Method Article

בידוד, זיהוי התנהגותי והערכת פתוגניות של פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער ודרך חלופית להעריך את פעילותן האנטומופתוגנית באמצעות חרק מודל קולאופטרן. שיטה זו יעילה ונוחה לחקר משאבים פטרייתיים אנטומופתוגניים ממזיקים חרקים משעממי עץ ביערות טבעיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בורות עץ יער (FWB) גורמים לנזק חמור לעצים ולהפסדים כלכליים ברחבי העולם. שחרור פטריות אנטומופתוגניות (EPF) במהלך תקופת הופעת FWB נחשב חלופה מקובלת לבקרה כימית. עם זאת, משאבי EPF נחקרו פחות באופן משמעותי עבור FWBs, בניגוד למזיקים חרקים חקלאיים. מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר משאבי EPF מ-FWBs תוך שימוש באוכלוסיות בר Monochamus alternatus כדוגמה. בפרוטוקול זה, הקצאת מלכודות פיתיון עם M. אלטרנטוס המושך לאוכלוסיות שונות הבטיח איסוף דגימות נאותות עם תסמיני זיהום טבעיים, בתקופות הופעתה של החיפושית. לאחר ניתוח דק של אינטגמנטים והצבתם על תווך סלקטיבי, בודדו מיני פטריות מכל חלק בגופי החיפושיות וזוהו על סמך תכונות מולקולריות ומורפולוגיות כאחד.

מספר מינים פטרייתיים אושרו כ-EPFs טפיליים באמצעות הדבקה חוזרת של M. alternatus בריא עם תרחיף נבגים. הפנוטיפים ההתנהגותיים שלהם על M. alternatus נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק והושוו עוד יותר לאלה על חרק מודל Coleopteran Tribolium castaneum. עבור EPFs המציגים פנוטיפים עקביים של טפילות על שני מיני החיפושיות, הערכת פעילותם על T. קסטנאום סיפק מידע רב ערך על קטלניות למחקר עתידי על M. alternatus. פרוטוקול זה סייע לגילוי EPF שדווח לאחרונה על אוכלוסיות M. alternatus בסין, אשר יכול להיות מיושם כגישה יעילה לחקור יותר משאבי EPF מ- FWB אחרים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההרס שנגרם על ידי מזיקים חרקים הוביל להפסדים אקולוגיים וכלכליים גדולים הן במערכות אקולוגיות יער והן במערכות אקולוגיות חקלאיות. רוב המזיקים החקלאיים חושפים את עצמם לאויבים טבעיים או לחומרי הדברה מלאכותיים תוך פגיעה בצמחים פונדקאים. במקום זאת, בורות עץ יער (FWB) כמעט משלימים את כל מחזורי ההתפתחות שלהם בתוך גזעי עצים מארחים1, מה שמעלה אתגרים גדולים לחקור אורגניזמים יעילים של הדברה ביולוגית מ-FWB בשדה הפראי. מה שגרוע עוד יותר הוא ש-FWBs נושאים מספר רב של פיטופתוגנים2 או שיש להם מערכת יחסים אינטימית עם פתוגנים אלה כווקטורים פוטנציאליים 3,4, מה שמגביר באופן דרמטי את ההשפעות השליליות של FWB על בריאות היער. שימוש מופרז בקוטלי חרקים כימיים יכול להקל על חומרת FWB, אך הופעתה של עמידות לקוטלי חרקים 5,6 מגבילה את היישום הסביבתי שלהם. במקרים מסוימים, טפילי חרקים, פרוקי רגליים טורפים וכן חיידקים אנטומופתוגניים שוחררו כחומרי הדברה ביולוגית לאזורי ההפצה של FWB7 והוכחו כחלופות יעילות ומקובלות כלכלית להדברה כימית 8,9,10.

פטריות אנטומופתוגניות (EPF) נחשבות לבעלות יתרון בשליטה על FWB על פני רוב קבוצות החיידקים האחרות. הנבגים שלהם יכולים להינשא על ידי פונדקאי חרקים ולקבע אותם ביציבות על משטחי הגוף באמצעות חדירה לקוטיקולה או לכסות 8,11. EPF גם מציג יכולת הסתגלות מצוינת לעקות סביבתיות וכמה מינים מתיישבים היטב ברקמת העצים כאנדופיטים12,13, מה שמקל על גדילתם, הישרדותם והעברתם. עם זאת, בהשוואה לזה בתעשיות חקלאיות, מגוון המינים של EPF המשמש במערכות אקולוגיות של יער טבעי מוגבל להפליא 14,15,16. זן Beauveria bassiana (זן PPRI 5339) התגלה כזן המבטיח ביותר לקידום תוכנית IPM לחדקוניות אקליפטוס בדרום אפריקה17 ושילוב של שני מבודדים מבטיחים של B. בסיאנה סיפקה הזדמנות להדברה מיקרוביאלית מעשית של חדקונית הדקל האדומה, Rhynchophorus ferrugineus, בשלבי חיים שונים בשדות דקל18. בנוסף לבובריה ולמטריזיום הידוע, סוגים אחרים של EPF מסדר Hypocreales, במיוחד מינים של Lecanicillium (שרבים מהם מסווגים כיום לסוג Akanthomyces19,20), הראו פתוגניות חזקה ופוטנציאל גבוה בניהול מזיקים ביער, כגון כנימת ברוש בצ'ילה21.

חיפושית האורן Monochamus alternatus היא מזיק יער אורנים ידוע לשמצה בסין ובמדינות השכנות, אשר מתחפר בענפים וגזעים של עצי אורן כדי לעכב את הובלת חומרי המזון והמים 22,23,24. יתר על כן, מ '. אלטרנטוס גם מקדם את פלישת נמטודת עץ האורן הטפילית (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) כחיפושית הווקטורית העיקרית שלה. מין קונגנרי נוסף של החיפושית, M. galloprovincialis, התפשט PWN במספר מדינות באירופה בשנים האחרונות25. מחקר קודם דיווח על מספר סוגים של EPFs טבעיים מ-Monochamus spp., כגון Beauveria, Metarhizium ו-Lecanicillium (Verticillium, אפילו שם קודם של Lecanicillium), בספרד, יפן ומחוזות Anhui/Zhejiang בסין 26,27,28,29. עם זאת, נראה כי אוספים אלה של EPF מוגבלים בדרך כלל במיקום מסוים, בהשוואה להופעה הרחבה של חיפושיות מונוכמוס בשדות טבעיים. מכיוון שלחיפושית M. alternatus יש תפוצה גיאוגרפית רחבה בסין, ניתן להתייחס אליה כאל בורר עצים מייצג כדי לחקור יותר EPF פוטנציאליים באוכלוסיות שונות.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מציגים הליך ספציפי הבוחן EPFs ממספר אוכלוסיות גיאוגרפיות של M. אלטרנטוס בדרום סין. פרוטוקול זה משתמש במודל חיפושית Coleopteran כתחליף לביצוע בדיקות אנטומופתוגניות, בתנאי שלמין הפטרייתי הנבדק יש פנוטיפ התנהגותי עקבי בשני מיני החיפושיות. פרוטוקול זה יכול גם לספק תובנות לגבי חקר EPF עבור בורות יער אחרים, שבהם מגוון מיני הפטריות האנטומופתוגניות שלהם אינו מוערך כראוי או נחקר פחות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד פטריות מ-M. alternatus (איור 1)

  1. אספו את דגימת החיפושית
    1. לאסוף את אורנים sawyer חיפושיות M. אלטרנטוס משתמש במלכודות מסחריות (ראו טבלת חומרים) שאותן פיתו מושכים לפני תקופות הופעתן החזויות של אוכלוסיות החיפושיות ביערות אורן נגועים באופן טבעי.
      הערה: במחקר זה, חיפושיות נאספו מחמישה אזורים גיאוגרפיים בדרום סין (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). הגדרת המלכודת מלמעלה למטה היא כדלקמן: משטח עליון עגול (קוטר 50 ס"מ), לוח בצורת צלב (35 ס"מ רוחב ו-66 ס"מ אורך), משפך (35.5 ס"מ בקוטר עגול עליון ו-5.5 ס"מ בקוטר עגול תחתון), איסוף (קוטר 10.5 ס"מ ואורך 26.5 ס"מ). הנדיפים הפונדקאי (למשל, אתנול ו-α-פינן) ופרומון הצבירה (2-undecyloxy-1-ethanol) משמשים כפיתיון30.
    2. תייג את הדגימה לפני העברתה למעבדה. שים כל חיפושית בצינורות מעוקרים בודדים עם זרדים טריים. החלף זרדים עם אלה טריים כל 2 ימים.
    3. לגדל את החיפושיות החיות ב 25 ± 1 מעלות צלזיוס באינקובטור לא לח (16-8 מחזורי L / D) ולצפות בהם מדי יום.
    4. דגימות תיעוד המראות ירידה בהזנה ובניידות. העברה מת מ. alternatus כי להיות קשוח ונוקשה לחדרים רטובים כדי לצפות בצמיחה של תפטיר פטרייתי ו conidia.
      הערה: לאחר שנדבקו בפטריות אנטומופתוגניות, החיפושיות הציגו ירידה בהזנה ובניידות בשלב הראשוני של ההדבקה31,32. לאחר מותם, גופם נעשה קשוח ונוקשה, כאשר תפטיר וקונידיה הופיעו מספר ימים לאחר האחסון בתא רטוב33.
    5. אחסנו גופות חיפושיות עם זיהומים פטרייתיים בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, לעבד את הדגימות מיד בתוך כמה שעות כדי למנוע זיהום עם פטריות saprotrophic יותר.
  2. הכנת מדיום צמיחה
    1. הוסיפו 39 גרם של אבקת אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) לליטר אחד של מים טהורים ובצעו אוטוקלאבינג למשך 30 דקות בטמפרטורה של 121°C.
    2. מצננים לטמפרטורה הניתנת להפעלה (~50°C), מוסיפים 0.05 גרם סטרפטומיצין, 0.05 גרם פניצילין G ו-0.05 גרם טטרציקלין, ומנערים כדי להפיץ את המדיום.
    3. מעבירים את המדיום לצלחות פטרי מתחת לספסל נקי ומשתמשים בו לאחר המיצוק.
      הערה: מדיום PDA עם אנטיביוטיקה משמש לבידוד מחיפושיות, המונע צמיחת חיידקים מבלי להשפיע על צמיחת פטריות במהלך הבידוד. עם זאת, מדיום PDA ללא אנטיביוטיקה משמש לטיפוח יומיומי ושימור.
    4. שים 35 גרם של אבקת מרק דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB) לתוך 1 ליטר של ddH2O ו autoclav אותו במשך 30 דקות ב 121 ° C. מצננים אותו לשימוש.
  3. דיסקציה של דגימת החיפושית עם תסמיני זיהום פטרייתי
    1. הכינו מספריים, אזמלים וסיכות חרקים מעוקרים; לאחר מכן, לעבוד מתחת לספסל נקי עם מבער אלכוהול.
      הערה: ניתן להתאים את השימוש בכלי דיסקציה בהתאם להעדפות אישיות. סיכות חרקים חדות יותר ממחטי ניתוח סטנדרטיות, ומפרטים שונים יכולים לענות על הצורך בדיסקציה.
    2. נתחו את האינטגמנטים של גוף החיפושית בעזרת כלים בצלחות פטרי סטריליות וחד פעמיות. יש להקפיד להימנע מנזק אפשרי לרקמות המעי התיכון והאחורי שעלול להפריש תוכן פנימי.
    3. חלקו את גופי החיפושית לעמדות העיקריות כדלקמן: אנטנות, ראש, בית חזה, בטן, כנפיים (כל זוג) ורגליים.
  4. טיהור פטריות
    1. חותכים את הכסות של כל עמדה לחתיכות קטנות עם מספריים. לחץ בעדינות על המשטח החיצוני על פני השטח של לוחות PDA עם אנטיביוטיקה.
      הערה: יש לוודא כי תפטיר פטרייתי על הכסות חוסנו לצלחת.
    2. אוטמים עם פרפילם בזהירות, ותרבית באינקובטור ב 25 ± 1 מעלות צלזיוס עד שהרקמות מכוסות היטב על ידי תפטיר.
    3. מעבירים מושבות בודדות לפי תכונות פנוטיפיות (צבע, צורה) למחשב כף יד חדש עם אנטיביוטיקה לתרבית בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס.
    4. חזור על שלב 1.4.3 פעמיים או שלוש פעמים על PDA עם אנטיביוטיקה עד לבידוד מושבות טהורות בנפרד.
      הערה: אם זנים פטרייתיים מרובים גדלים בצלחות המקוריות, בחר את התפטיר בדיוק כדי להקל על מיון של מינים פטרייתיים יותר.
  5. אחסון של מבודד פטרייתי
    1. העברת קוביות אגר (~ 5 מ"מ קוטר) ממושבות ללוחות מחשב כף יד חדשים.
    2. תרבות באינקובטור ב 25 ± 1 °C (75 °F) במשך 1-2 שבועות.
    3. הכניסו למקרר בטמפרטורה של 4°C לאחסון יומי לשימוש נוסף.
    4. יש לחסן זנים פטרייתיים ב-50 מ"ל PDB סטרילי בצלוחית של 250 מ"ל, תוך רעידות ב-180 סל"ד לדקה ב-25°C למשך 5-7 ימים.
    5. קצרו 1 מ"ל של התפטיר הפטרייתי הטרי והשהו אותו ב -1 מ"ל של גליצרול 20% מעוקר בצינורות הקפאה סטריליים של 2 מ"ל (הריכוז הסופי של גליצרול הוא 10%).
    6. אוטמים את הצינורות עם פרפילם ומקררים אותם מראש ב -20 ° C ו -40 ° C. לאחר מכן, לשמור על צינורות ב -80 ° C כמו מלאי.

2. זיהוי מולקולרי ומורפולוגי של מבודדים פטרייתיים

  1. מיצוי DNA גנומי פטרייתי
    1. תרבית פטריות PDB כמתואר בשלב 1.5.4.
    2. קצרו את התפטיר וסננו אותו כדי להפריד אותו מה-PDB. הומוגניזציה בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ומזיק מקורר מראש.
    3. יש לחלץ את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הדנ"א הגנומי של הפטריות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. הגברה PCR וריצוף DNA
    1. הכינו את תערובת תגובת ה-PCR באופן הבא: 25 μL של Taq DNA פולימראז, 1 μL של תבנית, 2 μL של פריימרים קדימה ואחורה, ו-ddH2O לנפח כולל של 50 μL.
    2. להגביר את אזור rDNA-ITS של דגימת ה- DNA באמצעות זוגות פריימר ITS1 ו- ITS434 (ראה טבלה 1) עם ההליך הבא: דנטורציה ראשונית ב 95 ° C במשך 4 דקות, ואחריו 35 מחזורים של denaturing ב 94 ° C במשך 60 שניות, חישול ב 58 ° C במשך 60 שניות, התארכות ב 72 ° C במשך 2 דקות, והתארכות סופית ב-72°C למשך 10 דקות.
    3. אלקטרופורזה של מוצרים מוגברים באמצעות 1.5% ג'ל אגרוז ב 100 V, 100 mA.
    4. רצף את ה- PCR.
    5. ישר את הרצף באמצעות Clustal X2.0 ו- MEGA 6.0.
      הערה: במהלך יישור רצף, אתרים עם יישור רב-משמעי אינם נכללים, והפערים מטופלים כנתונים חסרים.
    6. השווה את הרצף המתקבל עם אלה במסד הנתונים של רצף ITS ב- GenBank באמצעות BLAST באתר המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI). זהה את המידע על מיני הזנים הפטרייתיים באופן ראשוני.
  3. זיהוי מורפולוגי
    1. השתמש במצלמה כדי ללכוד את המורפולוגיה הבוגרת של מושבה טהורה פטרייתית הן בצד הקדמי והן בצד האחורי של לוחות מחשב כף היד.
    2. קוטפים קונידיה ממושבות הפטריות של התרבית הטהורה בעזרת מחט חיסון ומעבירים אותם למגלשת זכוכית עם טיפת מים סטריליים.
    3. החזיקו את חלקת הכיסוי והניחו אותה באיטיות בזווית של ~45°, כך שהחלקת הכיסוי תוכל לכסות את הדגימה ללא בועות.
    4. חותכים גוש אגר2 מ"מ 5 מ"מ עם אזמל ממושבות בקצה המושבה הפטרייתית, ומעבירים אותו למגלשת זכוכית נקייה עם טיפת מים סטריליים. בזהירות להקניט את הפטריות עם מחט דקה כדי לראות מבנים ספציפיים.
    5. חזור על שלב 2.3.3.
    6. התבוננו בשינוי הצורה הא-מיני של הפטריות תחת מיקרוסקופ אופטי (OM), כולל הצורה, השקיפות והיציבה של הקורים, הקונידיופורים, הפיאלידים והקונידיה. רשום ומדוד את הצורה והגודל של המאפיינים הא-מיניים כדי להבחין בין המבודדים הפטרייתיים השונים.
      הערה: כדי למקסם את היכולת לצפות במבנים פטרייתיים, השתמש בכתמים ובאמצעי הרכבה35.

3. השראת תסמיני הזיהום הפטרייתי על M. alternatus כדי לבחון את הפנוטיפים ההתנהגותיים שלהם

  1. הכנת השעיה קונידיאלית
    1. להכין 0.01% Tween-80 עם מים טהורים autoclave אותו במשך 25 דקות ב 121 °C. יש להשתמש לאחר הקירור.
    2. הוסף כמות מתאימה של חרוזי זכוכית קטנים סטריליים ותמיסת 0.01% Tween-80 לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.
    3. מגרדים מושבות פטרייתיות לתוך הצינור ומנערים אותו מספיק עם שייקר מערבולת עד שהמושבה מתפרקת. סנן דרך שתי שכבות של גזה כדי להסיר את התפטיר.
      הערה: ניעור נעשה כדי להבטיח את ההשעיה של conidiospore בתמיסת 0.01% Tween-80.
    4. יש לספור את מספר הנבגים מתחת ל-OM עם המוציטומטר, להתאים ל-1 × 108 חרוטי/מ"ל עם 0.01% Tween-80 סטרילי, ולשמור על טמפרטורה של 4°C לשימוש.
  2. הכנת חיפושיות
    1. Autoclave זרדים אורן (בערך באותו גודל) ומייבש בתנור (~ 60 ° C).
    2. שמור את M שנאסף בשטח. מבוגרים alternatus עם זרדים אורן באינקובטור ב 25 ± 1 °C (75 °F).
    3. הרעיבו חיפושיות למשך 24 שעות ועקרו את פני השטח של החיפושיות עם אקונומיקה, אתנול ומים מזוקקים [10:10:80 (v:v)] לפני השימוש.
  3. אינדוקציה של זיהום פטרייתי
    1. עבדו מתחת לספסל נקי, טבלו את זרדי האורן במתלה קונידיאלי למשך 10 שניות, וייבשו אותם באוויר.
    2. טובלים חיפושיות בתרחיף קונידיאלי למשך 10 שניות, ואז מעבירים לצינורות סטריליים של 50 מ"ל (חיפושית אחת וזרד אחד לכל צינור). החלף את הזרדים בזרדים חדשים כל יומיים.
    3. לשליטה שלילית, שנה את המתלה הקונידיאלי לתמיסת 0.01% Tween-80 סטרילית בלבד. הכינו חמישה עותקים משוכפלים לכל זן פטרייתי וקבוצת ביקורת.
    4. להעריך את הפעילות של חיפושיות בהתבסס על כמות frass המיוצר על זרדים אורן. כאשר האכלה מפסיקה, לשקול אותם מתים.
    5. מעבירים את החיפושיות המתות לצינורות סטריליים חדשים של 50 מ"ל ומניחים פיסת כותנה סטרילית לחה. לדגור ב 25 ± 1 °C (75 °F).
      הערה: הכותנה הרטובה משמשת לשמירה על לחות, מכיוון שצמיחת פטריות דורשת לחות מתאימה, אך לא יותר מדי.
    6. התבוננו וצלמו את השינוי של פני החיפושית באותה שעה בכל יום.
  4. בידוד מחדש ואישור מינים פטרייתיים
    1. עד שפנוטיפים ברורים של זיהום פטרייתי מופיעים על פני השטח של חיפושיות, בחרו תפטיר מרקמות שונות בנפרד לתוך לוחות מחשב כף יד חדשים.
    2. תרבית ב 25 ± 1 מעלות צלזיוס ולהתבונן כדי להבטיח את המורפולוגיה עולה בקנה אחד עם זה של פטריות מחוסנות.
  5. טיפול בחיפושית מודל
    1. חזור על שלבים 3.2.1-3.3.6 על חיפושית המודל Tribolium castaneum, באמצעות סובין חיטה כמזון, ולעקר סובין חיטה עם אור UV.
    2. געו בחיפושיות קלות עם פינצטה סטרילית. נניח שהם מתים אם אין תגובה.

4. לאשר את הפנוטיפים זיהום של פטריות על M. alternatus וחיפושית מודל

  1. הכנה לדוגמה לתצפית
    1. לנתח את M נגוע. Alternatus גופות בזהירות כמו בשלב 1.3.
    2. פיק טי. גופי קסטנאום עם תסמינים ברורים של זיהום פטרייתי.
    3. חתכו פקקי דיסק בקוטר 5 מ"מ של ארבע מושבות פטרייתיות בוגרות הגדלות על מחשבי כף יד.
  2. טיפול מקדים לדוגמה
    1. הכניסו פקקים, רקמות חיפושיות נגועות וגופים ל-2.5% גלוטראלדהיד מקורר ב-4°C למשך יומיים.
    2. יש לשטוף שלוש פעמים במאגר פוספט 0.1% (pH 7.2-7.4) למשך 5 דקות ולייבש ב-30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% אתנול למשך 10 דקות.
    3. יבשו את הדגימות במייבש בהקפאה בוואקום.
      הערה: יש להקפיד על כל תהליך הטיפול המקדים, כולל חיתוך, השרייה, התייבשות, שטיפה וייבוש, כדי למנוע נזק לדגימה.
  3. תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
    1. מצפים את הדגימות המטופלות בפלטינה באמצעות קוטר מרזב, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק36.
    2. רשום את המאפיינים המורפולוגיים של hyphae ו conidia גדל על PDA, M. רקמות אלטרנטוס , וגופי חיפושיות מודל.
    3. השווה אם התוצאות עקביות עם אלה תחת OM בשלב 2.3.

5. הערכת פעילות אנטומופתוגנית

  1. הכנת השעיה קונידיאלית
    1. הכנת ההשעיה הקונידאלית זהה לשלבים 3.1.1-3.1.4.
  2. טיפול מקדים בחיפושית מודל
    1. לתרבת, להאכיל, לעקר ולהרעיב את ט'. קסטנאום כמו בשלב 3.5.1.
    2. לעקר סובין חיטה על ידי UV, ולשים משקל שווה לצלחות פטרי סטריליות.
  3. בדיקת פעילות אנטומופתוגנית
    1. טפלו בסובין חיטה עם תרחיף קונידיאלי וייבשו אותם באוויר מתחת לספסל נקי בטמפרטורת החדר.
    2. לטבול ט. חיפושיות קסטנאום בתרחיף הקונידיאלי למשך 10 שניות ומעבירות אותן לצלחת פטרי (n = 20 בכל צלחת פטרי). החלף סובין חיטה חדש עם אותו טיפול קונידיאלי כל 4 ימים.
    3. לשליטה שלילית, יש למרוח רק תמיסת 0.01% Tween-80 סטרילית.
      הערה: הקצו לפחות שלושה עותקים משוכפלים לכל קבוצת טיפול ולקבוצת הביקורת.
    4. ספרו את החיפושיות המתות מדי יום.
      הערה: געו קלות בחיפושיות עם פינצטה סטרילית. נניח שהם מתים אם יש חוסר תגובה.
  4. אנליזה פילוגנטית מרובת גנים
    1. חלץ DNA גנומי פטרייתי אנטומופתוגני כמתואר בשלב 2.1.
      הערה: זיהוי רב-גני מתבצע עבור EPFs טפיליים המראים פנוטיפים זיהומיים משמעותיים ופעילויות אנטומופתוגניות חזקות נגד חיפושית המודל.
    2. להגביר את הגנים הבאים, כולל אזור המשתרע על פני הגן הריבוזומלי הגרעיני SSU34, מקטע של הגן rRNA תת-יחידה גדולה (LSU37,38), חלק מגורם ההתארכות 1-אלפא (tef-1α39) גן, רצפי תת-היחידה השנייה בגודלה של RNA פולימראז ІІ (rpb240), וחלק β-טובולין41 באמצעות זוגות הפריימר NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R ו-TUB1/TUB22 (ראו טבלה 1), בהתאמה.
      1. הכינו את תערובת תגובת ה-PCR כמו בשלב 2.2.1.
      2. בצע הגברה באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב 95 ° C במשך 4 דקות, ואחריו 35 מחזורים (tef-1α, rpb2, SSU), 38 מחזורים (LSU) או 39 מחזורים (β-tubulin) של denaturing ב 94 ° C במשך 60 שניות, חישול ב 47 ° C עבור 60 s (LSU), 55 ° C עבור 60 s (tef-1α), 54 ° C עבור 40 s (β-tubulin), ו 50 ° C עבור 30 s (rpb2, SSU), התארכות ב 72 ° C למשך דקה אחת, והתארכות סופית ב 72 ° C למשך 10 דקות.
    3. רצף ויישור לפי אותם שלבים כפי שמוצג בשלבים 2.2.4-2.2.5.
    4. בצע את הניתוח הפילוגנטי על ידי MEGA 6.0 בהתבסס על שיטת הסבירות המרבית (ML)42.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד וזיהוי של מבודדים פטרייתיים מ M. אלטרנטוס
בעזרת מלכודות משיכה, מספר גדול (כ 500 חיפושיות בסך הכל) של M. האלטרנטוס נאספו מחמישה אזורים גיאוגרפיים. גופות חיפושיות עם תסמינים אופייניים של זיהום על ידי פטריות אנטומופתוגניות נקטפו; לאחר מכן, כל חיפושית חולקה למספר תנוחות כמתואר בשלב 1.3 של הפרוטוקול. כתוצאה מכך, יותר מ -600 מבודדים פטרייתיים בודדו מתנוחות גוף שונות. זה מאפשר מועמדים פטרייתיים עשירים יותר לסינון פתוגנים נגד חיפושיות מנסר אורן. ריצוף של אזור ITS גיל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוכלוסיות גיאוגרפיות שונות של FWB עשויות לפתח אינטראקציות מגוונות עם הפטריות האנטומופתוגניות הטבעיות, עקב התאמה סביבתית ארוכת טווח של מיני EPF לגורמי אקלים מקומיים ולאוכלוסייה הגנוטיפית הספציפית של החרק המארח44,45. הרחבת אתרי הדגימה לאזורי התרחשות חרקים מרובים מסייעת להגדיל את האפשרות לרכוש זנים או מינים מגוונים של EPF מהפונדקאים הטבעיים שלהם, כפי שתואר במחקרים קודמים על מזיקים של חרקים חקלאיים46. בפרוטוקו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2021YFC2600100) והקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (LY21C040001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, 2 מ"לBiosharpBS-15-M
10 ומיקרו; טיפים L פיפטסנגון ביוטקF601216
10 ומיקרו; L, 20 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1,000 ומיקרו; פיפטות LRainin
1,000 ומיקרו; קצות פיפט Lסנגון ביוטקF630102
בקבוקונים קריוגניים 2 מ"לקורנינג430659
20x PBS מאגרסנגון ביוטקB548117-0500
200 ומיקרו; L קצות פיפטסנגון ביוטקF601227
2,000 bp יצרניתTaKaRarSD0531
50 מ"ל צינורותNest602052
50% תמיסת גלוטארלדהידסנגון ביוטקG916054
50x מאגר TAEסנגון ביוטקB548101
6x מאגר טעינהTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
אתנול נטול מיםJkchemicalLB10V37
ארון טיפוח ביוכימיהShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
מלכודות חיפושיות מסחריותFEIMENGDIBF-8
www.yinyouji.com Gel ImagerBio-RadGelDoc XR+
גליצרולסנגון ביוטקA600232
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוההסיגמאD-37520
סיר עיקור קיטור בלחץ גבוהמטלר טולדוJA5003
איזופרופיל אלכוהולמגיב כלליG75885B
צבע חומצת גרעיןסנגון ביוטקA616696
מיקרוסקופ אופטי, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR מדריפוי כוחTrident960
פניצילין GמרקליןGB15743
אגר דקסטרוז תפוחי אדמה, PDAOxoidCM0139
מרק דקסטרוז תפוחי אדמה,SolarbioP9240
Sangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
ערכת בידוד DNA גנומי מהיר פטריותסנגון ביוטקB518229
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, SEMהיטאצ'יS-3400N
סטרפטומיציןמרקליןS6153
טטרציקליןמרקליןT829835
Tween-80MarklinT6336
מייבש הקפאה ואקוםYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230
פריימרים PDB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles