 7.0 על ידי הוספת 5M נתרן הידרוקסידי (NaOH). זה צריך לדרוש רק כ 0.2 מ"ל של NaOH.
- בצע Autoclave של מדיית LB מותאמת pH במחזור נוזל למשך 45 דקות ב- 15 psi. אפשר לתמיסה להתקרר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- חסן מושבה אחת של חיידקים ב 100 מ"ל של LB בבקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל. תרבית את החיידקים למשך הלילה באינקובטור שייקר של 37 מעלות צלזיוס.
- בהתאם לבריאות מושבת החיידקים, גודל הבקבוק והמהירות אליה מכוון השייקר, הזמן שלוקח לחיידקים לגדול עשוי להשתנות. לאחר ~14 שעות,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
זרימת עבודה מפורטת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. שיטה בעלת תפוקה גבוהה פותחה ועברה אופטימיזציה כדי להשבית באופן עקבי שכפול חיידקים (איור 2A) ומטבוליזם (איור 2B) עבור מחקרים מטבוליים ותרופתיים במחקר C. elegans באמצעות פרפורמלדהיד16. המטרה הייתה לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר של PFA הדרוש ואת משך הזמן הקצר ביותר הדרוש כדי להרוג את החיידקים באופן עקבי מבלי להשפיע על מדדי בריאות שונים בתולעים. ערכים אלה עשויי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היתרונות של הרג PFA ביחס לשיטות הרג חיידקים אחרות
טיפול PFA הוא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למניעת חילוף חומרים חיידקי תוך שמירה על מקור מזון מזין עבור C. elegans. להרג חיידקים באמצעות טיפול PFA יש יתרונות רבים על פני שיטות אחרות. שלא כמו טיפול UV, שבו כל צלחת חייבת להיבדק להרג מוצלח, צלחת אחת מאצווה של חיידקים שטופלו ב- PFA יכולה להיבדק כדי לאמת את אצווה16. טיפול ב-PFA הוא גם יעיל מאוד בסילוק חילוף החומרים של חיידקים (איור 2B), וחיידקים שטופלו .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי NIH R21AG059117 ומעבדות פול פ. גלן לביולוגיה של חקר ההזדקנות באוניברסיטת מישיגן. SB מומן על ידי T32AG000114. ESK מומנה על ידי NSF DGE 1841052.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סיכות | נייר אלומיניום | 2549291 | |
| מבער בונסן | VWR | 470121-700 | |
| מד צפיפות תאים | דנוויל | 80-3000-45 | |
| צנטריפוגה | Eppendorg | 5430 | |
| קולט אדים כימי | Labcono | 975050411384RG | |
| צינורות קונינקליים (50 מ"ל) | פישר | 339652 | |
| Cuvettes | פישר | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| צלוחיות ארלנמאייר | פישר | 250 מ"ל: FB501250 500 מ"ל: FB501500 1000 מ"ל: FB5011000 | |
| לולאת חיסון | פישר | 22-363-605 | |
| LB אגר | פישר | BP1425500 | |
| בקבוק איסוף פסולת נוזלית | תומאס סיינטיפיק | 1230G50 | |
| מגנזיום גופרתי (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – תמיסה נטולת מתנול |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| כלי פלסטיק (100 מ"מ) | Fisher | FB0875712 | |
| אשלגן פוספט מונוביסיק (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 ערכת בדיקת שטף חוץ-תאית ותרבית תאים Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| פיפטות סרולוגיות (50 מ"ל) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| אינקובטור שייקר | תרמו | 11 676 083 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | פישר | S640-3 | |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | פישר | S318500 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| דלי איסוף פסולת מוצקה | M& M תעשיות | 5.0 ליטר M1 דלי | |
| טריפטון | Genesee Scientific | 20-251 | |
| מערבולת | תרמו | 11676331 | |
| איזון שקילה | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| תמצית שמרים | Genesee Scientific | 20-255 |
מקורות
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
