Method Article

ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

DOI:

10.3791/65788

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, 2Ilse Kats Institute for Nanoscale Science & Technology, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 4The Scojen institute for synthetic biology, Reichman university

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישה כמותית למדידת צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים מועילים ופרוביוטיים ממלאים תפקידים חיוניים בפונדקאים שלהם, ומספקים יתרונות בריאותיים שונים, כולל חסינות למחלות זיהומיות. משפחת Lactobacillaceae מורכבת מחיידקים גראם-חיוביים עם תכונות פרוביוטיות מוכחות. מחקר זה משתמש בזני Lactobacillaceae כמודל להדגמת היעילות של ניתוח תפוקה גבוהה של תא בודד בחקר צבירה תאית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של מינים מועילים אלה לפחמימות פשוטות מהתזונה.

המחקר מראה כיצד ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) יכולה להתגבר על ההבדלים הבסיסיים בהרכבה של חיידקים פרוביוטיים בנוכחות והיעדר פחמימות. IFC משלב את העוצמה והמהירות של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה, ומאפשר מדידות מורפומטריות מורכבות בקצב גבוה באופן מוגדר פנוטיפית על פני ספרייה של זנים ותנאים מועילים של חיידקים. פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי הצבירה העצמית של מיני Lactobacillaceae ושופך אור על התגובה שלהם לפחמימות תזונתיות, מה שתורם להבנת המנגנונים מאחורי ההשפעות המועילות של חיידקים פרוביוטיים אלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבירה עצמית של חיידקים נחשבת לשלב ראשוני בהיווצרות ביופילם. בתהליך זה (המכונה לעתים גם autoagglutination או flocculation), חיידקים מאותו סוג יוצרים גושים רב-תאיים שבסופו של דבר מתיישבים בתחתית צינורות התרבית או נצמדים לרקמת המטרה או לפני השטח שלהם1.

אוטואגרגציה היא תופעה נפוצה והוכחה עד כה בפתוגנים גראם-שליליים כגון הפתוגן האופורטוניסטי Acinetobacter baumannii2, הפתוגן הדנטלי Aggregobacter actinomycetemcomitans3, והפתוגן המתהווה Burkholderia pseudomallei4. צבירה עצמית תוארה גם במספר זנים פרוביוטיים גראם-חיוביים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קובץ ה- .ast, עם התבנית עבור Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) כדוגמה, מסופק בקובץ קידוד משלים 1.

1. הכנת מדיה

  1. הכינו ציר Lactobacilli MRS בהתאם להוראות היצרן (55 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) וצלחות אגר Lactobacilli MRS עם אגר 1.5% (w/v) אגר (ראו טבלת חומרים). לאחר עיקור autoclave, המדיום מוכן לשימוש ישירות או ניתן לאחסן ב 4 °C.
  2. הכינו 50% (15 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) ציר סויה טריפטי (TSB) (ראו טבלת חומרים), TSB בתוספת 1% (w/v) D-(+)-גלוקוז ו-1% (w/v) D-(+)-raffinose, ואז אוטוקלאבה כדי לעקר את המדיום. עדיף לאחסן אותו ב 4 °C כדי למנוע זיה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה למדוד בקלות את ההבדלים באוטאגרגציה בתגובה לסוכרים תזונתיים בחיידקי LAB. על ידי הפרדת פרטים מאגרגטים, השיטה מאפשרת לחשב את אחוז האוכלוסייה של אירועי הצבירה מתוך כל האירועים בתגובה לסוכרים מותססים או לא מותססים מהתזונה. בנוסף, ניתן היה למדוד אם יש הבדלים בגודל הממוצע של אוכלוסיית המצרף בין הטיפולים.

התמונות המייצגות באיור 3 מדגימות את אסטרטגיית ה-gating עבור כל חיידק LAB. ב-LGG וב-L. paracasei זוהו תאים בודדים, אגרגטים קטנים, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטומטריית זרימה היא שיטה נפוצה לכימות עוצמות פלואורסצנטיות בתאים איקריוטים, אך היא עשויה שלא לספק מדידות מדויקות עבור תאי חיידקים בשל גודלם הגדול יותר או אגרגטים קטנים. גורמים אלה יכולים להשפיע באופן משמעותי על הכימות המדויק של אוטואגרגציה ועל הרמה הבסיסית של היווצרות אגרגטים בתנאים שונים. כדי לטפל בכך, נעשה שימוש בציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) כדי להשיג רזולוציה טובה יותר של האופן שבו פחמימות משפיעות על הצטברות של חיידקים פרוביוטיים5. IFC משלב את המובהקות הסטטיסטית של דגימות גדולות בציטומטריית זר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק 119/16) ומענק IMoh (3-15656) ל-IKG. ר.ש. נתמך על ידי מלגת קרייטמן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות תרבית 14 מ"לFalcon352051
צינור צנטריפוגה 15 מ"לFalcon352096
Bacto AgarBaeton, Dickinson and Company214010
Bacto Typtic Soy BrothBaeton, Dickinson and Company211825
D-(+)-GlucoseSigmaG7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrateSigma83400-25G
Difco Lactobacilli MRS מרקBaeton, Dickinson and Company288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 מ"ל (Eppendorf)FL רפואי23053
IDEAS תוכנהAmnis/EMD MilliporeN/A  פרטים זמינים בכתובת: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/A  פרטים זמינים בכתובת: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפוניתפישר ביו-ריאגנטיםBP308-500
אשלגן פוספט דו-בסיסיפישר סיינטיפיק, 174.18 גרם/מולBP363-1
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא, 136.09 גרם/מולP0662-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
  2. Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating hig....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometryMicrobial AutoaggregationLactobacillaceae SpeciesProbiotic BacteriaSingle Cell AnalysisDietary CarbohydratesHigh Throughput ImagingAggregate Size DistributionBright Field MicroscopyCell Aggregation

Related Articles