נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי Ex Vivo

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה להוצאת קרום החלון העגול מעצמות הרקתיות של שרקן, ומספק משאב רב ערך למחקרי ex vivo .

תקציר

מתן יעיל וזעיר פולשני של תרופות לאוזן הפנימית הוא אתגר משמעותי. קרום החלון העגול (RWM), בהיותו אחת מנקודות הכניסה הבודדות לאוזן הפנימית, הפך למוקד חקירה חיוני. עם זאת, בשל המורכבות של בידוד RWM, ההבנה שלנו של הפרמקוקינטיקה שלה נותרה מוגבלת. ה-RWM מורכב משלוש שכבות נפרדות: האפיתל החיצוני, שכבת רקמת החיבור האמצעית ושכבת האפיתל הפנימית, שכל אחת מהן בעלת תכונות העברה ייחודיות.

המודלים הנוכחיים לחקר התחבורה ברחבי RWM משתמשים במודלים של בעלי חיים in vivo או מודלים של RWM ex vivo המסתמכים על תרביות תאים או שברי ממברנה. שרקנים משמשים כמודל פרה-קליני מתוקף לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות בתוך האוזן הפנימית והם מודל חייתי חשוב לפיתוח תרגומי של רכבי משלוח לשבלול. במחקר זה, אנו מתארים גישה לנטיעת RWM של שרקן עם עצם השבלול שמסביב לניסויים בהעברת תרופות. שיטה זו מאפשרת שימור של ארכיטקטורת RWM מקורית ועשויה לספק ייצוג מציאותי יותר של חסמי תחבורה מאשר דגמי הספסלים הנוכחיים.

מבוא

סוגים חדשים של טיפולים התפתחו לטיפול בליקוי שמיעה תחושתי-עצבי. תרגומם של טיפולים אלה לאוכלוסיות קליניות מוגבל על ידי נתיבי הובלה בטוחים ויעילים לאוזן הפנימית. השיטות הנוכחיות של העברת in vivo במחקרים בבעלי חיים מסתמכות על fenestration לתוך האוזן הפנימית או דיפוזיה דרך קרום החלון העגול (RWM), מחסום non-osseous המפריד בין חלל האוזן התיכונה לבין השבלול¹.

פנסטרציה כירורגית ומיקרו-הזרקה לאוזן הפנימית הן פולשניות ועלולות להוות סיכון לתפקוד השיורי של האוזן הפנימית². לכן, RWM הוא נתיב חשוב לאספקת תרופות מקומית, ושרקנים הם המודל הפרה-קליני העיקרי של בעלי חיים המשמש לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות מקומיות ברחבי RWM ובאוזן הפנימית לפיתוח תרופות ^3,4. למרות שהוא דק יותר מה-RWM האנושי, השרקן RWM חולק מבנה תלת-שכבתי זהה. קוטרו כ-1 מ"מ, עוביו 15-25 מיקרומטר, והוא מורכב משתי שכבות תאי אפיתל המרכיבות שכבת רקמת חיבור⁵. שכבת האפיתל הפונה לאוזן התיכונה צפופה ומחוברת באמצעות צמתים הדוקים, בעוד שהשכבה הפונה לאוזן הפנימית ולסקלה טימפאני היא בעלת ארכיטקטורה רופפת יותר ואין לה הידבקויות בין-תאיות משמעותיות.

מחקרים פרה-קליניים עכשוויים החוקרים חדירות תרופות בשרקן RWM מסתמכים על זריקות in vivo באוזן התיכונה ולאחר מכן דגימה של נוזל הפרילימפה בתוך האוזן הפנימית, מה שאינו מאפשר את המחקר הספציפי של הובלת RWM ^6,7. שברי צמחי RWM שימשו במחקרים פרה-קליניים, אך בשל שבריריותם וגודלם הקטן, הם אינם מתאימים לחקירות שיטתיות ומיקרופלואידיות של הובלת תרופות וכלי רכב הדורשים אטם אטום למים על פני RWM². קבוצות אחרות השתמשו במודלים במבחנה עם תאי אפיתל אנושיים בתרבית כדי להעריך בקירוב את RWM ^8,9,10. עם זאת, רוב המבנים הללו מתמקדים אך ורק בשכבת האפיתל החיצונית ואינם לוכדים את המורכבות של ארכיטקטורת רקמות טבעית. להבנה מפורטת יותר של מנגנוני הובלה ברחבי RWM, נדרשים מחקרים ממוקדים, ex vivo.

במחקר זה, אנו מדגימים את הנטיעה של RWM שרקן עם תמיכה גרמית מסביב כדי לשמור על שלמות הממברנה וממחישים את השימוש בהם בפרדיגמה ניסיונית המיועדת למחקר ספציפי של הובלת RWM של כלי משלוח סמים.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (GP18M226). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשרקנים לבקנים של הארטלי (זכר ונקבה כאחד, במשקל 500-700 גרם).

1. הגדרת הנוהל והכנתו

1. לעקר את כל המכשירים עם אתילן אוקסיד לפני תחילת הניסוי.
2. יש להרדים את בעלי החיים בהתאם לפרוטוקול המאושר על ידי הממסד.
   הערה: במחקר הנוכחי, תא שאינו טעון מראש שימש לשחרור 100% פחמן דו חמצני (CO₂) מגליל מסחרי. נעשה שימוש במגביל מוטבע כדי לווסת את זרימת הגז, ולשמור עליה בטווח של 30% עד 70% מנפח התא לדקה בהתאם להנחיות AVMA¹¹ לשנת 2020.
3. הכניסו את בעל החיים לתא ושחררו פחמן דו-חמצני למשך 5 דקות. זרימת CO₂ נשמרת למשך דקה אחת לאחר דום נשימה.
4. בצע עריפת ראש לאחר דום נשימה כדי להבטיח המתת חסד.

2. גישה כירורגית ו explantation

1. לחלץ את העצם הטמפורלית מגולגולת השרקן בצורה הרגילה¹². הסר את הרקמה הרכה העודפת עם רונגור. זהו את הבשר האקוסטי החיצוני, את הבולה הרקתית ואת תעלת הפנים¹³ (איור 1).
2. קדח את ההיבטים הגחונים של הבולה הרקתית עם ביט יהלום 6 מ"מ (ראה טבלת חומרים), וחשף את חלל האוזן התיכונה ואת תעלת השמע החיצונית באופן היקפי.
3. באמצעות rongeurs, בעדינות להסיר את תעלת השמיעה החיצונית ואת טבעת tympanic, בו זמנית מפריד את המפרק incudomalleolar. זהו את האינקוס, המפרק האינקודוסטפדיאלי, השבלול, התעלה האופקית החצי עגולה ותעלת הפנים¹³ (איור 2A).
4. מפרידים את המפרק incudostapedial ולהסיר את האינקוס באמצעות מלקחיים. זהה את הגומחה הגרמית של החלון העגול.
5. השתמש בסיבית יהלום 6 מ"מ כדי לקדוח את הלמינה הגרמית המחברת את השבלול עם הקיר המדיאלי של חלל הטימפאני לכיוון תעלת טימפאני טנזור. שחרר בזהירות את הלחץ הגרמי של הטימפאני הטנזור והסר את שריר הטימפאני הטנזור באמצעות מחט 28 גרם.
   הערה: הקיר המדיאלי של טנזור טימפאני פוסה מתחבר ישירות עם עצם השבלול סביב RWM, ויש להקפיד לא לגרום לשברים שיכולים להימשך עד החלון העגול.
6. קדחו את הלמינה הגרמית שחיברה את השבלול לדופן התחתונה של חלל הטימפאני עד שנותר 1 מ"מ של מדף גרמי הניגש לשבלול (איור 2B).
7. בעזרת ביט יהלום בקוטר 2 מ"מ (ראו טבלת חומרים), יוצרים שבלול בסיבוב הבסיסי של השבלול, ומשאירים כ-2 מ"מ עצם לחלון העגול. ממשיכים את השבלול בצורה נחותה במישור מקביל לקרום החלון העגול כדי להפריד את הבסיס מהקודקוד של השבלול.
8. האריכו את חתך השבלול דרך בסיס הגולגולת, שהוא הרבה יותר צפוף, וכתוצאה מכך מבט חתך רוחב של סיבוב הבסיס של השבלול.
   הערה: כיוון המקדח לכיוון הבשר של תעלת השמע הפנימית מביא למסלול שממקסם את הסרת העצם תוך הימנעות מחציית קרוב מדי לחלון העגול.
9. בדוק את הדגימה מצד בסיס הגולגולת, ואם עדיין לא נעשה, זהה את תעלת השמע הפנימית וקדח לצמצם השבלול. הסר את עצב השבלול עם מחט 28 גרם.
10. בדוק את הדגימה מהצד התוך-שבלול. זהה והסר את למינה ספירלית osseous בסיבוב הבסיס ואת modiolus הנותרים עם מלקחיים או מחט 28 גרם.
11. השקו את חלל scala tympani-scala vestibuli המאוחד בשפע כדי להסיר פסולת. החלון העגול צריך להיראות בבירור מכריתת השבלול ללא פסולת מעליה (איור 2C).
12. לאחר מכן, בדוק את הדגימה מצד האוזן התיכונה. קדח את התעלה החצי עגולה הצידית ואת תעלת הפנים עד לגובה החלון הסגלגל. הסר בעדינות את הרצועות באמצעות מלקחיים, חושף את נישת החלון הסגלגל. יש לציין כי קיים גשר גרמי בין הקרורה של הסטייפים המכונה crista stapedis.
13. באמצעות מקדח יהלום בקוטר 1 מ"מ (ראו טבלת חומרים), פתחו את הפרוזדור עוד יותר על-ידי הארכת החלון הסגלגל לאורך פני החלון העגול, תוך הקפדה על 1-2 מ"מ של עצם שבלול הניגשת לגומחת החלון העגול (איור 2D).
14. השלימו את חתכי העצם הרקתיים על ידי חיבור חתכי החלון הסגלגל עם חתכי השבלול בכל צד של החלון העגול.
    הערה: בשל שבריריותה של עצם השבלול, שימור הטנזור טימפאני פוסה בדגימה והימנעות מחתכים דרכו יסייעו במניעת שברים בעצם השבלול המגיעים עד לשבלול האוזן ופוגעים בשלמותו.
15. בצעו את החיבורים הסופיים לעצם הצפופה של בסיס הגולגולת הסמוך לתעלת השמע הפנימית וגלחו בעדינות עד לקבלת דגימת RWM שנכרתה (איור 3A).

תוצאות

כפי שמודגם באיור 3A, שיטה זו מאפשרת לנטוע את קרום החלון העגול של השרקן השלם עם טבעת מקיפה של עצם קשיחה. RWM צריך להיות מחובר באופן מלא לטבעת הגרמית באופן היקפי. אין להעריך שברים בעצם השבלול. בהשוואה לדגימות חלון עגול אנושי, לשרקן RWM אין פסאודוממברנה מעל. בנוסף, בניגוד לבני אדם, קיים גשר גרמי בין הקרורה של סטפס השרקן, הדורש שבירה והסרה לפני חילוץ מבנה העל של השרקנים. ניתוח היסטולוגי (איור 3B) של RWM המייצג מראה מבנה אפיתל תלת-שכבתי ברור עם נישת חלון עגולה סמוכה ...

דיון

באספקת תרופות מקומית לאוזן, RWM הוא נתיב המעבר העיקרי של טיפולים להגיע לאוזן הפנימית. יש צורך במודל מדויק ואמין כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ההובלה והחדירות בין רכבי משלוח חדשניים ולפיתוח תרופות. במחקר זה, אנו מראים כי מטע RWM של שרקנים הוא הליך אפשרי ואמין המאפשר חקירות שיטתיות של אינטראקציות בין תרופות לממברנה. לונדמן ואחרים וקלסו ואחרים תיארו בעבר שימוש במודל חדירות RWM דומה ^2,16; עם זאת, השלבים הספציפיים של החילוץ הכירורגי לא פורטו עד כה, והשבריריות של עצם ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"מ מקדח כדור יהלום	Anspach	1SD-G1
2 מ"מ מקדח כדור יהלום	Anspach	2SD-G1
6 מ"מ מקדח כדור יהלום	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus מערכת	Anspach	EMAX2PLUS	כל מערכת קידוח חיתוך עצם תעבוד
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 אינץ' עם מזרק BD Luer-Lok ניתן להסרה 1 מ"ל	בקטון, דיקינסון ושות'	382903057894	כל 27-28 גרם מחט
גורילה אפוקסי	גורילה	4200101
Kwik-CAST	מכשירים מדויקים עולמיים	KWIK-CAST