מאמר שיטה

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

DOI:

10.3791/65831

⸱

13 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Stanford University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריצוף מולטיום, המספק RNA חד-תאי זהה/מזווג והבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing), מייצג פריצת דרך ביכולתנו להבחין בהטרוגניות של תאי הגידול - מוקד עיקרי של מחקר סרטן תרגומי בשלב זה. עם זאת, איכות נתוני הרצף הנרכשים באמצעות מודל מתקדם זה תלויה מאוד באיכות חומר הקלט.

תנאי העיכול צריכים להיות אופטימליים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב את האיכות. זה מאתגר במיוחד בהקשר של גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות שיש לפרק בעדינות לשחרור תאים. תאים שבודדו טריים מרקמת גידול מוצקה הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים. בנוסף, מכיוון שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש לבחור תנאים שיתמכו באוכלוסיית התאים הכוללת.

לבסוף, תנאי בידוד גרעיני חייבים להיות אופטימליים בהתבסס על תכונות אלה במונחים של זמני ליזה וסוגים/יחסים מגיבים. במאמר זה, אנו מתארים את הניסיון שלנו עם בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף 10x Genomics multiome מדגימות גידול מוצק. אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, אחסון של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים), בידוד גרעיני והערכה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ככל שהידע שלנו על ביולוגיה של הגידול גדל, החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים על פני מיקרו-סביבה של הגידול גדלה גם היא 1,2. היכולת לרכוש RNA חד-תאי והבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing) מאותו תא בצורה זוגית (ריצוף מולטיום) מספקת התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו 3,4. עם זאת, ניסויים אלה יקרים וגוזלים זמן, ואיכות וההשפעה של הנתונים המתקבלים תלויים מאוד באיכות תנאי הניסוי והחומרים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים פורסמו 5,6. רקמות טריות והטרוגניות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול מכיוון שתאים שבודדו טריים מדגימות גידול מוצקות הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים.

שיקול נוסף הוא שעבור גידולים מוצקים, דגימות כירורגיות לרוב אינן זמינות מחדר הניתוח עד מאוחר ביום. ככזה, זה בדרך כלל לא ריאלי להמשיך ישירות מרכישת דגימה ללכידת גרעינים ללא שלב שימור בהקפאה. מניסיוננו, הקפאת תרחיף חד-תאי מניבה גרעינים באיכות הגבוהה ביותר (ולא רקמה שלמה קפואה בהבזק או שיטות שימור אחרות). זה נכון במיוחד עבור סוגי רקמות אנזימטיות עם תוכן RNase גבוה כגון הלבלב.

תנאי עיכול רקמות צריכים גם להיות מתוכננים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב איכות7. בהקשר של סוגי גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות8, יש לפרק בעדינות את המטריצה החוץ תאית לשחרור תאים. בנוסף, מאחר שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש להתאים את התנאים לתמיכה באוכלוסיית התאים הכוללת. דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) משמשות בפרוטוקול המתואר. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמות ותאים דביקים יחסית. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדים.

בידוד גרעינים דורש את האופטימיזציה הרבה ביותר במונחים של תנאי ליזה התא ועיתוי, כמו גם סוגים ויחסים מגיבים. גם הטיפול בגרעינים במהלך הבידוד דורש זהירות רבה. במאמר זה אנו מתארים את הניסיון שלנו במיטוב בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף מולטי-ome 10x Genomics מרקמת גידול מוצקה (איור 1). אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים) ובידוד גרעיני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) נרכשו על פי פרוטוקול שאושר על ידי IRB במעבדה שלנו. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לאיסוף רקמות. הרקמה הועברה מחדר הניתוח למעבדה ולאחר מכן טופלה באופן הבא.

1. דיסוציאציה רקמות (עיכול)

  1. הכן את מאגר Digest (ראה טבלת חומרים).
  2. השג את הרקמה המעניינת בהקדם האפשרי לאחר כריתת הגידול והעביר את הדגימה במאגר מרווה (DMEM F-12 עם ~ 5% נסיוב בקר עוברי) או 1x PBS על קרח.
  3. טחנו את הרקמה באמצעות מלקחיים נקיים ומספריים ב-3-5 מ"ל של חיץ Digest בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ (איור 2A).
  4. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומנתקים ב~10 מ"ל של חיץ Digest למשך 30 דקות ב-37°C באמצעות אמבט מים עם פונקציית רעד או תסיסה יבשה.
  5. הסר מן התסיסה להרוות עם ~ 20 מ"ל של מדיום מרווה. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי.
  6. אספו את כל הרקמה המוצקה שנותרה מהמסננת (טחנו מחדש את חתיכות הרקמה הנותרות במידת הצורך), והניחו ב~10 מ"ל של חיץ Digest טרי למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C עם תסיסה. חזור על הפעולה עד שכל רקמת הגידול מנותקת.
  7. תרחיף תאי הבריכה מתעלים ומסננים דרך 70 מיקרומטר ואחריו מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי על קרח.
  8. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.

2. שימור בהקפאה

  1. לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 1x PBS.
  2. העבר את תרחיף התא (~ 1-10 מיליון תאים / צינור להקפאה אופטימלית) לקריביאל של 1.5 מ"ל על קרח.
  3. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.
  4. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תמיסת במבנקר, העבר לקריביאל של 1.5 או 2 מ"ל (איור 2B), והקפיא באמצעות מיכל הקפאה בקצב קירור של -1°C/min (המכיל 100% אלכוהול איזופרופיל) ב-80°C-, או העבירו לחנקן נוזלי אם צפוי אחסון ארוך טווח של הדגימה.

3. בידוד גרעינים

  1. הפשירו במהירות את ההקפאה של תרחיף התאים והניחו אותו על קרח רטוב.
  2. העבירו את מתלה התאים המופשר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ומלאו את הבקבוקון לתמיסת 2 מ"ל ב-1x PBS כדי לשטוף את התאים.
  3. השיגו ספירת תאים ידנית באמצעות המוציטומטר כדי להעריך הן את כמות התאים והן את איכותם (איור 2C).
  4. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בעדינות decarant supernatant באמצעות קצות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להשאיר מאחור גלולה יבשה ולשמור אותו על קרח.
    1. השתמש ברוטור דלי נדנדה עבור כל שלבי הצנטריפוגה. לתפוקת תאים מרבית, הניחו את הצינורות בצנטריפוגה כשהציר פונה החוצה ולאחר מכן דקאנט כשקצה הפיפטה מכוון לצד הנגדי של הצינור (איור 2D).
      הערה: כדי לנטרל את הסופרנטנט, השתמש בקצוות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להסיר נוזל כדי להגביל את ההפרעה של הגלולה תוך הגדלת נפח הנוזל decanted. אסטרטגיה זו מועילה במיוחד בהמשך הפרוטוקול לאחר מיצוי גרעינים מכיוון שכדורית הגרעינים בדרך כלל אינה נראית לעין.
  5. הכינו 1x מאגר ליזה של תאים, מאגר דילול ליזה של תאים ומאגר שטיפה (איור 3A) בהתאם לפרוטוקול שפורסם עם השינויים הבאים (ראו טבלה 1, טבלת חומרים):
    הערה: הניחו את הדיגיטונין על גוש חימום בטמפרטורה של 65°C לפני השימוש כדי להמיס את המשקע (איור 3B). פעולה זו נמשכת בדרך כלל כ-10 דקות.
  6. הכינו את מאגר הליזה של התאים 0.1x על ידי שילוב של 100 μL של 1x Cell Lysis Buffer ו-900 μL של Cell Lysis Dilution Buffer, פיפטה עדינה לערבוב והניחו אותה על קרח.
  7. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-100 μL של חיץ ליזיס תאי 0.1x מקורר ולערבב פיפטה עדינה פי 5.
  8. דגרו על קרח במשך 3 דקות (איור 3C).
  9. הוסיפו 1 מ"ל של Wash Buffer צונן ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות פי 5.
  10. צנטריפוגה כדי להניע את הגרעינים ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, בעדינות decant supernatant לגלולה יבשה, ולשמור על קרח.
    הערה: אם מספר התא ההתחלתי נמוך (100,000-200,000 תאים), בצע את שלבי הליזה והשטיפה של התא בצינור PCR של 200 מיקרוליטר במקום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל כדי להקטין את שטח הפנים של הצינור ולמזער הפסדים. במקרה זה, כוונן את עוצמת הקול של מאגר הכביסה כלפי מטה כדי להתאים לנפח הצינור הקטן יותר.
  11. חזור על שלבים 3.9-3.10 2x עבור שלוש כביסות בסך הכל.
  12. ספור ידנית את הגרעינים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ. השתמש בצבע כחול טריפאן אם תרצה כדי לספק ניגודיות לצפייה בגרעינים וכדי לעזור להבחין בין גרעינים לתאים שלא עברו ניתוח.
  13. הכינו את מאגר הגרעינים 1x לפי הפרוטוקול שפורסם: מלאי מאגר גרעינים 20x, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor במים נטולי נוקלאז ושמרו על קרח (ראו טבלת חומרים).
  14. השהה מחדש את כדורית הגרעינים במאגר גרעינים 1x בהתבסס על שחזור גרעינים ממוקד מטרה.
    הערה: אם הריכוז גבוה מספיק, יש לשאוף להתאוששות ממוקדת של 10,000 או מעט גבוה יותר בשלב זה (3,230-8,060 גרעינים/μL) בעת קביעת נפח התרחיף ההתחלתי, בהתחשב באובדן הנפח הצפוי של 25 μL והירידה של 20% בריכוז עם סינון (שלב 3.15).
  15. העבירו בעדינות את נפח הגרעינים המרחפים מחדש דרך מסננת פיפטה של 40 מיקרומטר והניחו את הגרעינים על קרח (איור 3D).
  16. ספרו מחדש את הגרעינים (איור 4A-C). דללו את הפתרון הסופי עוד יותר עם Nuclei Buffer במידת הצורך.
  17. העבירו את הגרעינים על קרח והמשיכו מיד בלכידת גרעינים לפי פרוטוקולים שפורסמו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה מדגימות של גידולים מוצקים של מטופלים לצורך ריצוף מולטיומי (איור 1), רקמת הגידול נותקה ותרחיף של תא בודד נשמר בהקפאה (איור 2A-D). לאחר מכן הופשר מתלה התא בזמן לכידת המולטיום המתוכננת. לכידת גרעינים בוצעה עם ריאגנטים ותזמון אופטימליים של חיץ ליזיס כדי למקסם הן את האיכות והן את התפוקה (איור 3A-D). תמונות גרעינים מייצגות מציגות גודל וצורה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התרת הסבך של אוכלוסיות התאים ההטרוגניות הקיימות במיקרו-סביבה של הגידול היא תחום פעיל של התמקדות בביולוגיה של סרטן. באופן דומה, רקמות מורכבות קיימות בפתולוגיות שפירות כגון ריפוי פצעים ופיברוזיס. ריצוף Multiome התגלה ככלי רב עוצמה המאפשר רכישה של נתוני scRNA ו- ATAC-seq מזווגים של תאים זהים. פרוטוקול זה מתאר בידוד של גרעינים, הדורש אופטימיזציה בהגדרת עיבוד דגימות גידול טריות, שבריריות וקטנות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד גרעינים מדגימות רקמת גידול מוצקה דסמופלסטית. מצאנו שגישה זו מניבה נתונים אמינים ואיכותיים גם כאשר מתל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות למתקן הגנומיקה הפונקציונלית של סטנפורד (SFGF), במיוחד לדהננג'אי וואג וג'ון קולר, ול-10x Genomics על עזרתם במיטוב הניסויים שלנו. ברצוננו גם להודות לד"ר ג'ורג' פולטסיידס, מוניקה דואה, ברנדן ויסר ובירן לי על עזרתם בהשגת דגימות מטופלים. ברצוננו להודות לארט ולאיליין טיילור, קרן רנץ, וורן וג'ודי קפלן על תמיכתם הנדיבה במאמצי המחקר שלנו. מקורות המימון כוללים מענקי NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), קרן גולדמן זאקס (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), הקרן לחקר הסרטן ע"ש דיימון ראניון (D.D., M.T.L.), קרן גאן/אוליבייה, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, קרן סטיינהרט/ריד ומעבדת הייגי לרפואה רגנרטיבית בילדים. הריצוף הושג באמצעות מכונות שנרכשו בקרנות NIH (S10OD025212, S10OD018220 ו- 1S10OD01058001A1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100, 70 ו-40 μ m מסנני תאי פלקון   ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)10x Genomics2000153/2000207
Bambanker וואקו, פישר סיינטיטיקNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
סידן כלורידסיגמא אולדריץ'499609
קולגנאז (קולגנאז סוג IV)ThermoFisher17104019
DigitoninThermo FisherBN2006
DNase IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
דולבקו s שונה נשר בינוני F-12תרמו פישר11320082
סרום בקר עובריתרמו פישר10438026
Flowmi 40 μ מ  מסננת תאים עם קצה פיפטה Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Gradient Separation CellSeparation Solution Sigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM ערכת עיכול 
NaClSigma Aldrich59222C
מיכל הקפאה Nalgene Cryo "Mr. Frosty"  ThermoFisher5100-0001
תחליף P40 NonidentSigma Aldrich74385
מעכב פולוקסמר 188SigmaP5556
מעכב Rnase סיגמא אולדריץ'3335399001
Tris-HClסיגמא אולדריץ'T2194
טווין-20תרמו פישר85113

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).
  2. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  3. Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
  4. Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
  5. Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  6. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  7. Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815(2020).
  8. Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911(2018).
  9. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  10. Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
  11. Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
  12. Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAATAC

מאמרים קשורים