הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

3.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65792

⸱

10 בנובמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

תקציר

בדיקת דיאטום היא אמצעי עזר חיוני בפרקטיקה המשפטית כדי לקבוע אם הגופה טבעה במים ולהסיק את מקום הטביעה. בדיקות דיאטום הן גם תוכן מחקרי חשוב בתחום הסביבה והפלנקטון. טכנולוגיית בדיקת הביולוגיה המולקולרית הדיאטומית, המתמקדת בדנ"א דיאטומי כאובייקט המחקר העיקרי, היא שיטה חדשה לבדיקת דיאאטומים. מיצוי DNA דיאטומי הוא הבסיס לבדיקה מולקולרית דיאאטומית. כיום, הערכות הנפוצות למיצוי DNA דיאטום הן יקרות, מה שמגדיל את עלות ביצוע המחקר הנלווה. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת המיצוי המהירה הכללית של DNA גנומי בדם שלם והשיגה אפקט מיצוי DNA דיאטום משביע רצון, ובכך סיפקה פתרון חלופי, חסכוני ובמחיר סביר למיצוי DNA המבוסס על חרוזי זכוכית למחקר קשור. הדנ"א הדיאטום המופק באמצעות פרוטוקול זה יכול לספק יישומים רבים במורד הזרם, כגון PCR וריצוף.

מבוא

בפרקטיקה הפורנזית, הקביעה אם גופה שנמצאה במים טובעת או הושלכה למים לאחר המוות חיונית לפתרון הראוי של המקרה1. זהו גם אחד הנושאים הקשים שיש לפתור בדחיפות בפרקטיקה משפטית2. דיאטומים נמצאים בשפע בסביבה הטבעית (במיוחד במים)3,4. בתהליך של טביעה, עקב היפוקסיה ותגובת מתח, אנשים יהיו תנועות נשימה אינטנסיביות לשאוף כמות גדולה של נוזל טביעה. לכן, הדיאטומים במים נכנסים לריאה עם הנוזל הטובע, וחלק מהדיאטומים יכולים להיכנס למחזור הדם דרך מחסום הנאדיות-נימים ולהתפשט לאיברים פנימיים עם זרימת הדם 5,6. גילוי דיאטומים ברקמות ובאיברים פנימיים כגון ריאות, כבד ומח עצם הוא עדות חזקה לטביעה לפני המוות 7,8. כיום, בדיקות דיאטומיות פורנזיות מבוססות בעיקר על שיטות בדיקה מורפולוגיות. לאחר סדרה של עיכול מראש של הרקמה, הערכות מורפולוגיות איכותיות וכמותיות של דיאטומים לא מעוכלים מתבצעות תחת המיקרוסקופ. במהלך תקופה זו, ריאגנטים מסוכנים ולא ידידותיים לסביבה כגון חומצה חנקתית צריך לשמש. תהליך זה גוזל זמן רב ודורש מהחוקרים מומחיות טקסונומית מוצקה וניסיון רב. כל אלה מביאים אתגרים מסוימים לצוות הזיהוי הפלילי9. טכנולוגיית בדיקת DNA Diatom היא טכנולוגיה חדשה לבדיקות דיאטומיות שפותחה בשנים האחרונות 10,11,12. טכנולוגיה זו מממשת את זיהוי המינים של דיאטומים על ידי ניתוח הרכב רצף הדנ"א הספציפי של דיאטומים13,14. טכנולוגיית PCR וטכנולוגיית ריצוף הן שיטות טכניות נפוצות, אך הבסיס שלהן הוא מיצוי מוצלח של DNA מדיאטומים. עם זאת, לדיאטומים יש מבנה מיוחד שונה מאורגניזמים אחרים, מה שהופך את טכניקות מיצוי הדנ"א שלהם גם שונות.

דופן התא של diatom יש רמה גבוהה של סיליקציה, ואת המרכיב העיקרי שלה הוא דו תחמוצת הסיליקון 15,16,17. דופן התא הסיליקסי קשה מאוד, ויש להרוס אותה לפני מיצוי הדנ"א. ערכות מיצוי דנ"א רגילות הן לעתים קרובות קשות לשימוש ישיר להפקת דנ"א דיאטומי מכיוון שהן אינן יכולות להרוס את הקליפה הסיליקית של דיאטומים18. לכן, השמדת הקליפה הסיליקית של דיאטומים היא אחת הבעיות הטכניות העיקריות שיש לפתור בחילוץ דנ"א דיאטומי.

יחד עם זאת, מכיוון שמספר הדיאטומים הכלולים בדגימות מחקר פורנזי, בין אם דגימות מים או איברים ורקמות של גופות שטבעו, מוגבל לעתים קרובות, יש צורך להעשיר דיאאטומים. מהות ההעשרה היא הפרדת חומרים. בעת ניסיון לאסוף דיאטומים יחד, למזער את התוכן של רכיבי חומר אחרים (רכיבים מפריעים). בעבודה משפטית, מעבדות משתמשות לעתים קרובות בשיטות העשרת צנטריפוגה או סינון ממברנות כדי להפריד תאים דיאטומים19. עם זאת, מכיוון שציוד שאיבת ואקום אינו בשימוש נרחב, שיטת העשרת הממברנה אינה משמשת לעתים קרובות במעבדות משפטיות ראשוניות רגילות. לכן, שיטת הצנטריפוגה היא עדיין העשרת דיאטום נפוצה במעבדות פורנזיות20.

מיצוי DNA מדיאטומים משמש כיום בעיקר בפרקטיקה משפטית, ויש מגבלות משמעותיות ליישומו. כיום, יש מעט ערכות מיצוי DNA דיאטומי המשמשות במדע פורנזי בשוק והן בדרך כלל יקרות21. מאמר זה מספק שיטת מיצוי DNA דיאטומית משופרת, מה שהופך את מיצוי ה- DNA של דיאטום לפשוט, נוח וחסכוני. זה מגביר את היישום של בדיקות ביולוגיה מולקולרית עוקבות של דיאטומים ויכול לפתור טוב יותר בעיות הקשורות לטביעה ברפואה משפטית באמצעות בדיקות דיאאטומים. שיטה זו שוברת את דפנות התאים הסיליקטיים של דיאטומים על ידי הוספת חרוזי זכוכית וקביעת זמן מתאים למערבולת. בדרך זו, פרוטאינאז K ותמיסת הקישור מפעילים במהירות את התאים ומשביתים אנזימים שונים בתאים. הדנ"א הגנומי נספג בקרום המטריקס בעמודת הספיחה ולבסוף נמהל על ידי חיץ האלוציה. ערכת מיצוי גנים משופרת כזו משפרת את אפקט מיצוי ה- DNA הדיאטום של ערכת הדם בחומרי בדיקה משפטית, מפחיתה את עלות מיצוי ה- DNA הדיאטום בפרקטיקה המשפטית, וניתן ליישם אותה טוב יותר במחקר פורנזי עממי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של היינאן. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה אינן נחשבות למחקרים המערבים נבדקים אנושיים. דגימות אלה הושגו לצורך אבחון פתולוגי פורנזי, והשאר שימשו להפקת DNA דיאטומי בניסוי זה. חוקרים אינם יכולים לזהות בקלות אנשים כדי לקבל הסכמה מדעת מבעלי עניין רלוונטיים.

הערה: כדי להבטיח את התחולה הכללית של שיטת המחקר שדווחה בניסוי זה, ניסוי זה פעל למעשה לפי הוראות ההפעלה של הערכה בה נעשה שימוש, ורק כמה שלבים שונו. דגימות המים ששימשו בניסוי הזה נלקחו באופן אקראי מבריכות ליד המעבדה (איור משלים 1A). בניסוי הזה, רקמת הריאה של הגוף הטבוע אושרה כרקמת המחקר כדי להדגים את פרוטוקול המיצוי (איור משלים 1B). בפרקטיקה המשפטית, לעיתים יש צורך להשתמש גם באיברים ורקמות אחרים של גופות שטבעו (כגון כבד, טחול, כליות, מח עצם וכו ') כדי לחלץ DNA דיאטומים, מה שדורש שיפורים מקבילים קלים לשיטת ניסוי זו, אשר יוסברו בחלק המתאים של הניסוי. דגימות רקמת הריאה ששימשו בניסוי זה הגיעו מגופות שטבעו בבירור במקרים פורנזיים. בדיקות מורפולוגיות נערכו כדי להוכיח שרקמת הריאה מכילה דיאטומים (איור משלים 2).

1. טיפול מקדים בדגימות

  1. טיפול מקדים בדגימות מים
    1. קח דגימת מים של 10 מ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה והצנטריפוגה ב 13,400 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך בזהירות 9.8 מ"ל סופרנאטנט עם אקדח פיפטה, ולהעביר כ-200 מיקרוליטר של דגימת מים דיאטומית מועשרת שנותרה בתחתית לתוך צינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
      הערה: ניתן לבצע תחילה קדם-ניסוי, וניתן להגדיל את הכמות הראשונית אם דגימת מים של 10 מ"ל אינה מספיקה להעשרה.
  2. טיפול מקדים בדגימות רקמה
    1. קח 0.5 גרם מרקמת שולי הריאה מהגוף הטבוע, קצץ או טחן לחלוטין את רקמת הריאה עד שהיא הופכת לבוצית. מניעת זיהום של דיאטומים אקסוגניים היא הליבה של צעד זה. חותכים את הרקמה לחתיכות שוב ושוב באמצעות מספריים.

2. מיצוי DNA

הערה: כל שלבי הצנטריפוגה מתבצעים בטמפרטורת החדר. שימוש בצנטריפוגה שולחנית בעלת כוח צנטריפוגלי של 14,500 x גרם; אמבט מים (או אמבט מתכת) שחומם מראש ל -70 מעלות צלזיוס צריך להיות מוכן לפני תחילת הניסוי. כל השלבים חייבים להקפיד על עקרונות הפעולה האספטית.

  1. הרכבה של דגימות מים ורקמות
    הערה: דגימת מים ושיטת מיצוי DNA דיאטום רקמות זהות.
    1. הוסף חרוזי זכוכית לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל את דגימת המים שטופלה מראש. הפוך 10x-15x כדי לערבב היטב. חרוזי הזכוכית שנוספו מורכבים מחרוזי זכוכית גדולים וקטנים מעורבבים ביחס מסה של 1:1. קוטר חרוזי הזכוכית הגדולים הוא 1.5-2.0 מ"מ וקוטר חרוזי הזכוכית הקטנים הוא 0.4-0.6 מ"מ.
    2. קח 0.5 גרם של רקמה קצוצה דק, להוסיף חרוזי זכוכית לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל המכיל את הרקמה כמתואר לעיל. הפוך 10x-15x כדי לערבב.
  2. הוסף 40 μL של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל) לצינורות. מניחים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, במהלך תקופה זו, הופכים ומערבבים 10x כל 3 דקות.
    הערה: אם הרקמה אינה מתעכלת במלואה, ניתן להגדיל כראוי את כמות הפרוטאינאז K עד שהתמיסה מתבהרת.
  3. מוסיפים 200 μL של חיץ קשירה לצינורות הצנטריפוגה, מערבלים מיד, ומערבבים במשך 4 דקות (תדירות ערבוב תנודה: 3000 סל"ד).
    הערה: בשלב זה, יש לשלוט בקפידה בעוצמת הרעידה ובזמן כדי להבטיח עוצמת ערבוב וזמן מספיקים.
  4. שים את צינורות הצנטריפוגה באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והפתרון הופך ברור.
  5. הוסף 100 μL של isopropanol צינורות צנטריפוגה, מערבולת ומערבבים במשך 15 s, משקעים flocculent עשוי להופיע בשלב זה.
    הערה: חשוב מאוד לערבב היטב עם חוזק מתאים בשלבי הפעולה הנ"ל, אך יש להימנע מטלטול נמרץ כדי למנוע גזירת DNA.
  6. שים את הפתרון שהתקבל בשלב הקודם יחד עם המשקע flocculent לתוך עמודת ספיחה (עמודת ספיחה ממוקם בצינור האיסוף). אורך עמוד הספיחה הוא 3.0 ס"מ, הקוטר 1.0 ס"מ, ומטריצת הספיחה היא קרום מטריצת סיליקון.
  7. צנטריפוגה בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 30 שניות, יש להשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף ולהחזיר את עמוד הספיחה לצינור האיסוף.
  8. הוסף 500 μL של מאגר להסרת מעכבים לעמודת הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
  9. הוסיפו 700 מיקרוליטר של חיץ כביסה לעמוד הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
    הערה: יש להוסיף את הכמות שצוינה של אתנול מוחלט לבקבוק חיץ הכביסה לפני השימוש הראשון.
  10. הוסף 500 μL של חיץ כביסה לעמוד הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
  11. החזירו את עמודת הספיחה לצינור האיסוף הריק. צנטריפוגה של 14,500 x גרם למשך 2 דקות, והסר את מאגר הכביסה ככל האפשר, כדי למנוע משאריות האתנול במאגר הכביסה לעכב תגובות במורד הזרם.
  12. מוציאים את עמוד הספיחה ומכניסים אותו לצינור צנטריפוגה נקי. הוסף 100 μL של חיץ elution לחלק האמצעי של קרום הספיחה.
  13. מניחים את עמוד הספיחה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות, ואת הצנטריפוגה על 13,400 x גרם למשך דקה אחת.
  14. הוסף שוב את התמיסה שהושגה בשלב הקודם לעמודת הספיחה הצנטריפוגלית. מניחים את עמוד הספיחה הצנטריפוגלי בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ואת הצנטריפוגה על 13,400 x גרם למשך דקה אחת.
    הערה: יש לחמם מראש את חיץ האלוציה באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך כ-10 דקות. נפח elution לא צריך להיות פחות מ 50 μL; אחרת, תפוקת הדנ"א תפחת.
  15. אחסן את ה- DNA הדיאטום שחולץ ב- 2-8 ° C לשימוש עתידי. אם תמיסת ה- DNA אמורה להיות מאוחסנת במשך זמן רב, אחסן אותה ב -20 מעלות צלזיוס.

3. בדיקת PCR

הערה: מאחר שתכולת הדיאטומים בדגימות פורנזיות היא לעתים קרובות נמוכה, תמציות דגימות הרקמה של הגופות הטבועות עשויות להכיל גם דרגות שונות של רקמות ואיברים (כגון הריאות בניסוי זה) עם דנ"א משלהם. לכן, זיהוי ישיר של סך כל הדנ"א בתמציות דנ"א אינו משקף את המצב של מיצוי דנ"א דיאטומי. בניסוי זה נבחרו פריימרים ספציפיים לדיאטומים, ומוצרי PCR שימשו להערכת מיצוי הדנ"א הדיאטום בתמצית. המוצרים ניתן לצפות ולנתח על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose והוא יכול גם להיות מנותח על ידי עקומת התכה PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת, אשר יש רגישות גבוהה יותר.

  1. הוסף 2 μL של ה- DNA המופק מדגימות מים ורקמות כתבנית. בחר אחת משתי השיטות הבאות לבדיקה.
  2. בדיקת PCR קונבנציונלית
    1. השתמש פריימרים22 שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S. לקבלת פרטים, ראה טבלה 1.
    2. לקבוע את מערכת תגובת ה-PCR ואת תנאי ההגברה בהתאם למאפייני הפריימרים. לפרטים, ראו טבלה 2.
    3. הפעל את המוצרים של הגברת PCR על ג'ל אגרוז 2%. התבונן ונתח את ההדמיה עם imager ג'ל.
  3. בדיקת PCR כמותית פלואורסצנטית
    1. השתמש בפריימרים לעיל שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S כדי להכין מערכת תגובת PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת. לפרטים, ראו טבלה 3.
    2. בצע הגברה PCR ונתח את עקומת ההגברה המתקבלת ואת ערכי Ct. במקביל, הגדר תוכנית, התיך את הגדילים הכפולים של המוצרים המוגברים לגדילים בודדים בהדרגה באמצעות טכנולוגיית עקומת התכה PCR כמותית פלואורסצנטית, ולאחר מכן נתח את עקומות ההתכה המתקבלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מכיוון שתמיסת הדנ"א המופקת בשיטת מיצוי הדנ"א הנהוגה כיום מכילה את כל רכיבי הדנ"א ממקורות שונים בדגימה, הדנ"א המתקבל בפרוטוקול זה לא היה יוצא מן הכלל. לכן, פתרון הדנ"א לא היה רק פתרון של דנ"א גנומי דיאטומי. הפריימרים שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S נבחרו על ידי עיון בספרות 22,23,24. הפריימרים אומתו על ידי NCBI-Blast Primer, והתוצאות הראו כי הפריימר הקדמי D512 והפריימר ההפוך D978 של 18S rDNA היו פריימרים ספציפיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תאי דיאטום מוגנים על ידי דפנות תאים סיליקיות קשות17, ויש להרוס מבנה זה כדי לחלץ דנ"א דיאטומי. ערכות רגילות אינן הורסות בקלות את הקליפה הסיליקית של דיאטומים; לכן קשה לחלץ בהצלחה DNA דיאטום21. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת מיצוי הדנ"א בדם הנפוצה ביותר, והוסיפה חרוזי זכוכית בקטרים שונים ויחס מסה שונה בתהליך מיצוי הדיאטומים. תנודת מערבולת מתבצעת בו זמנית, אשר יכול לשבור באופן מלא את קליפת diatom ולשפר את אפקט מיצוי DNA diatom. כפי שהוצג בדו"ח הקודם21, קוטר ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82060341,81560304) ועל ידי פרויקט המחקר המדעי של פלטפורמת החדשנות האקדמית של מחוז האינאן (YSPTZX202134).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מאגר מחייבBioTekeB010006022תאים ליזים במהירות
ChemoHS qPCR MixMonad00007547-120506qPCR Mix
D2000 סולם DNAבזמנים אמיתיים (בייג'ינג) ביוטכנולוגיהRTM415מדוד את המיקום של להקות אלקטרופורטיות
D512Taihe ביוטכנולוגיהTW21109196פריימר פורוורד
D978Taihe ביוטכנולוגיהTW21109197פריימר הפוך
מאגר אלוטיוןBioTekeB010006022מאגר פליטה דל מלח שוטף את חרוז זכוכית ה-DNA
Yingxu מכונות כימיות (שנחאי) 70181000חרוזי זכוכית מיוחדים לפיזור וטחינה
יבוא עמוד ספיחהBioTekeB2008006022עמודת ספיחה עם קרום מטריצת סיליקה
מאגר להסרת מעכבBioTekeB010006022הסרת מעכבים במיצוי DNA
איזופרופנולBioTekeB010006022לזרז או לבודד DNA
MIX-30S מיני מיקסרMiulabMUC881206 פעולה תנודתית
Proteinase KBioTekeB010006022השבתת נוקלאזות תוך-תאיות וחלבונים אחרים
Rotor-Gene Q 5plex HRMQiagenR1116175כימות פלואורסצנטי בזמן אמת PCR
מהירות מיקרו-צנטריפוגהScilogex9013001121צנטריפוגה
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455הדמיית ג'ל
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Aמאגר שטיפת PCR רגיל
BioTekeB010006022להסיר זיהומים כגון מטבוליטים של תאים

מקורות

  1. Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
  2. Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458(2022).
  3. Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
  4. Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241(2017).
  5. Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059(2022).
  6. Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
  7. Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983(2021).
  8. Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
  9. Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
  10. Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
  11. Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
  12. Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
  13. Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
  14. Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008(2021).
  15. Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
  16. Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
  17. Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
  18. Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681(2021).
  19. Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
  20. Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
  21. Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
  22. Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
  23. Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
  24. Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
  25. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  26. Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
  27. Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097(2019).
  28. Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
  29. Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398(2017).
  30. Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
  31. Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145(2020).
  32. Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
  33. Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNAProteinase KPCR
מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.