מאמר שיטה

כימות קלוז ברקמות צמחים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים / ספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציה

DOI:

10.3791/65833

⸱

22 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מכמת את הקלוז ברקמות הצמח באמצעות השיטה הספציפית לקלוס, ספקטרופוטופוטומטריה אימונופלואורסצנטית/ELISA, המבוססת על קישור קלוז בדגימות הצמח לנוגדנים ספציפיים לקלוז, ולאחר מכן כימות קלוז קשור באמצעות נוגדנים לזיהוי מסומנים באנזימים על ידי מדידת הפעילות האנזימטית שנוצרת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות הקיימות לכימות קלוז מרקמות צמחים כוללות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, והערכה עקיפה של פעילויות קלוז סינתאז ופעילות β-(1,3)-גלוקנאז. עם זאת, לחלק מהשיטות הללו יש מגבלות משמעותיות, הכוללות היותן גוזלות זמן, לא ספציפיות לקלוס, עתירות עבודה, סובייקטיביות, אוטופלואורסצנציה גבוהה, רגישות נמוכה, איכותניות יותר מאשר כמותיות, ודורשות רכישת משאבי תוכנה וכישורים טכניים. לכן, יש צורך דחוף לחפש שיטות חלופיות לכימות קלוז ברקמות צמחיות. הועלתה השערה כי ספקטרופוטומטריית אימונופלואורסצנציה או מבחן אימונוסורבנט מקושר לאנזימים (ELISA) המשתמשת בנוגדנים ספציפיים לקלוז יכולה להתגבר על חלק מהמגבלות של שיטות הכימות הנוכחיות של קלוז. לחץ ביוטי הועבר על ידי חיסון שתילים בננה שמקורם בתרבות רקמה עם Xanthomonas vasicola pv. חיידקי musacearum (Xvm) שגרמו לייצור קלוז. דגימות רקמת קורם בננה נאספו 14 ימים לאחר החיסון (DPI) לכימות קלוז באמצעות שיטת ספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציונית חדשה. ייצור הקולוז בקורמים של קבוצות מחוסנות Xvm וקבוצות ביקורת השתנה באופן משמעותי בשתי הגנוטיפים של הבננות (בדיקת t מדגם עצמאית, p < 0.05). שיטת הספקטרופוטומטריה האימונופלואורסצנציונית המתוארת כאן יכולה לשמש לכימות קלוז ברקמות צמחים שונות עם ספציפיות גבוהה לקלוז, רגישות, אמינות ושחזוריות. בנוסף, השימוש בפלטת 96 בארות הופך שיטה זו למתאימה למחקרי כימות קלוז בעלי תפוקה גבוהה עם הטיות דגימה וניתוח מינימליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קלוז הוא פוליסכריד של β-1,3-גלוקן, תרכובת טבעית הנמצאת בדפנות התאים של מגוון צמחים גבוהים. קלוז מסונתז על ידי קלוז סינתאזות (CalS) ומתפרק על ידי β-(1,3)-גלוקנזים 1,2,3. הוא מעורב במספר תהליכים ביולוגיים, כולל גדילה והתפתחות ותגובה ללחצים אביוטייםוביוטיים 4,5,6. במהלך זיהום פתוגן, העלייה בהצטברות הקלוז בפפילות מסייעת במניעת התיישבות מיקרוביאלית נוספת, ופועלת כמחסום חדירות בין תאי הצמח השכנים 2,4,7,8,9,10,11,12 . על ידי האטת פלישת הפתוגנים לרקמה המותקפת, הצטברות קלוז מאפשרת זמן להפעלת תגובות הגנה נוספות13. כימות מדויק במרחב-זמן של קלוז ברקמות הצמח חיוני להבנת תפקידו בתהליכים הפיזיולוגיים השונים. עם זאת, השיטות הנוכחיות לכימות קלוז מרקמות צמחים, הכוללות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנציונית וספקטרופוטומטריה פלואורסצנטית, סובלות ממגבלות משמעותיות ואתגרי כמות. לכן, יש צורך דחוף לחפש שיטות חלופיות לכימות קלוז כדי להתגבר על חסרונות אלו. הושערה כי ספקטרופוטומטריה באימונופלואורסצנציה או מבחן אימונוסורבנט מקושר באנזים (ELISA) יכולה להציע שיטה יעילה יותר לכימות קלוז בדגימות צמחים, הכוללת ספציפיות גבוהה, רגישות, אמינות, שחזוריות ומציעה שיטה בעלת תפוקה גבוהה.

שיטת הסטנדרט הזהב לכימות קלוז כוללת הדמיה של חלקיקי קלוז מוצבעים בכחול אנילין באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה 14,15,16,17. הקלוז המוצבע בכחול אנילין כאשר נחשף לגירור של אור כחול או UV מופיע כחלקיקים פלואורסצנטיים צהובים, שניתן לספור ידנית למספר חלקיקי הקלוז הפלואורסציה 14,15 או לספור באמצעות תוכנת ספירת קלוז אוטומטית. ספירה ידנית של חלקיקי קלוז היא מייגעת, גוזלת זמן וסובייקטיבית לחוקר18, בעוד שספירה אוטומטית דורשת רכישת משאבי תוכנה וכישורים טכניים רבים. חלק מהתוכנות המשמשות לספירת קלוז אוטומטית כוללות את ImageJ 19,20,21,22, Photoshop 23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 ו-Ilastik26. ניתן גם לכמת את הקלוז המוצבע בכחול אנילין באמצעות ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה 17,19,27,28,29. עם זאת, הרקע/אוטופלואורסצנציה הגבוהה הקשורה למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנצית ולספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה הופכת שיטות אלו לקשות ולא אמינות בשל יחס אות לרעש נמוך26. יתרה מזאת, אנילין כחול יכול לצבוע β-1,3-גלוקנים נוספים מלבד קלוז30, מה שהופך את שיטות המיקרוסקופיה האפיפלואורסצנטיות והפלואורסצנציה לזיהוי וכימות קלוז לבלתי ספציפיות ובלתי אמינות. שיטת מיקרוסקופיה לאימונופלואורסצנציה לכימות קלוז, המבוססת על נוגדנים ספציפיים לקלוז, שימשה גם היא במספר מחקרים 31,32,33. למרות שלשיטה זו יש כמה חסרונות עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי של קלוז מוצבע בכחול אניליני, יש לה את היתרון בכך שהיא ספציפית ליבלת בשל הנוגדנים בהם משתמשים כאן. כימות קלוז בוצע גם באמצעות שיטות מבוססות פעילות אנזימים. שיטות מבוססות פעילות אנזימטיים לכימות קלוז כוללות הערכת פעילויות קלוז סינתאז (CalS)20,33 ופעילות β-(1,3)-גלוקנאז34,35. לשיטות המבוססות על פעילות אנזימית יש מספר חסרונות בהשוואה למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה וספקטרופוטומטריה פלואורסצנטית. אלה כוללים הערכה עקיפה של קלוזה, קושי בהוצאת אנזימים ובדיקות פעילות אנזימטית, והיעדר חלוקה אחידה של קלוז ברקמות הצמח.

עקב החסרונות של שיטות כימות קלוז הנוכחיות, הכוללות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה, CalS ובדיקות β-(1,3)-גלוקנאז, היה צורך לפתח שיטה חדשה לכימות קלוז שתציע מספר יתרונות, ביניהם: 1) ספציפיות גבוהה, רגישות, אמינות ושחזור, ו-2) כימות קלוז קל יותר עם יכולת תפוקה גבוהה. השימוש בספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציה לכימות קלוז לא נחקר. כאן מדווחת שיטה חדשה לכימות קלוז המבוססת על ספקטרופוטופוטומטריה אימונופלואורסצנטית, ובפרט Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). השיטה ניתנת לאופטימיזציה לכימות קלוז בצמחים שונים או ברקמות שלהם, עם רמת ספציפיות טובה לקלוז, דיוק, שחזוריות ויכולת ניסוי בתפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת כדי לכמת כל אנליט מבוסס צמחים אם יש נוגדן נגד אותו אנליט זמין. כדי להבטיח התפלגות מדויקת, יעילה ואמינה של קלוז ברקמות הצמח, מומלץ להשתמש בשיטות שונות לכימות קלוז בו-זמנית, הכוללות מיקרוסקופיה, ספקטרופוטומטריה ושיטות מבוססות פעילות אנזימים. כתוצאה מכך, הדבר יאפשר הבנה מדויקת ויעילה של תפקיד הקלוז בתגובות פיזיולוגיות ולחצים שונות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חיסון צמחים ניסיוניים

  1. בידוד, הכין ואשר את החיסון של Xvm באמצעות ההליכים הסטנדרטיים36,37. בחרו באקראי 10 צמחי Musa balbisiana ו-Mbwazirume שמקורם בתרבית רקמות בני חודשיים, וחינו את הצד הגבי של הפטיול הצעיר והפתוח לחלוטין ב-200 מיקרוL (1 x10 8 תאים) של החיסון Xvm המאושר על ידי PCR (איור 1)38.
  2. באופן דומה, בחרו באקראי 10 צמחי בננה Musa balbisiana ו-Mbwazirume והחריכו אותם ב-200 מיקרו-ליטר מים מזוקקים סטריליים (SDW).
  3. שמרו על צמחי הבננה המחוסנים ב-Xvm ושלטו בתנאים דומים בבית המסך עם אור של 12 שעות ו-12 שעות חשוך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, והשקיו אותם כל 3 ימים.
    הערה: עיינו בטבלת החומרים ובטבלה 1 לרשימת החומרים והציוד ומתכון לבופרים, בהתאמה.

2. דגימת רקמות קורם והכנת דגימה

  1. לבצע דגימה הרסנית לקבלת דגימות קורם ממפעלי הניסוי (איור 1).
  2. הסר במהירות כ-2 גרם מדגימות הקורום באמצעות להבים כירורגיים סטריליים 14 ימים לאחר החיסון (DPI) והניח אותן בנפרד בתוך צינורות 50 מ"ל מסומנים. עשה זאת עבור כל 10 הדגימות שנאספו מכל אחת מהצמחים המחוסנים ב-Xvm ומהצמחים הבקרה.
  3. טבלו מיד את צינורות ה-50 מ"ל המכילים את הדגימות בחנקן נוזלי.
  4. העבר את הדגימות למעבדה ואחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להמשך. אחסן דגימות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה או יותר עם מחזורי הקפאה והפשרה מינימליים.
  5. ייבשו את הדגימות בהקפאה במשך 72 שעות באמצעות מייבש בהקפאה (איור 1).
  6. הניחו בדיוק 30 מ"ג מהדגימות המיובשות בהקפאה בצינורות של 2 מ"ל המכילים 2 חרוזי אופניים מפלדה וטחנו אותם לאבקה דקה, כאשר המהירות מכוונת ל-5 למשך דקה אחת (איור 1).
  7. אחסנו את הדגימות המרוסקות בסביבה קרה ויבשה בטמפרטורת החדר, אטומות היטב עד שהן מוכנות להמשך. אחסן את הדגימות המרוסקות בטמפרטורת החדר עד 4 חודשים או בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה עם מחזורי הקפאה והפשרה מינימליים39,40.

3. הפקת קלוז והכנת תקני למינרין ובלנק

  1. כדי להפיק קלוז מ-30 מ״ג של דגימת הקורום המרוסקת, הוסף 800 מיקרוליטר של 1 M NaOH ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס באמבט מים, עם מערבולת מדי פעם כל 10 דקות27.41 (איור 1, שלב 6).
  2. אפשר לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר (כ-5 דקות) ואז להפעיל צנטריפוגה על 15,294 x גרם למשך 5 דקות.
  3. העבר את הסופרנטנט (תמצית קלוז) לצינור סטרילי בנפח 2 מ"ל ומדלל עם בופר החוסם (טבלה 1) ביחס של 1:2.
    הערה: בחר את גורם הדילול בהתבסס על ניסויים ראשוניים ואופטימיזציה. דילול תמצית הקלוז עשוי להיות הכרחי או לא. בעת הצורך, יש לבצע דילול בבופר החסימה ולהתאים את יחס הדילול לסוגי דגימות שונים שייכנסו לטווח העקומה הסטנדרטית.
  4. אחסן את תמציות הקלוז בטמפרטורה של מינוס 20°C עד שתהיה מוכן להמשיך. אחסן את תמצית הקלוז עד 6 חודשים עם מחזורי הקפאה והפשרה מינימליים.
  5. הכינו מלאי מרוכז של תקן למינרין ב-100 מ"ג/מ"ל ב-1 מטר NaOH 6,42,43,44,45.
    הערה: למינרין הוא פולימר 1-3-β-גלוקן וניתן להשתמש בו כסטנדרט למקבילות קלוז בספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנטית.
  6. דגרו את התלייה המתקבלת של התקן בטמפרטורה של 80°C באמבט מים, תוך ניעור עדין במרווחים, עד שכל הלמינרין נמס לחלוטין (כ-20-40 דקות).
  7. קרר את התקן המומס לטמפרטורת החדר (כ-10 דקות).
  8. הכינו תקני למינרין בריכוזים של 80 מ"ג/מ"ל, 60 מ"ג/מ"ל, 40 מ"ג/מ"ל, 20 מ"ג/מ"ל, 10 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.1 מ"ג/מ"ל ו-0.01 מ"ג/מ"ל באמצעות בופר חסימה, החל מהמלאי המרוכז של 100 מ"ג/מ"ל.
  9. הכינו את החלקים הריקים על ידי ערבוב של 1 M NaOH והבופר החוסם ביחס של 1:2. אם יש צורך בדילול, השתמש באותו יחס דילול שבו משתמשים להכנת תמצית הקלוז.
  10. אחסן את תקני הלמינרין ואת הספינות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס. אחסון סטנדרטים ופריטים ריקים עד 6 חודשים עם מחזורי הקפאה והפשרה מינימליים.

4. כימות קלוז באמצעות ספקטרופוטומטריית אימונופלואורסצנציה

  1. הוסף 100 מיקרוליטר של הנוגדן הראשי (1-3-β-IgG עכבר מונחה גלוקן) שהוכן באמצעות בופר הציפוי (טבלה 1) לכל אחד מ-96 הבארות של לוחות הפוליסטירן ELISA (איור 2).
  2. אטום את הצלחת היטב עם סרט פרפין ודגר אותה ללילה בטמפרטורה של 4°C במקרר.
  3. למחרת, מניחים את הצלחת על הספסל ותנו לה להגיע לטמפרטורת החדר (כ-10 דקות).
  4. שטפו את הצלחת בשיטות ניקוי ושטיפה סטנדרטיים46. בקצרה, הוסף 200 מיקרוליטר של בופר השטיפה (טבלה 1) לבארות, סחרור ב-500 סל"ד למשך 30 שניות עם שייקר דיגיטלי ולטפט על נייר טישו. חזור על תהליך הכביסה הזה פעמיים (איור 2). ודאו שהבארות אינן מתייבשות לחלוטין והשתמשו בקצה מיקרופיפט סטרילי להסרת בועות בבארות מבלי לגעת בבסיס ובקירות הבארות.
  5. הוסיפו 200 מיקרוליטר מבופר החוסם לכל אחת מהבארות (איור 2) ואטומים היטב את הלוח עם שכבת פרפין. דגרו אותו במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטוף את הצלחת כפי שצוין למעלה (איור 2).
  6. הוסיפו 100 מיקרוליטר מתמצית הקלוז מ-10 מפעלי הבקרה המחוננים ב-Xvm ו-10 מפעלי בקרה לבארות המיועדים. הוסף 100 מיקרו-ליטר מתקני הלמינרין לבארות אחרות. הוסף 100 מיקרו-ליטר מהריק לבארות אחרות (איור 2).
  7. אטום את הצלחת היטב עם שכבת פרפין ודוגר ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר. שטוף את הצלחת שוב כפי שצוין למעלה (איור 2).
  8. הוסף 100 מיקרוליטר מהנוגדן הראשי (1-3-β IgG עכבר המכוון גלוקן) שהוכנה באמצעות בופר החסימה לכל אחת מהבארות (איור 2).
  9. אטום את הפלטה היטב עם שכבת פרפין ודגר במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואז שטוף את הפלטה כפי שמצוין לעיל (איור 2).
  10. הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן משני אנטי-עכבר IgG-Alkaline פוספטאז לכל באר46,47 (איור 2).
  11. אטום את הצלחת היטב עם סרט פרפין ודגר אותו ללילה בטמפרטורה של 4°C במקרר. לאחר מכן, שטפו את הצלחת כפי שמצוין למעלה (איור 2).
  12. הוסף 100 מיקרולטר של תמיסת פרא-ניטרופניל פוספט (pNPP) טרייה בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (טבלה 1) לבארות (איור 2)
  13. דגור את הצלחת על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקותו-48 דקות.
    הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לדגימות הצמח ולתקן השימוש. במחקר זה, למינרין קיבל את הקריאה הטובה ביותר ב-30 דקות.
  14. סיימו את התגובה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה טרייה (0.5 M NaOH) לכל אחת מהבארות48 (איור 2).
  15. העבר את הלוח לקורא מיקרופלט (מאוזן ל-37 מעלות צלזיוס), נער אותו במהירות בינונית במשך דקה אחת, וקרא את הספיגה ב-405 ננומטר48 (איור 1, איור 2).

5. ניתוח נתונים

  1. בצע רגרסיה ליניארית פשוטה של ספיגת למינרין ב-405 ננומטר מול ריכוז הלמינרין (μg/mL) כדי לקבל את העקומה הסטנדרטית. משוואת העקומה התקנית היא
    Y = β1X + β0
    כאשר Y מייצג את ספיגת הלמינרין ב-405 ננומטר,β 1 הוא השיפוע של קו הרגרסיה (מקדם קורלציה של פירסון), X הוא Log10 (ריכוז למינרין במיקרוגרם/מ"L) ו-β0 הוא האינטרספט.
  2. חישבו ריכוזי קלוז בדגימות הקורום על ידי הפחתת הספיגה של הבלנק מהספיגה של הדגימות. לאחר מכן משתמשים בעקומה הסטנדרטית כדי להעריך את ריכוז הקלוז במיקרוגרם/מ"ל כמקביל למינרין (LE).
  3. בדוק את כל הנתונים לנורמליות ההתפלגות באמצעות מבחן שפירו-וילק ובודק הומוסקדסטיות של שונות באמצעות מבחן לבן (α > 0.05).
  4. השתמשו במבחן t מדגם עצמאי כדי להשוות את ייצור הקלוז בין קבוצות ה-Xvm-מחוננות לקבוצת הביקורת (p≤ 0.05).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריכוזים הידועים של תקני הלמינרין נותחו באמצעות ספקטרופוטומטריה וערכי הספיגה המתאימים שלהם נרשמו. בהתבסס על נתונים אלו, נבנה תרשים ביר-למברט על ידי מישום ריכוזי תקני הלמינרין בציר ה-x והספיגה בציר ה-y. משוואת קו הרגרסיה הייתה y = 0.5079x − 0.04534 (איור 3)49. תרשים ביר-למברט נתן מקדם מתאם גבוה (r) של 0.9988 ומקדם קביעה (r2) של 0.9975, המצביעים על קשר ליניארי חזק בין ריכוז לספיגה ועד 0.9975 של השונות במשתנה התלוי (ספיגה) הוסבר על ידי המשתנה הבלתי תלוי (ריכוז; איור 3; עמ<0.0001). לכן, מודל זה התאים, מדויק ואמין לחיזוי ריכוז הלמינרין והקבלוז. ריכוז הקלוז בדגימות הקורום הבננה נקבע על ידי מדידת ספיגת דגימות הקורום באמצעות ספקטרופוטומטריה ושימוש בערכי הספיגה לחישוב ריכוזי הקלוז באמצעות המשוואה.

בדיקת ספקטרופוטומטריית אימונופלואורסצנציה הראתה עלייה משמעותית בקלוזה מושרה בצמחים עם חינונים-Xvm בהשוואה לקבוצת הביקורת בשני הגנוטיפים של הבננות (בדיקת t-דגימה עצמאית, p < 0.05; איור 4). ייצור הקלוז במפעלי הבקרה ב-14 dpi היה 1474.34 מ"ג/מ"ל ו-1037.11 מ"ג/מ"ל עבור Mbwazirume ו-M. balbisiana, בהתאמה (איור 4). החיסון של הצמחים ב-Xvm הניב 4190.78 מ"ג/מ"ל ו-1996.07 מ"ג/מ"ל קלוז בקורמים של צמחי Mbwazirume ו-M. balbisiana שהוכנו ב-Xvm בעוצמה של 14 dpi, בהתאמה (איור 4). חיסון Xvm גרם לייצור קלוז גבוה פי 1.9 עד פי 2.8 בהשוואה למפעלי הביקורת (מבחן t-דגימה עצמאי, p < 0.001; איור 4).

figure-results-1
איור 1: איור סכמטי של השלבים המרכזיים בכימות קלוז באמצעות שיטת ספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציונית חדשה. איור זה מדגים את השלבים המרכזיים בכימות קלוז מרקמות בננה, הכוללים העלאת צמחים קטנים שמקורם בתרבות רקמה, חיסון ב-Xvm, דגימה הרסנית של רקמות הקורמ, ייבוש בהקפאה של הדגימות, הפקת קלוז וכימות קלוז באמצעות שיטת ספקטרופוטומטריית אימונופלואורסצנציה חדשה. איור זה הודפסמחדש ב-50. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: איור סכמטי מפורט של שיטת ספקטרופוטומטריית אימונופלואורסצנציה לכימות קלוס. איור זה מציג הדגמה מפורטת של שיטת הספקטרופוטומטריה האימונופלואורסצנציונית לכימות קלוז, ומראה כיצד לוחית ELISA נטענת ברכיבים השונים וכיצד קלוז נמדדת סופית באמצעות ספקטרופוטומטריה. איור זה הודפסמחדש ב-50. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: כימות חלבונים. תרשים ביר-למברט התבסס על תקני למינרין של ריכוזים ידועים וקריאות ספיגה (ב-405 ננומטר) המשמשים לחישוב ריכוזי קלוז (כמקבילים למינרינים, LE) מקריאות ספיגה של דגימות הקורם. איור זה הודפסמחדש ב-49. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: השוואת ריכוז קלוז. השוואה של ריכוזי הקלוז הממוצעים (ממוצע ± SEM, n = 9) בקורמים של צמחי בננה M. balbisiana ו-Mbwazirume שחוסנו ב-Xvm כפי שנקבע בשיטת הספקטרופוטופוטומטריה החדשה לאימונופלואורסצנציה (מבחן t מדגם עצמאי, α ≤ 0.05) אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

בופרהרכבאחסון
מאגר חסימה10 גרם אלבומין סרום בקר (BSA; 1% w/v), מומס ב-1 ליטר PBS.-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים
בופר ציפוי1.59 גרם נתרן פחמתי (Na2CO3), 2.93 גרם נתרן ביקרבונט (NaHCO3), 0.2 גרם נתרן אזיד (NaN3), מתמוססים ב-1 ליטר שלH2O דה-יונזי, pH 9.6.-20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים
בופר צמוד2 גרם PVP (2% w/v), מומס ב-1 ליטר של בופר חסימה.-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים
תמיסת פארא-ניטרופניל פוספט (pNPP)המיס פארא-ניטרופניל פוספט (pNPP) בבופר הסובסטרט לריכוז עבודה של 1 מ"ג/מ"ל-20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים
סליין ממוגן בפוספט (PBS)8.0 גרם נתרן כלוריד (NaCl), 0.2 גרם פוספט אשלגן מונובסיסי (KH2PO4), 1.15 גרם פוספט נתרן די-בסיסי (Na2HPO4), 0.2 גרם כלוריד אשלגן (KCl), 0.2 גרם נתרן אזיד (NaN3), מומסים ב-1 ליטר שלH2O, pH 7.4.-20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים
נוגדן ראשי בבופר חוסםלשחזר את הנוגדן הראשוני הליופילי לפי הוראות היצרן כדי לקבל את המלאי המרוכז. דיללו את מלאי הנוגדן הראשוני שהתקבל מחדש בבופר החסימה לריכוז עבודה של 2 מיקרוגרם/מ"ל.-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים
נוגדן ראשוני בבופר הציפוילשחזר את הנוגדן הראשוני הליופילי לפי הוראות היצרן כדי לקבל את המלאי המרוכז. דילל את מלאי הנוגדנים הראשוני שהתקבל מחדש בבופר הציפוי לריכוז עבודה של 2 מיקרוגרם/מ"ל.-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים
נוגדן משני1:1000 של ריכוז נוגדנים משני: בופר צמוד-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים
בופר מצע97 מ"ל דיאתנולאמין, 0.2 גרם נתרן אזיד (NaN3), מתמוססים ב-1 ליטר של H2O דה-יונ, pH 9.8-20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים
בופר שטיפה0.5 מ״ל Tween 20 (0.05% v/v), מומס ב-1 ליטר PBS, pH 7.5-20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים

טבלה 1: מתכון לבופרים.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת הספקטרופוטומטריה האימונופלואורסצנציונית יושמה לראשונה בכימות קלוז בקורמות בננה. היא מבוססת על אנזים אימונואסיי (EIA), המשמשת לכימות קלוז בתמצית גולמית של 1 מיליון NaOH של בננה באמצעות נוגדנים ספציפיים לקבלת 47,51,52. בקצרה, מבחן הכימות החדש הזה, המבוסס על ספקטרופוטומטריה איממונופלואורסצנציה, ספציפי לקלוז, כלל ציפוי של המיקרופלוחת בנוגדן ייעודי לקלוז שמתחבר לאחר מכן לקלוזה בתמצית הצמח, ואחריו נוגדן משני שגם הוא ייחודי לקלוז. לאחר מכן מתווסף זיהוי נוגדן המקושר לאנזים (פוספטאז בסיסי) ויוצר קומפלקס עם הנוגדן המשני. לאחר מכן מתווסף סובסטרט, פארא-ניטרופניל פוספט (pNPP). הכימות של קלוז בדגימה מתבסס על יכולתו של פוספטאז אלקליני לחתוך את קבוצות הפוספט ממולקולות pNPP, מה שמוביל להיווצרות תרכובת צהובה (p-nitrophenol). זיהוי עוצמת הצבע הצהוב נעשה באמצעות ספקטרופוטומטר ב-405 ננומטר, ולאחר מכן הספיגה נקשרה לפעילות פוספטאז אלקלינית, שהייתה פרופורציונלית ישירות לריכוז הקלוז שנמצא בדגימה. התגובה נעצרה על ידי העלאת ה-pH באמצעות הוספת 0.5 M NaOH, שמנעה פעילות נוספת של פוספטאז אלקליני.

לעומת זאת, שיטת הזהב הסטנדרטית למיקום וכימותי קלוז היא שיטת מיקרוסקופיית אפיפלואורסצנטית, שיטה מבוססת היטב על צביעת קלוז בפלואורוכרום כחול אנילין53. בקצרה, שיטה זו מבוססת על קישור ספציפי של צבע אנילין כחול לבטא-1,3-גלוקנים (קלוזה) היוצרים קומפלקס. הכחול האנילין במתחם זה מעורר באמצעות אור אולטרה סגול (אורך גל של 365-375 ננומטר). כאשר צבע האנילין הכחול מעורר, הוא פולט פלואורסצנציה כחולה שנלכדת כדי לאפשר ויזואליזציה ספציפית של קלוז ברקמות הצמח53. כימות של קלוז מוצבע בכחול אנילין מתבצע באמצעות סדרת טכניקות הדמיה שמכימות את כמות הפלואורסצנציה המגיעה מרקמות הצמח. הפלואורסצנציה פרופורציונלית לכמות הקלוז הזמינה ברקמות הצמח. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי שימש לוויזואליזציה וכימות של קלוז בלחץ ביוטי54.

במחקר נפרד, נקבעה שקיעת קלוז באמצעות מיקרוסקופיית אפיפלואורסצנציה וספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציונית49. למרות שנצפו מספר הבדלים בנתונים, הניתוח הסטטיסטי הראה ברובו התאמה בין נתוני מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי לספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנטית, מה שמעיד על עקביות בשתי שיטות גילוי קלוז49. בעוד שהתוצאות משתי השיטות היו חכמות ברובן, מומלץ שמיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה וספקטרופוטופוטומטריה אימונופלואורסצנציונית ישלימו זו את זו להערכה אמינה יותר. למרות שהשיטה המבוססת על ELISA היא ספציפית לקלוס, רגישה ואמינה, היא בתחילה גוזלת זמן במהלך אופטימיזציה של הפרוטוקול וקבלת עקומת תקן מתאימה ביותר שמתאימה לכל הריכוזים והספיגות.

חלק מהשיטות לכימות קלוז הן מייגעותב-17,32,55, גוזלות זמןב-26,56, ואינן ספציפיות לקלוס, שכן אנילין כחול יכול לצבוע גלוקנים β-1,3-גלוקנים אחרים מלבד קלוז30, ודורשים תוכנות ספירת קלוז יקרות ומתוחכמות 23,24,26, דורש מיומנויות טכניות מתחשבות, והרקע/אוטופלואורסצנציה הגבוהה הקשורה לספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה הופכת את כימות הקלוז לקשה ולא אמין26. שיטות כימות קאלוז המבוססות על תהליך אוטומטי של ניתוח תמונות כמו תוכנת ImageJ דורשות הדרכה מתאימה לתוסף ניתוח תמונה, כגון Trainable Weka Segmentation (TWS) עבור ImageJ, וזה מאוד מסורבל57.

בדיקות מבוססות ספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציה מועדפות מאוד בשל הספציפיות, הרגישות, קלות השימוש והשחזוריות שלהן. עם זאת, חשוב לציין שמערכת הזיהוי ורגישותה עשויים להשתנות בהתאם לפרוטוקול הבדיקה הספציפי ולציוד בו משתמשים.

כאן מתוארת שיטה חדשה לכימות קלוז המבוססת על ספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנטית. השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש לכימות קלוז ברקמות ומינים שונים של צמחים עם רמת ספציפיות מספקת לקלוז, דיוק גבוה ושחזוריות. שיטה זו היא תוספת לשיטות הכימות השונות של קלוז וניתן להשתמש בה למעקב אחר שינויים ברמות הקלוז במהלך הצמיחה וההתפתחות בצמחים ובתגובה לגירויים או טיפולים שונים. יתרה מזאת, השימוש בפלטת 96 בארות מפחית דגימה וניתוח סובייקטיביים, מה שהופך את השיטה למתאימה לכימות קלוז בתפוקה גבוהה. ראוי לציין שלמרות שניתן להפיק קלוז בקלות מרקמות צמחים שנקטפו זה עתה 17,27,55, שלב הכנת הדגימה הכולל ייבוש בהקפאה הכלול לפי הפרוטוקול החדש מספק מנוף לשמירת הדגימות לאורך זמן רב (עד שנה) ומאפשר אחסון ומשלוח של דגימות ביולוגיות מתכלות בין מעבדות רחוקות בטמפרטורות הסביבה. דבר זה מאפשר חילוץ קלוז חוזר ללא צורך להגדיר שוב ושוב את כל הניסוי לאיסוף דגימות חדשות.

ספקטרופוטומטריית אימונופלואורסצנציה מומלצת לניסויי כימות קלוז בעלי תפוקה גבוהה, בעוד שמיקרוסקופיית אפיפלואורסצנציה ומיקרוקופיית אימונופלואורסצנציה יכולים לשמש הן לכימות קלוז והן ללוקליזציה ההיסטורית של קלוז ברקמות הצמח. כדי להבטיח התפלגות מדויקת, יעילה ואמינה של קלוז ברקמות הצמח, מומלץ להשתמש בשיטות שונות לכימות קלוז בו-זמנית, הכוללות מיקרוסקופיה, ספקטרופוטומטריה ושיטות מבוססות פעילות אנזימים. כתוצאה מכך, הדבר יאפשר הבנה מדויקת ויעילה של תפקיד הקלוז בתגובות פיזיולוגיות ולחצים שונות. מחקרים עתידיים יוכלו להעריך באופן מקיף ובמקביל מספר שיטות לכימות קלוס, הכוללות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה, ספקטרופוטומטריה אימונופלואורסצנציונית ושיטות מבוססות פעילות אנזימטית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס, מספר מענק INV 009894/OPP1134098. למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוחים או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד; או בהחלטה לפרסם את התוצאות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נייר אלומיניום Kim-Fay EA Limited, ניירובי, קניה
איזון אנליטי  מטלר-טולדו AG, גרייפנזה, שווייץML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., ברטלסוויל, אוקלהומה, ארה"ב1001 אירו
נייר הכתמה Kim-Fay EA Limited, ניירובי, קניה
אלבומין סרום בקר (BSA) תרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"בB14
צנטריפוגה, 5425Rאפנדורף, המבורג, גרמניה5406000240
מקרר משולב - מקפיא (4 מעלות; C ו-& מינוס; 20 ודרגה C) חברת Haier Medical and Laboratory Co. Ltd., צ'ינגדה, סיןHYCD-282
דיאתנולאמין  PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד191287
דיגיטל שייקר, MixMateאפנדורף, המבורג, גרמניה5353000529
די-נתרן מימן פוספט (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד141679
לוחות ELISA, 96 בארים, בסיס שטוח, שקוף, פוליסטירן, חיבור גבוהסארסטדט AG & חברת KG, Nü מברכט, גרמניה82.1581.200
פילטר לקורא המיקרופלט iMark, iMark 680, 405 ננומטרLasec International Pty. Ltd., קייפטאון, דרום אפריקהBRD1681011
Freeze-drier, VirTis— BenchTop " K” סדרות; דגם: 4KBTXLLabWrench, קנדה, ארה"ב448053
חומצה כלורית (HCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד141020
חממת הסעה מאולצת איזותרמית, IFA-54-8קבוצת Esco Lifesciences, סינגפור2100002
למינרין אלפא איסר, מסצ'וסטס, ארה"בJ66193
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל אפנדורף, המבורג, גרמניה022363204
צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל Genesee Scientific Corp., קליפורניה, ארה"ב24– 283
מיקרופיפטה (30– 300 & mu; L), 12 ערוצים, 2100 עונות;אפנדורף, המבורג, גרמניהEP-12-300R
טיפים למיקרופיפטה epT.I.P.S.  סינגליםאפנדורף, המבורג, גרמניה022363204
מיקרופיפטות (0.5– 1000 & mu; L), מחקר ו-nbsp; פלוסאפנדורף, המבורג, גרמניה3123000900
קורא ספיגת מיקרופלטה, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., קליפורניה, ארה"ב1681135EDU
תוכנת Microplate Manager 6 גרסה 6 Bio-Rad Laboratories, Inc., קליפורניה, ארה"ב1689520
פאראפילםפול מריאנפלד GmbH & פלוגה KG, לאודה-ק&אומל; ניגסהופן, גרמניה740751
פארא-ניטרופניל פוספט (pNPP)מרק KGaA, דרמשטאדט, גרמניה20-106
מד pH, HI9126האנה אינסטרומנטס, וונסוקט, רוד איילנד, ארה"ב02310048991
פוליווינילפירולידון (PVP) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרדA2260
כלוריד אשלגן (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרדA2939
פספט די-מימן אשלגן (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד141509
אמבט מים מדויק, GP10תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, ניוינטון, קונטיקט, ארה"בTSGP10
נוגדן ראשוני (1-3-&בטא;-IgG עכבר מונחה גלוקן) ביולוגיה מספקת את Australia Pty Ltd., מלבורן, אוסטרליה400-2
מאגרי תגובה תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, מסצ'וסטס, ארה"ב15075
נוגדן משני המקושר לפוספטאז אלקלין (אנטי-IgG-אלקלין פוספטאז לעכברים) מדעי החיים סיגמא, ניו ג'רזי, ארה"בA5153
נתרן אזיד (NaN3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרדA1430
נתרן פחמתי (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד141648
נתרן כלוריד (NaCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרדA2942
פחמת מימן נתרן (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד141638
נתרן הידרוקסיד (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí מיקה, SLU, ברצלונה, ספרד141687.1210
טווין-20תאגיד ביומטיק, אונטריו, קנדהA4031
מים מזוקקים אולטרה-טהוריםתרמו פישר סיינטיפיק, מסצ'וסטס, ארה"ב10-977-015

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים