במחקר זה פותח בבמבוק רומן בשיטת ביטוי גנים של צמחים ובשיטת עריכת גנים בתיווך אגרובקטריום . שיטה זו שיפרה מאוד את יעילות אימות תפקוד הגנים בבמבוק, דבר שיש לו השלכות משמעותיות על האצת תהליך גידול הבמבוק.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב Planta ביטוי גנים ועריכת גנים בעלי במבוק מוסו
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה חדשנית בטרנספורמציה גנטית של צמחים פותחה עבור במבוק, אשר מונעת את הצורך בתהליכי השראת יבלות והתחדשות הגוזלים זמן רב ודורשים עבודה. שיטה זו כוללת ביטוי גנים בתיווך אגרובקטריום באמצעות פציעה ואקום עבור שתילי במבוק. הוא הדגים בהצלחה ביטוי של גנים אקסוגניים, כגון כתב רובי וגן Cas9 , בעלי במבוק. יעילות הטרנספורמציה הגבוהה ביותר להצטברות בטאליין בשתילי רובי הושגה באמצעות זן GV3101, עם אחוז של 85.2% לאחר ההדבקה. למרות שהדנ"א הזר לא השתלב בגנום הבמבוק, השיטה הייתה יעילה בביטוי הגנים האקסוגניים. יתר על כן, פותחה גם מערכת עריכה גנטית עם כתב יליד בשיטה זו, ממנה מוטציה באתרה הנוצרת על ידי הגן הערוך ויולקסנטין דה-אפוקסידז (PeVDE) בעלי במבוק, עם שיעור מוטציות של 17.33%. המוטציה של PeVDE גרמה לירידה בערכי המרווה הלא-פוטוכימית (NPQ) תחת אור גבוה, אשר ניתן לזהות במדויק על ידי פלואורומטר. זה הופך את PeVDE הערוך לכתב מקומי פוטנציאלי עבור גנים אקסוגניים ואנדוגניים בבמבוק. עם הכתב של PeVDE, גן cinnamoyl-CoA רדוקטאז נערך בהצלחה עם שיעור מוטציה של 8.3%. פעולה זו מונעת את התהליך של תרבית רקמה או השראת יבלות, שהוא מהיר ויעיל לביטוי גנים אקסוגניים ועריכת גנים אנדוגניים בבמבוק. שיטה זו יכולה לשפר את היעילות של אימות תפקוד גנים ותסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של מסלולים מטבוליים מרכזיים בבמבוק.
מבוא
חקירת תפקוד הגנים בבמבוק טומנת בחובה הבטחה גדולה להבנה מתקדמת של במבוק ולמימוש הפוטנציאל שלו לשינוי גנטי. דרך יעילה לכך יכולה להיות מושגת באמצעות תהליך של זיהום בתיווך אגרובקטריום בעלי במבוק, שבו מקטע T-DNA המכיל גנים אקסוגניים מוכנס לתוך התאים, מה שמוביל לאחר מכן לביטוי הגנים בתוך תאי העלה.
במבוק הוא משאב יקר ומתחדש עם מגוון רחב של יישומים בייצור, אמנות ומחקר. לבמבוק תכונות עץ מצוינות כגון חוזק מכני גבוה, קשיחות, קשיחות בינונית וגמישות1, הנמצא כיום בשימוש נרחב במגוון מוצרים ביתיים ותעשייתיים, כולל מברשות שיניים, קשיות, כפתורים, כלי שולחן חד פעמיים, צינורות תת קרקעיים ומילוי מגדל קירור לייצור חשמל תרמי. לכן,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת שתילי במבוק
- הכינו שתילי בוסו במבוק (Phyllostachys edulis) באמצעות זרעים שנקטפו בגווילין, גואנגשי, סין. התחילו בהשריית הזרעים במים למשך 2-3 ימים, והקפידו להחליף את המים מדי יום. לאחר מכן, ליצור מצע על ידי ערבוב אדמה ורמיקוליט ביחס של 3: 1.
- זורעים את הזרעים המושרים במצע לנביטה. לשמור על שתילים בתנאי מעבדה, שמירה על הטמפרטורה בין 18-25 °C (75 °F). הבטיחו תקופת אור של 16 שעות/8 שעות כהות עם עוצמת אור של 250-350 μmol/m2/s במהלך שלב האור.
- שומרים על לחות יחסית של כ-60%. עבור זיהום Agrobacterium, להשתמש שתילים כי הם 15 ימים יש גובה של 2-10 ס"מ, המהווה את השלב הטוב ביותר עבור טרנספורמציה.
ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אגרובקטריום בתיווך ביטוי גנים צמחיים בעלי במבוק
הגן RUBY reporter הוכח כיעיל בהדמיה של ביטוי גנים חולפים בשל יכולתו לייצר בטאליין אדום חי מטירוזין10. במחקר זה, טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום נוצלה כדי לבטא באופן ארעי את הגן האקסוגני RUBY בעלי במבוק (איור 1). ב-3 הימים שלאחר ההדבקה נצפה צבע אדום בעלים המקופלים הלא בשלים, שנעשו חיים יותר ביוםה-5 לאחר שהעלים נפרשו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה זו מפחיתה משמעותית את הזמן הנדרש בהשוואה לשיטות טרנספורמציה גנטית מסורתיות, אשר בדרך כלל אורכות 1-2 שנים, ומשיגה ביטוי חולף של גנים אקסוגניים ועריכת גנים של גנים אנדוגניים תוך 5 ימים. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מכיוון שהיא יכולה להפוך רק חלק קטן מהתאים, והעלים הערוכים גנטית הם כימריים וחסרים את היכולת להתחדש לצמחים שלמים. עם זאת, זה בביטוי גנים צמחיים וטכנולוגיית עריכת גנים מספק גישה רבת עוצמה לאימות פונקציונלי של גנים במבוק אנדוגניים.
כיום, בצמח ביטוי גנים וטכנולוגיית ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
המחברים רוצים להודות לתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מענק מס' 2021YFD2200502), לקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 31971736) על התמיכה הכספית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 35S::RUBY | Addgene, ארצות הברית | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium תאים מוכשרים של GV3101, EHA105,LBA4404 וAGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01 ו-BC302-01 | לזיהום אגרובקטריום |
| CTAB | סיגמא-אולדריץ', ארצות הברית | 57-09-0 | מיצוי DNA |
| הדמיה-PAM פלואורומטר | וולץ, אפלטריך, גרמניה | זיהוי פלואורסצנטיות כלורופיל של עלי במבוק | |
| הדמיה ווין | וולץ, אפלטריך, גרמניה | תוכנה להדמיה-פלואורומטר PAM | |
| Paq CI או Aar I | NEB, ארצות הברית | R0745S | שלב את רצף המטרה על וקטור CRISPR/Cas9. |
| PrimeSTAR Max DNA פולימראז | טאקרה, יפן | R045Q | לשיבוט גנים |
| T4 DNA ligase | NEB, ארצות הברית | M0202V | שלב את רצף המטרה על וקטור CRISPR/Cas9. |
מקורות
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus M....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
