הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65795

⸱

15 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג פרוטוקול שבו משולבים כלים ביואינפורמטיים מרובים כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של TMEM200A בסרטן. בנוסף, אנו גם מאמתים באופן ניסיוני את תחזיות הביואינפורמטיקה.

תקציר

החלבון הטרנסממברנלי, TMEM200A, ידוע כקשור לסרטן אנושי ולחדירה חיסונית. כאן, הערכנו את הפונקציה של TMEM200A בסוגי סרטן נפוצים על ידי ניתוח מולטיומיקס והשתמשנו בתרביות תאי מבחנה של תאי קיבה כדי לאמת את התוצאות. ביטוי TMEM200A במספר סוגי סרטן בבני אדם הוערך באמצעות נתוני RNA-seq ממסד הנתונים UCSC Xena. ניתוח ביואינפורמטי גילה תפקיד פוטנציאלי של TMEM200A כסמן ביולוגי אבחוני ופרוגנוסטי.

תרביות של קווי תאי קיבה וסרטן תקינים גדלו TMEM200A הופל. רמות הביטוי של TMEM200A נמדדו באמצעות תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז וכתמים מערביים. לאחר מכן נעשה שימוש במחקרי אובדן תפקוד במבחנה כדי לקבוע את תפקידי TMEM200A בהתנהגות הממאירה ובהיווצרות הגידול של תאי סרטן הקיבה (GC). כתמים מערביים שימשו להערכת ההשפעה של ההפלה על מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) ומסלול איתות PI3K/AKT ב- GC. ניתוח ביואינפורמטי הראה כי TMEM200A באה לידי ביטוי ברמות גבוהות ב- GC.

התפשטות תאי GC עוכבה על ידי TMEM200A knockdown, אשר גם הפחיתה וימנטין, N-cadherin, וחלבוני Snai, ועיכבה זרחן AKT. נראה כי מסלול האיתות PI3K/AKT מעורב גם ברגולציה בתיווך TMEM200A של פיתוח GC. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך TMEM200A מסדיר את המיקרו-סביבה של הגידול על ידי השפעה על החובש. TMEM200A עשוי להשפיע גם על EMT באמצעות איתות PI3K/AKT, ובכך להשפיע על המיקרו-סביבה של הגידול. לכן, בפאן סרטן, במיוחד GC, TMEM200A עשוי להיות סמן ביולוגי פוטנציאלי אונקוגן.

מבוא

מחלת הסרטן התגלתה כבעיה מתמשכת בתחום בריאות הציבור המסכנת את בריאות האדם בעולם1בשל שיעורי התחלואה והתמותה הגבוהים ברחבי העולם, ומהווה נטל כלכלי ורפואי כבד על החברה2. התקדמות משמעותית בטיפול בסרטן הושגה בשנים האחרונות הודות לגילוי סמני סרטן3, וחוקרים פיתחו שיטות אבחון חדשניות ותרופות חדשות לטיפול בסרטן. עם זאת, לחלק מהחולים עם סרטן עדיין יש פרוגנוזות גרועות בגלל גורמים כגון עמידות לתרופות, תופעות לוואי של תרופות ורגישות כימית4. לכן, יש צורך דחוף בזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים לבדיקות סקר וטיפול בסרטן בשלב מוקדם5.

חלבוני ממברנה הם חלבונים שיכולים להיקשר ולהשתלב בתאים ובקרומי אברונים6. ניתן לקבץ אותם לשלוש קטגוריות בהתאם לחוזק הקשירה לממברנה ומיקומם: חלבונים מעוגני שומנים, חלבונים אינטגרליים וחלבוני קרום היקפי 7,8. חלבון טרנסממברנה (TMEM) הוא חלבון קרום אינטגרלי המורכב לפחות מקטע טרנסממברנהאחד 9, העובר באופן מלא או חלקי דרך הממברנה הביולוגית.

למרות שמנגנוני הפעולה של חלבונים השייכים למשפחת TMEM אינם מובנים היטב, חלבונים אלה ידועים כמעורבים במספר סוגים של סרטן10. מספר חלבוני TMEM קשורים לפנוטיפים נודדים, מתרבים ופולשניים, והביטוי שלהם קשור לעתים קרובות לפרוגנוזה של המטופל11. לכן, בני משפחת TMEM הפכו למטרה למחקר. סקירה מקיפה של דיווחים קיימים על TMEM גילתה כי הם קשורים בעיקר לאיתות בין-תאיותוך-תאי 12, מחלות הקשורות למערכת החיסון וגידולים10. ל-TMEMs רבים יש גם פונקציות פיזיולוגיות חשובות, לדוגמה, תעלות יונים בקרום הפלזמה, הפעלת מסלולי העברת אותות, כמו גם תיווך של כימוטקסיס של תאים, הידבקות, אפופטוזיס ואוטופגיה10. לכן, שיערנו כי חלבוני TMEM עשויים להיות סמנים פרוגנוסטיים חשובים בגילוי וטיפול בגידולים.

ביטוי TMEM200A מוגבר באופן משמעותי בסרטן קיבה (GC). ביטוי גבוה יותר של TMEM200A13, שיש לו שמונה אקסונים ואורך מלא של 77.536 קילו-בתים בכרומוזום 6q23.1, נקשר לפרוגנוזה גרועה להישרדות כוללת (OS) במקרים של GC. עם זאת, השינויים בביטויו כמעט ולא דווחו במחקרים אונקולוגיים. מאמר זה משווה ומנתח את התועלת של TMEM200A כמטרה טיפולית וכסמן אבחוני גידול במחקרי סרטן שונים באמצעות מערכי נתונים שונים הזמינים לציבור. הערכנו את היעילות של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן סרטני אבחוני ופרוגנוסטי וכן את רמות הביטוי שלו בסוגי סרטן שונים בבני אדם באמצעות נתוני RNA-seq ממסדי הנתונים UCSC Xena ו-TCGA, כמו גם על ידי תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qRT-PCR) וכתמים מערביים.

ההשפעה של רמות ביטוי TMEM200A על שיעורי מוטציות, תהליכי ויסות, אבחון ופרוגנוזה של גידולים, חדירה חיסונית ואימונותרפיה נחקרה עוד יותר באמצעות שילוב של כלים חישוביים ואתרי מערכי נתונים. CBioPortal וקטלוג המוטציות הסומטיות בתאי סרטן (COSMIC) שימשו לבחינת מוטציות בשנת TMEM200A. אתרי האינטרנט Sangerbox ו-TISIDB שימשו כדי להבין כיצד TMEM200A משפיע על חדירה חיסונית. הכלי המקוון TISCH (Tumor Immune Single Cell Center) ומסד הנתונים CancerSEA שימשו לחקר תפקודו של TMEM200A. לבסוף, כדי להעריך את ההשפעה של TMEM200A על ההתנהגות הממאירה ותפקוד התפתחות הגידול של תאי GC, נערך ניסוי אובדן תפקוד במבחנה . בנוסף, בוצעה כתם מערבי כדי להעריך כיצד הפלה TMEM200A השפיעה על מסלול האיתות PI3K/AKT ועל המעבר האפיתל-מזנכימלי (EMT) ב- GC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מאגר המידע של אטלס גנום הסרטן (TCGA)

הערה: מסד הנתונים אטלס גנום הסרטן (TCGA) מכיל את נתוני הריצוף של גנים ברקמות גידול שונות14. נתוני RNA-seq ב- TCGA לחקר פורמטים של TMEM200A תעתיקים לחלק למיליון (TPM) חולצו מאתר UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) ו- log2 שהומר להשוואת ביטויים בין דגימות.

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UCSC Xena .
  2. לחץ על הכרטיסייה Launch Xena .
  3. לחץ על הכרטיסייה ערכות נתונים בחלק העליון של המסך.
  4. מתוך 129 קבוצות ו-1,571 מערכי נתונים בדף זה, לחץ על הכרטיסייה עבור סך של 33 סוגי סרטן כגון GDC TCGA לוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) ועוד.
  5. מתפריט RNAseq של ביטוי גנים , בחר ולחץ על הכרטיסייה HTSeq - FPKM GDC Hub .
    הערה: HTSeq - FPKM GDC Hub מייצג נתונים שתוקנו בהסכמה.
  6. מתפריט ההורדה , לחץ על הקישור המתאים שלו.
    הערה: בשיטה הנ"ל, נתוני RNA-Seq הורדו עבור 33 סוגי סרטן שונים.
  7. לפרוק את ארכיון zip של נתוני RNA-seq עבור 33 סוגי סרטן שונים בקובץ יחיד בתיקיית שולחן העבודה של המחשב.
  8. אחד את קובצי txt הלא דחוסים באותה תיקייה ומקם את סקריפטי Perl בתיקייה זו.
  9. פתח את תוכנת Perl, העתק והדבק את נתיב התיקיה לתוכנת Perl שבה ממוקם סמן העכבר, הקש על מקש Enter, הזן את שם קוד Perl ואת שם הגן (TMEM200A) ולאחר מכן הקש על מקש Enter כדי לקבל קובץ txt חדש(singleGeneExp.txt).
    הערה: קובץ txt חדש זה (singleGeneExp.txt) מכיל ביטוי גנים של TMEM200A ב-33 סוגי סרטן בחולים שונים.
  10. פתח את קוד R (diffR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ singleGeneExp.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  11. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שהשתנה (diffR) וצייר את התמונה באמצעות חבילת "ggpubr".

2. מסד הנתונים TIMER2.0

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של מסד הנתונים TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 16.
  2. לחץ על הכרטיסיה חקר הסרטן.
  3. הזן את מזהה הגן (TMEM200A) בתיבת החיפוש ולחץ על הכרטיסיה שלח כדי לקבל את תמונות הביטוי הדיפרנציאלי של TMEM200A בסוגים שונים של גידולים.

3. אטלס חלבונים אנושי (HPA)

  1. עבור אל אטלס החלבונים האנושי (HPA) (www.proteinatlas.org ) 17ממשק אינטרנט.
  2. הקלד מזהה (TMEM200A) בתיבת החיפוש ולחץ על לחצן חיפוש . בחר TISSUE sub-atlas.
  3. רחף מעל הדף וגלול מטה כדי למצוא את הכרטיסיה סקירה כללית של ביטוי חלבון .
    הערה: המקטע סקירה כללית של ביטוי חלבונים מציג את רמות ביטוי החלבון של TMEM200A ב-45 איברים בגוף האדם.

4. מערך פלטפורמת מתילציית DNA של HumanMethylation450 Illumina Infinium

הערה: מערך פלטפורמת מתילציית DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium שימש לאיסוף נתונים על מתילציה. אנו יכולים להעריך את רמות המתילציה של TMEM200A דנ"א באמצעות מסד הנתונים SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. עבור אל ממשק אתר SMART .
  2. הזן את מזהה הגן (TMEM200A) בתיבת החיפוש כדי לקבל את התפלגות TMEM200A בכרומוזומים ואת רמת המתילציה של TMEM200A בסוגים שונים של ממאירויות.
  3. גלול מטה בדף לתפריט לחץ כדי לבדוק מתילציה מצטברת של CpG ולחץ על עלילה לחצן. בתחתית הדף, מצא ולחץ על כפתור הורד איור . הורד את האיור.

5. מסד הנתונים של UALCAN

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UALCAN .
    הערה: תרשימי קופסאות של רמות המתילציה של מקדם TMEM200A בממאירויות שונות נוצרו באמצעות מסד הנתונים של UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. בחלק העליון של הדף, לחץ על כפתור TCGA .
  3. הזן TMEM200A בתיבת הקלט Gene ID על המסך. בתפריט ערכת הנתונים של TCGA , גלול מטה ובחר את סוג הסרטן שיש לבצע שאילתה.
  4. לאחר לחיצה על כפתור Explore , לחץ על ניתוח תת הקבוצה שלה מתילציה בתפריט קישורים לניתוח כדי לקבל את תוצאות המתילציה של גידול זה.
    הערה: בשיטה זו השגנו תוצאות מתילציה עבור 22 גידולים במסד הנתונים של UALCAN .

6. קטלוג מוטציות סומטיות בתאים סרטניים (מאגר מידע קוסמי)

  1. עבור לממשק האתר קטלוג מוטציות סומטיות בתאים סרטניים (קוסמי).
    הערה: נתונים על קידוד מוטציות, סידורים גנומיים מוטנטיים לא מקודדים וגני היתוך בגנום האנושי זמינים בקטלוג של מוטציות סומטיות בתאי סרטן (COSMIC) מסד נתונים20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), המשמש גם לקביעת התדירות של מוטציות TMEM200A שונות בסוגי סרטן שונים.
  2. הזן את מזהה הגן (TMEM200A) בתיבת החיפוש ולחץ על לחצן חיפוש כדי לעבור למסך חדש.
  3. בתפריט גנים , אתר ולחץ על הקישור שבו מופיע שם מזהה הגן של TMEM200A .
  4. מצא את עמודת קיבוץ הפצת המוטציות בדף החדש כדי לקבל את מצב המוטציה של TMEM200A בגידול.

7. CBioPortal

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של CBioPortal .
    הערה: ניתן למצוא, להוריד, לנתח ולהמחיש נתונים גנומיים של סרטן באמצעות מסד הנתונים cBioPortal (www.cioportal.org). מוטציות סומטיות, שינויים במספר העתקי DNA (CNAs), ביטוי mRNA ומיקרו-רנ"א (miRNA), מתילציה של DNA, שפע חלבונים ושפע פוספופרוטאין הם רק חלק מסוגי הנתונים הגנומיים המשולבים על ידי cBioPortal21. עם cBioPortal, ניתן לבצע מגוון רחב של מחקרים; עם זאת, הדגש העיקרי הוא על ניתוחים שונים הקשורים מוטציות ויזואליזציה שלהם.
  2. בחר את ערכת הנתונים Pan-cancer Analysis of whole genomes מתוך תת-הסעיף PanCancer Studies בסעיף Select Studies for Visualization & Analysis (בחר מחקרים להדמיה וניתוח ). לאחר מכן, לחץ על לחצן שאילתה לפי גן .
  3. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח שאילתה .
  4. לחץ על סוג סרטן מפורט כפתור בחלק העליון של הדף כדי לקבל את המוטציות של TMEM200A בסוגים שונים של סרטן.

8. כלי Sangerbox 3.0

  1. עבור אל ממשק הכלי Sangerbox 3.0 .
    הערה: המתאם של ביטוי TMEM200A עם תאים חודרים למערכת החיסון, חומרים מדכאי חיסון, גורמים אימונוסטימולטוריים ומולקולות MHC (קומפלקס היסטותאימות עיקרי) בכל סוגי הסרטן נותח על ידי חדירת מערכת החיסון CIBERSORT באמצעות נתוני חדירת החיסון הפאן-סרטנית בכלי Sangerbox 3.022 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. מסרגל הכלים בצד שמאל של הדף, בחר ולחץ על הכרטיסייה ניתוח אימונותאי (CIBERSORT) מתפריט ניתוח פאן-סרטן .
  3. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח .

9. מסד נתונים TISIDB

  1. עבור אל ממשק אתר TISIDB .
    הערה: מסד הנתונים TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) שימש לבחינת המתאם של ביטוי TMEM200A עם תאים חודרים למערכת החיסון, חומרים מדכאי חיסון, גורמים אימונוסטימולטוריים ומולקולות MHC בסוגי סרטן שונים.
  2. הזן את סמל גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח .
  3. לחץ על הסעיפים לימפוציטים, אימונומודולטורים, כימוקינים ותת-סוג בראש הדף. הורד את התמונות הרלוונטיות בתחתית העמוד.

10. מסד הנתונים של TIDE

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של TIDE .
    הערה: מסד הנתונים TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) שימש להערכת הפוטנציאל של TMEM200A כסמן ביולוגי לחיזוי תגובה לטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות של גידול.
  2. הזן את כתובת הדוא"ל במסך הראשוני כדי לרשום את החשבון ולהיכנס.
  3. מצא את תת-הסעיף הערכת סמן ביולוגי בראש הדף ולחץ עליו.
  4. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה עבור הזן גנים בתחתית הדף. לאחר מכן, לחץ על שלח לחצן.
  5. בדף, גרור את העכבר כדי להחליק את הדף כלפי מטה כדי למצוא את תוצאות הניתוח.

11. מאגר המידע של CancerSEA

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של CancerSEA .
    הערה: באמצעות נתוני ריצוף של תא בודד נחקרו הקשרים בין ביטוי TMEM200A לבין המצב התפקודי של תאי גידול שונים. זה נעשה באמצעות מסד הנתונים CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. בחלק העליון של הדף, מצא ולחץ על הכרטיסייה חיפוש .
  3. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן שלח .

12. כלי הרשת TISCH (ראשי תיבות של Tumor Immune One-Cell Center)

  1. עבור אל ממשק כלי הרשת TISCH (ראשי תיבות של tumor immune single-cell center).
    הערה: המתאם בין רמות הביטוי של תאי TMEM200A לתאים סרטניים הודגם גם על ידי שימוש בכלי הרשת TISCH (Immune Single Cell Center)25.
  2. הזן את מזהה גן היעד (TMEM200A) בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על הלחצן חקור .
  3. בתפריט סוג סרטן בדף זה, בחר ולחץ על ערכת הנתונים של כל סוגי הסרטן . לאחר מכן, גלול מטה בדף ולחץ על לחצן חיפוש .

13. GeneMANIA

  1. עבור אל ממשק אתר GeneMANIA .
    הערה: המתאם בין TMEM200A לבין הגנים הרלוונטיים מבחינה תפקודית שלו נחזה באמצעות אסטרטגיית האינטגרציה עבור רשת מרובת אסוציאציות גנים אתר GeneMANIA (www.genemania.org)26 לבניית רשתות אינטראקציה בין גנים (GGI).
  2. בתיבת החיפוש בפינה הימנית העליונה של הדף, הזן את מזהה הגן (TMEM200A) ולחץ על כלי חיפוש.
    הערה: כלי האינטרנט GeneMANIA שימש למציאת 20 גנים הקשורים TMEM200A.

14. ניתוח העשרה תפקודית

  1. שמור את מזהי הסמלים של הגנים לניתוח להעשרה בתבנית קובץ txt.
  2. פתח את קוד R (symbolidR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ txt לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  3. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (symbolidR). המר את מזהי הסמלים של גנים אלה ל- entrezIDs באמצעות "org. חבילת Hs.eg.db אינץ'. קבל את קובץ id.txt .
  4. פתח את קוד R (GOR ו- KEGGR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ id.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  5. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (GOR ו- KEGGR). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, נתח גנים אלה להעשרת GO ו- KEGG על ידי החבילות "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db", ו "enrichplot" ו plot את תוצאות העשרה באמצעות החבילה "gglot2".

15. ניתוח ההבדלים בפעילות הגנים

הערה: ניקוד TMEM200A בכל דגימת סרטן חושב באמצעות ssGSEA (Single sample gene set enrichment analysis)27, וניתוח דיפרנציאלי של פעילות גנים TMEM200A ברקמות סרטניות ובריאות בוצע עבור סוגי סרטן שונים.

  1. בהתבסס על נתוני RNA-seq של 33 סוגי גידולים שהורדו בשלב 1.7, פתח את כל הקבצים שהורדו ומקם אותם בתיקיה מאוחדת.
  2. מקם את קובץ merge.txt בתיקייה לעיל.
    הערה: הנתונים בקובץ merge.txt מ- BioWolf (www.biowolf.cn) מכילים ביטוי גנים לכל החולים בכל הגידולים במסד הנתונים אטלס גנום הסרטן (TCGA).
  3. פתח את קוד R (ssGSEAR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  4. קח את השורה שבה geneName נמצא בקוד R (ssGSEAR) והזן את מזהה הגן (TMEM200A).
  5. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (ssGSEAR). קבל את קובץ הניקוד עבור פעילות גנים: scores.txt.
    הערה: בעזרת אלגוריתם ssGSEA אנו בונים תחילה קובץ קבוצת גנים המבוסס על מקדמי המתאם בין גנים בהתאם לנתונים המסופקים בקובץ merge.txt ומזהים את הגנים בעלי מתאם גבוה יותר עם גן המטרה (TMEM200A) מהקובץ. לאחר מכן, הגנים בעלי המתאם הגבוה יותר מאוחדים כגנים הפעילים של TMEM200A, ולבסוף, אנו מקבלים את הניקוד של גנים פעילים בכל דגימה.
  6. פתח את קוד R (scoreDiffR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ scores.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  7. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שהשתנה (scoreDiffR) וצייר את התמונה באמצעות חבילות "plyr", "reshape2" ו- "ggpubr".

16. מתאם קליני וניתוח פרוגנוזה הישרדותית

  1. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UCSC Xena .
  2. לחץ על הכרטיסיה הפעל את זנה .
  3. לחץ על הכרטיסייה ערכות נתונים בחלק העליון של המסך.
  4. רחף מעל הדף וגלול מטה כדי למצוא את הכרטיסיה TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. מתוך 129 קבוצות עוקבות ו- 1,571 ערכות נתונים בדף זה, לחץ על הכרטיסייה TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. מתפריט הפנוטיפ , בחר ולחץ על הכרטיסייה נתונים קליניים אוצרים.
  7. מתפריט ההורדה , לחץ על הקישור המתאים שלו.
    הערה: הורד נתונים קליניים עבור 33 סוגי סרטן ממסד הנתונים של TCGA בקישור לעיל.
  8. חלץ את קובץ הנתונים הקליניים שהורדת ופתח את הקובץ הלא דחוס בתבנית הקובץ xls.
  9. ארגן ושמור את הנתונים הקליניים הדרושים (שלב, גיל, שלב פתולוגי וסטטוס מטופל) בקובץ, מחק את הנתונים הקליניים הנותרים שאינם נחוצים ושמור את הקובץ כולו כקובץ בפורמט txt לאחר שינוי שמו לקליני.
  10. בהתבסס על singleGeneExp.txt שהושג בשלב 1.9, מקם קובץ זה באותה תיקיה שבה נמצא קובץ clinical.txt המאורגן.
  11. חלץ את דחיסת הנתונים הקליניים שהורדו ומקם את קבצי singleGeneExp.txt ו- clinical.txt באותה תיקיה שבה נמצאים הקבצים הקליניים הלא דחוסים.
  12. פתח את קוד R (clinicalDiffR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  13. פתח את תוכנת R, הפעל את קוד R שונה (clinicalDiffR), וצייר את התמונה באמצעות חבילת "ggpubr".
  14. עבור אל ממשק אתר האינטרנט של UCSC Xena .
  15. לחץ על הכרטיסיה הפעל את זנה .
  16. לחץ על הכרטיסייה ערכות נתונים בחלק העליון של המסך.
  17. מתוך 129 קבוצות ו-1,571 מערכי נתונים בדף זה, לחץ על הכרטיסייה עבור סך של 33 סוגי סרטן כגון GDC TCGA לוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML), GDC TCGA Adrenocortical Cancer (ACC), GDC TCGA Bile Duct Cancer (CHOL) ועוד.
  18. מתפריט הפנוטיפ , בחר ולחץ על הכרטיסייה נתוני הישרדות.
  19. מתפריט ההורדה , לחץ על הקישור המתאים שלו.
  20. פרוק את ארכיון ה- zip של נתוני הישרדות עבור 33 סוגי סרטן שונים בקובץ יחיד בתיקיית שולחן העבודה של המחשב.
  21. מקם את נתוני ההישרדות הלא דחוסים באותה תיקיה שבה נמצא קובץ singleGeneExp.txt שהתקבל בשלב 1.9.
  22. פתח את קוד R (preOSR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  23. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (preOSR). חשב באמצעות חבילת "לימה" כדי לקבל קובץ נתונים על הישרדות TMEM200A בסרטן פאן: expTime.txt.
  24. פתח את קוד R (OSR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ expTime.txt לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  25. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R (OSR) שהשתנה. בצע ניתוח KM באמצעות חבילות "הישרדות" ו- "survminer" בהתבסס על הנתונים בקובץ expTime.txt והתווה את עקומות ההישרדות עבור TMEM200A בסרטן פאן.

17. ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתנים של קוקס עם בניית חלקות יער

  1. פתח את קוד R (COXR) והעתק והדבק את הנתיב שבו קיבלנו את קובץ expTime.txt מ 16.23 ממוקם לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  2. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (COXR). בהתבסס על הנתונים בקובץ expTime.txt , בצע ניתוחי רגרסיה COX חד-משתניים באמצעות חבילות "הישרדות", "survminer" ו- "forestplot" כדי לשרטט חלקת יער חד-משתנית של TMEM200A בסוגי סרטן שונים.
  3. מקם את קובץ expTime.txt משלב 16.23 ואת קובץ clinical.txt משלב 16.10 באותה תיקיה.
  4. פתח את קוד R (multicoxR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקמת התיקיה המכילה את קובץ expTime.txt משלב 16.23 וקובץ clinical.txt משלב 16.10 לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  5. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (multicoxR). בצע ניתוח רגרסיה COX רב-משתני באמצעות חבילות "הישרדות" ו"survminer" כדי לשרטט חלקת יער רב-משתנית של TMEM200A בסוגי סרטן שונים בהתבסס על הנתונים בקבצי expTime.txt ו- clinical.txt .

18. מודל פרוגנוסטי של סרטן קיבה המבוסס על ביטוי TMEM200A ומאפיינים קליניים

  1. מקם את קובץ clinical.txt משלב 16.10 ואת קובץ expTime.txt משלב 16.23 באותה תיקיה.
  2. פתח את קוד R (NomoR) והעתק והדבק את הנתיב שבו ממוקם קובץ txt לעיל לשורה שבה setwd ממוקם בקוד R.
  3. פתח את תוכנת R והפעל את קוד R שהשתנה (NomoR). השתמש בחבילות התוכנה "הישרדות", "regplot" ו- "rms" עבור נתוני ביטוי TMEM200A ב- GC ונתונים קליניים כדי לבנות מודל פרוגנוסטי לחיזוי הישרדות המטופל.

19. תרבית תאים והעברת siRNA של TMEM200A

הערה: תאי STAD HGC-27 אנושיים, תאי SGC-7901 ותאי אפיתל רירית קיבה אנושית GES-1 הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת החומרים), קמו לתחייה, חוסנו במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 מדיום שלם (המכיל 10% נסיוב בקר עוברי בילוד ותערובת פניצילין 1%), וגודלו בתרבית ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור תרביות תאים. מדיום התרבות הוחלף כל 2-3 ימים. התאים במצב גדילה טוב חוסנו בלוחות של שש בארות לפי (2-3) × 105 תאים לכל באר.

  1. ראשית, קח שלושה צינורות מיקרוצנטריפוגות והוסף 8 μL של מגיב transfection (ראה Tמסוגל של חומרים) ו 200 μL של תווך בסיסי לכל צינור. לאחר מכן, הוסף 4 מיקרוגרם של SiRNA1, SiRNA2 ו - SiRNA3 לכל צינור בהתאמה.
    הערה: עבור הפלת TMEM200A , siRNA תוכנן ונרכש (ראה טבלת חומרים).
  2. מערבבים היטב את התערובת בשלושת צינורות המיקרוצנטריפוגות ומוסיפים לכל אחת משלוש הבארות של צלחת 6 הקידוחים. נערו בעדינות את צלחת 6 הבארות כדי לפזר את התערובת באופן שווה. תייגו את שלוש הבארות שבהן נוספה התערובת כ-SiRNA-1, SiRNA-2 ו-SiRNA-3.
  3. כאשר התאים מודגרים במשך 4-6 שעות, יש להחליף מחצית מהתווך בשלוש בארות המשנה בלוח 6 הקידוחים.
    הערה: בעת החלפת מחצית המדיום השלם, יש לשאוף מחצית מהמדיום המלא המקורי ולחדש עם מחצית מהמדיום השלם הטרי.
  4. עשרים וארבע עד 48 שעות מאוחר יותר, השתמשו TMEM200A תאים נגועים ב-siRNA כקבוצת הניסוי ובתאים לא נגועים כקבוצת הביקורת השלילית. בצע תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qRT-PCR, ראה סעיף 20) כדי להעריך את השפעת הטרנספקציה על התאים.

20. תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז

  1. השליכו את מדיום תרבית התאים בכל תת-קבוצה ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
  2. בודדו את סך כל הרנ"א באמצעות ערכת בידוד RNA (ראו טבלת חומרים).
  3. להעריך את ריכוז הרנ"א ולסנתז cDNA עם 1 מיקרוגרם RNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA, בהתאם להוראות היצרן.
  4. בצע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) על דילולים פי 10 של cDNA בתערובת תגובה של 10 μL, כולל פריימרים ספציפיים לבני אדם קדימה ואחורה עבור GAPDH (לתקינה), TMEM200A (ראה טבלת חומרים) ו- qPCR Master Mix, באמצעות מערכת בדיקת PCR בזמן אמת.
    הערה: בצע כל ניסוי בשלשה.
  5. השתמש בתנאי התגובה הבאים של qPCR: אתחול, 95 °C למשך 3 דקות; דנטורציה, 95 °C עבור 10 שניות; חישול, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; והארכה, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; חזור על הדנטורציה, החישול וההרחבה 40x. לקבוע את הביטוי היחסי של כל גן באמצעות טכניקת 2-ΔΔCt 28.
  6. חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג טריפליקטים ביולוגיים.

21. זיהוי כתם מערבי של ביטוי חלבוני רלוונטי

  1. השליכו את מדיום תרבית התאים בכל תת-קבוצה ושטפו בעדינות את התאים עם 2 x 1 מ"ל של PBS.
  2. קררו את צלחות 6 הבארות המכילות את התאים על קרח והוסיפו 150 מיקרוליטר של חיץ ליזיס מסוג RIPA (150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 וקוקטייל מעכב פרוטאז טרי שנוסף). הניחו לליזיס להמשיך על קרח במשך 10 דקות.
  3. באמצעות מגרד תאי פלסטיק, מוציאים תאים נצמדים מהצלחת ומעבירים בעדינות את תמיסת התא לצינור מיקרוצנטריפוגה שמקורר מראש.
  4. צנטריפוגה התא lysate במשך 10 דקות ב 1.5 × 104 גרם ב 4 °C. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  5. השתמש בערכת בדיקת חלבון BCA כדי לקבוע את תכולת החלבון בהתאם להוראות היצרן.
  6. טען 30 גרם חלבון מכל דגימה על ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל פוליאקרילאמיד 10% נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE) והפעל במתח של 80 וולט במשך 0.5 שעות ולאחר מכן 1.5 שעות ב- 120 וולט.
  7. מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) 45 מיקרומטר במתח של 300 mA למשך 1-1.5 שעות.
  8. לאחר הנחת קרום PVDF על שייקר וניעור במשך 3 x 5 דקות, הוסף מלח חוצץ Tris עם Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl ו- 0.1% Tween 20) למיכל המתאים כאשר צד החלבון (צד הג'ל) פונה כלפי מעלה.
  9. מניחים את הממברנה בחיץ החוסם (ראו טבלת חומרים) ודגרים עליה במשך 0.5 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. שטפו את הממברנה עם TBST במשך 3 x 10 דקות.
  11. לדגור על הממברנה עם נוגדנים ראשוניים נגד פוספו-AKT (p-AKT; 1:1,000), סך AKT 1:1,000, E-cadherin (E-ca; 1:1,000), N-cadherin (N-ca; 1:1,000), Vimentin 1:1,000, חילזון 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH; 1:1,000), לילה ב-4°C.
  12. שטפו את הממברנה במשך 3X10 דקות ודגרו על הממברנה עם נוגדן משני של ארנב או עכבר (1:5,000) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  13. לדגור על קרום PVDF עם מצע ECL במשך 30 שניות ולזהות את האות באמצעות מערכת הדמיה.

22. בדיקת CCK-8

  1. זרע תאי STAD HGC-27 אנושיים במצב צמיחה טוב בצלחות 96 באר.
  2. כאשר צפיפות התא מגיעה ל 60-70%, להדביק את התאים עם siRNA TMEM200A (כמו בשלב 19.3).
  3. זרעו את התאים הנגועים בצלחות של 96 בארות בצפיפות תאים של 5 × 10 3/well (ספרו תאים בני קיימא באמצעות מונה תאים), מחולקים לקבוצות NC ו-TMEM200A siRNA (עם שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה), ומודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף מגיב CCK-8 לאחר 0, 24, 48, 72 ו 96 שעות ודגור ב 37 ° C במשך 2 שעות. מדוד את הספיגה (450 ננומטר) באמצעות תווית אנזימים רב-תכליתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביטוי TMEM200A בסוגי סרטן שונים
כפי שמודגם באיור 1, תחילה ניתחנו את רמות הביטוי הדיפרנציאליות של TMEM200A בסוגי סרטן שונים באמצעות מסדי נתונים שונים. ביטוי TMEM200A היה מוגבר בכולנגיוקרצינומה (CHOL), קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSC), קרצינומה של תאי כליות צלולים (KIRC), קרצינומה של תאי פפילרי של הכליה (KIRP), קרצינומה הפטוצלולרית (LIHC), STAD וקרצינומה של בלוטת התריס (THCA) בהשוואה לרקמות נורמליות סמוכות בהתבסס אך ורק על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

TMEM200A שייך למשפחה של TMEMs החיונית לתאי סרטן להתרבות38. הביטוי המשתנה של TMEM200A בממאירויות שונות קיבל פחות תשומת לב, וחקירה פאן-סרטנית יסודית לוקה בחסר. עם זאת, עדויות ממשיכות להצטבר, ומראות כי משפחת החלבונים הטרנסממברנליים TMEM עשויה להיות חשובה בשמירה על תאי סרטן ממאירים באמצעות אינטראקציות עם מספר חלבונים, לדוגמה, הפעלה של TMEM16A Ca2+ מופעל Cl- ערוצים על ידי ROCK1/moesin מקדם גרורות BRCA39. לכן, בעבודה הנוכחית, הניתוחים שלנו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82160550).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד AKTProteintech Group, Inc60203-2-IG
נוגדן נגד E-cadherinProteintech Group, Inc20874-1-AP
נוגדן נגד גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)Proteintech Group, Inc10494-1-AP
נוגדן נגד N-cadherinProteintech Group, Inc22018-1-AP
נוגדן נגד P-AKTProteintech Group, Inc66444-1-Ig
נוגדן נגד חלזונותProteintech Group, Inc13099-1-AP
נוגדן נגד וימנטיןProteintech Group, Inc10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
ערכת הכנה		Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., LtdUEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCAEpizyme BiotechZJ101L
CCK-8 מגיבMedChemExpressHY-K0301-500T
סרום בקר עוברי (FBS)CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INCFBSSR-01021
GAPDH primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.פריימר קדימה (5'-3'): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; פריימר הפוך (5'-3'): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene בתוספת ריאגנט טרנספקציהABclonalRM09014P-HRP
מצומד Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-1
מצומד HRP Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-2
אפיתל רירית קיבה אנושית <תאים חזקים>GES-1Guangzhou Cellcook Biotech Co., Ltd.
תאי STAD HGC-27 אנושייםProcell Life Science & טכנולוגיה ושות', בע"מ
תאי STAD אנושיים SGC-7901 Procellמדעי החיים & טכנולוגיה ושות', בע"מ
MonAmp SYBR ירוק qPCR מיקס (ללא ROX)מונה (סוג'ואו) ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix עם dsDNase   מונה (סוג'ואו) ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence KitEpizyme BiotechSQ201
PAGE ג'ל ערכת הכנה מהירה Epizyme BiotechPG111
פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep)בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מP1400-100
ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) MerckKGaAIPVH00010-1
מאגר חסימה מהירה ללא חלבוןEpizyme BiotechPS108P
RIPA פתרון ליזהבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מR0010
RPMI 1640 בינוני שלםתרמו פישר סיינטיפיקC11875500BT
חלב דל שומןקמפינה:
TBSTבייג'ינג Solarbio Science & טכנולוגיה ושות', בע"מT1082
מאגר טעינת החלבוןEpizyme BiotechLT101S
TMEM200A נוקדאון פלסמידMiaoLing Plasmid
TMEM200A primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.פריימר קדימה (5'-3'): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; פריימר הפוך (5'-3'): GATTTTGGTCTCTCTTTGTCACGGTT
em>TMEM200A SiRNA1MiaoLing PlasmidForward Premer (5'-3'): ACAACTGATGATAAGACCAG; פריימר הפוך (5'-3'): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2MiaoLing PlasmidForward פריימר (5'-3'): CGTGTGAATGTCAATGACTG; פריימר הפוך (5'-3'): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3MiaoLing פלסמידקדימה (5'-3'): ACAACCACAACATCTGCCCG; פריימר הפוך (5'-3'): TGTTGGTGTGTTTAGTAGACGGGC
חלבון טרנסממברני 200A נוגדןProteintech Group, Inc48081-1
<חזק>ציוד
2 חממת תרבית תאיםHaier GroupPYXE-80IR
מכשיר אלקטרופורזהBio-RAD
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטיBio-RAD
אנזים רב תכליתי LabelerBerthold
ערכת בדיקת חלבון פתרון חיץ Elk <CO<תת>

מקורות

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345(2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006(2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086(2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118(2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321(2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71(2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1(2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36(2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865(2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412(2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543(2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5(2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893(2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סמן ביולוגי TMEM200Aניתוח פאן-סרטניסרטן הקיבהחדירה חיסוניתמעבר אפיתליאלי-מזנכימלימסלול PI3K AKTRT-PCR כמותיWestern Blottingבדיקת ת proliferation של תאים
ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.