הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

4.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65851

⸱

1 בדצמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

תקציר

סיבי שרירי השלד המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שרירי העכבר הם מודל שימושי לניסויים פיזיולוגיים. עם זאת, רוב המאמרים עוסקים בסיבים הקצרים של ה-FDB (flexor digitorum brevis), המגבילים את טווח התוצאות העוסקות בסוגי סיבים, מגבילים את כמות החומר הביולוגי הזמין ומונעים קשר ברור בין תופעות פיזיולוגיות תאיות לבין ידע ביוכימי ודינמי קודם שהושג בשרירים אחרים.

מאמר זה מתאר כיצד להשיג סיבים שלמים משישה שרירים בעלי פרופילים ואורכים שונים של סוגי סיבים. באמצעות C57BL/6 עכברים בוגרים, אנו מראים את פרוטוקול דיסקציית השרירים ובידוד הסיבים ומדגימים את התאמת הסיבים למחקרים חולפים Ca2+ ואפיונם המורפומטרי. הרכב סוג סיבים של השרירים מוצג גם. כאשר מנותקים, כל השרירים נותרו שלמים, סיבים חיים המתכווצים במהירות במשך יותר מ -24 שעות. FDB נתן קצר (<1 מ"מ), peroneus digiti quarti (PDQA) ו peroneus longus (PL) נתן ביניים (1-3 מ"מ), בעוד extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), ושרירי סולאוס שחררו סיבים ארוכים (3-6 מ"מ).

כאשר תועדו עם הצבע המהיר Mag-Fluo-4, Ca2+ transients של סיבי PDQA, PL ו-EHL הראו קינטיקה מהירה וצרה המזכירה את סוג המורפולוגיה II (MT-II), הידוע כמתאים לסיבים מסוג IIX ו-IIB. זה עולה בקנה אחד עם העובדה כי שרירים אלה יש מעל 90% של סיבים מסוג II לעומת FDB (~ 80%) ו soleus (~ 65%). מעבר ל-FDB, אנו מדגימים לראשונה דיסוציאציה של מספר שרירים, היוצרים סיבים המשתרעים על פני טווח אורכים שבין 1 ל-6 מ"מ. סיבים אלה הם קיימא ונותנים Ca2+ מהיר transients, המציין כי MT-II ניתן להכליל סיבים מהירים IIX ו- IIB, ללא קשר למקור השריר שלהם. תוצאות אלה מגדילות את הזמינות של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

מבוא

שריר השלד הבוגר של יונקים הוא רקמה רב תכליתית. הוא מווסת בכבדות את חילוף החומרים, הוא המקור העיקרי לייצור חום, ותכונותיו הדינמיות מעניקות לו תפקיד מפתח בנשימה, תנועה של מקטעי גוף, או תזוזה מנקודה אחת לאחרת 1,2,3. שרירי השלד רלוונטיים גם לפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל מצבים תורשתיים וכרוניים, כגון מיופתיות, ניוון או סרקופניה, כמו גם מצבים כרוניים רבים שאינם שרירים, כגון מחלות לב מטבוליות 3,4,5,6,7,8.

מחקר ex vivo של התכונות המבניות והתפקודיות של שרירי שלד בוגרים בהקשר של בריאות ומחלות התאפשר בעיקר באמצעות שני מודלים ניסיוניים: שריר שלם וסיבים מבודדים. במאהה-20, חוקרים ניצלו את התכונות של השרירים השלמים, השלמים extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ו-gastrocnemius של מינים קטנים שונים כמודלים מרכזיים כדי ללמוד על יחידות מוטוריות, סוגי סיבים ותכונות דינמיות כגון כוח וקינטיקה של כיווץ והרפיה 9,10,11,12,13,14,15,16. עם זאת, הופעתם של מחקרים מעודנים יותר בביולוגיה של התא העבירה את האזור לחקר סיבי שריר בודדים. עבודה חלוצית אפשרה אז בידוד של סיבי flexor digitorum brevis (FDB) שלמים של חולדות על ידי דיסוציאציה אנזימטית לצורך אפיון עוקב 17,18,19. למרות סיבי FDB ניתן להשיג גם על ידי דיסקציה ידנית20, הקלות והתפוקה הגבוהה של דיסוציאציה אנזימטית של שרירי מורין, בנוסף להתאמתם למגוון גישות ניסיוניות, הפכו את המודל האחרון בשימוש נרחב במהלך שני העשורים האחרונים.

סיבי ה-FDB הקצרים מתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביופיזיקליים אחרים, ניתוחים ביוכימיים, מטבוליים ופרמקולוגיים, ניסויים במיקרוסקופ אלקטרונים ופלואורסצנטיים, טרנספקציה לגישות ביולוגיה של התא, או כמקור לתאי גזע במחקרי מיוגנזה 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. עם זאת, שימוש רק בסיבי FDB בניסויי שרירים מצמצם את היקף המחקר העוסק בסוגי סיבים ומגביל את כמות החומר הביולוגי הזמין לטכניקות מתודולוגיות מסוימות או להשגת מידע נוסף מחיה אחת. מגבלות אלה מעכבות התאמה ברורה של תופעות פיזיולוגיות תאיות עם מחקרים ביוכימיים ודינמיים קודמים שבוצעו בשרירים שלמים ושלמים שונים (למשל, EDL, soleus, peronei).

התגברות על מגבלות אלה, קבוצות מסוימות הצליחו לנתק את שרירי EDL וסוליאוס הארוכים יותר 24,33,34,35,36,37,38,39,40, ובכך פתחו את הדלת להרחיב עוד יותר את השיטה לשרירים רלוונטיים אחרים. עם זאת, השימוש בסיבי EDL ו-soleus עדיין נדיר, ככל הנראה בשל היעדר פרטים מתודולוגיים לקבלת סיבים שלמים. כאן, אנו מתארים בפירוט כיצד לבודד סיבים באורכים וסוגים שונים משישה שרירים: שלושה מהם כבר תוארו (FDB, EDL, ו soleus) ושלושה מהם בהצלחה מנותקים בפעם הראשונה (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL], ו peroneus digiti quarti [PDQA]). תוצאות העבודה הנוכחית מאשרות כי המודל של סיבים מנותקים אנזימטית מתאים למגוון רחב של מחקרים ומתאמים עתידיים עם נתונים שפורסמו בעבר, ובכך מגדיל את זמינותם של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה בניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת אנטיוקיה (UdeA) (פרוטוקול 104 מיום 21 ביוני 2016 ו-005 מיום 15 באפריל 2021), על פי חוק 84 משנת 1989 והחלטה 8430 משנת 1993 שהונפקו על ידי ממשלת קולומביה ובוצעו ודווחו בהתאם למחקר בבעלי חיים: הנחיות דיווח בניסויי Vivo (ARRIVE)41. כל התוצאות המוצגות כאן מגיעות מעכברים בריאים, בני 7-13 שבועות, 20-26 גרם, C57BL/6 זכרים. איור 1 מראה את העיצוב הכללי של מחקר זה ואת סדר ההליכים. כל הריאגנטים, החומרים ופרטי הציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים

  1. אכלסו עד שישה עכברים לכלוב אקרילי, שקוף, מלבני, עם מצעים מעץ, בתנאים של טמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 מעלות צלזיוס) ומחזורי אור:חושך (12:12 שעות).
  2. תנו לבעלי החיים גישה חופשית למזון ומי ברז במתקנים ספציפיים לבעלי חיים נטולי פתוגנים ללא העשרה סביבתית.

2. דיסקציה

  1. פתרונות, חומרים וריאגנטים
    1. הכן וסנן (0.22 מיקרומטר) את פתרונות העבודה עם ההרכב הבא (כל הריכוזים ב- mM):
      1. טירוד: 5.4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 גלוקוז, 10 HEPES, pH 7.3
      2. דיסוציאציה: 2.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 0.5 MgCl2, 138 NaCl, 0.1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7.4
      3. מלח חוצץ פוספט (PBS): 137 NaCl, 8.6 Na2HPO4, 2.8 KH2PO4, pH 7.34
    2. הכינו שני תאי נתיחה; סטריאוסקופ; הפעלת מספריים; מספריים עדינים; מלקחיים עדינים; ובקבוקוני זכוכית נקיים, שקופים, לא חרוטיים, ברוחב 1-1.5 ס"מ, בנפח כולל של 3-4 מ"ל עם מכסים. סדרו מערכת לגירוי חשמלי של השרירים בתאי הדיסקציה.
    3. הכינו פיפטות זכוכית פסטר מלוטשות אש ברוחב שונה: 5, 4, 3, 2 ו-1 מ"מ.
    4. הגדר את אמבט המים ל 37 °C (77 °F). לשקול aliquots של 3 מ"ג של collagenase סוג 2.
  2. פרוצדורה
    1. להקריב את העכבר בשיטות שאושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. פריקת צוואר הרחם מומלצת מכיוון שהיא מהירה, פחות מלחיצה ונמנעת מחשיפה לתרופות, שעלולות להשפיע על רקמת השריר (כגון CO2 או חומרי הרדמה מסוימים). התחל בנתיחה באופן מיידי כדי להשיג תוצאות טובות יותר.
    2. הנח את העכבר על משטח קצף והדביק או נעץ את הגפיים הקדמיות. חותכים את שתי הגפיים האחוריות מעל הברכיים עם מספריים ניתוח, מעבירים כל אחד מהם לתא דיסקציה נפרד, ומוסיפים טיירוד קר (10-20 מעלות צלזיוס) כדי לכסות את הרקמה.
      הערה: כל גפה אחורית תיתן שישה שרירים שונים בסדר הבא: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ו- PDQA. התייחסויות אנטומיות מפורטות לניתוח ששת השרירים השלמים מגיד לגיד ניתנות באיור 2 ובמקומות אחרים42.
    3. הצמד את הגפה האחורית הראשונה לחדר הדיסקציה במצב שבו הפנים האחוריות של הרגליים גלויות. הסר את העור תחת הגדלה; לאחר מכן חשפו והסירו את ה-FDB (איור 2). אחסנו אותו בבקבוקון זכוכית מסומן אחד עם 1 מ"ל של תמיסת Tyrode.
      הערה: יש צורך בהגדלה מתאימה ובאימונים קודמים כדי למנוע חתך לא רצוי ברקמת השריר.
    4. חשוף, הסר ואחסן את הסולאוס בבקבוקון נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode. השתמשו במספריים עדינים כדי להפריד תחילה את הגסטרוקנמיוס ולאחר מכן כדי להסיר את הסולאוס כפי שמצוין באיור 2.
    5. לחשוף את הפנים הקדמיות של הרגל, להסיר את העור, ולזהות את הגידים הדיסטליים של שרירי טיביאליס הקדמיים ואת שרירי EDL בקרסול. הסר והשליך את tibialis; לאחר מכן חתכו את הגידים הדיסטליים של ה-EDL (איור 2). המשך בדיסקציה עד להסרת ה-EDL והניחו אותו בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של טירוד.
    6. הסר את שריר ה- EHL, שנמצא רק אחורי ומדיאלי ל- EDL. התחל את הדיסקציה על-ידי זיהוי הגיד ומעקב אחריו לספרה1 , כפי שמצוין בלוח המתאים באיור 2. שמור את השריר בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
    7. זהו ועקבו אחר הגיד החיצוני ביותר של הפרוני כדי לחתוך אותו ולהסיר את שריר ה-PL (איור 2). מניחים את השריר בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
    8. לזהות ולעקוב אחר הגידלספרה 4 ; חתכו אותו והוציאו את שריר ה-PDQA (איור 2). מניחים אותו בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
    9. חזור על ההליך עם הגפה האחורית השנייה.
    10. אספו את שני השרירים מאותו סוג בבקבוקון זכוכית מסומן אחד או בצלחת פטרי קטנה עם תמיסת טירוד.
      הערה: אם מתוכננים לנתח יותר משני זוגות שרירים במהלך פגישת עבודה, גייסו שני חוקרים להליך הנתיחה.

3. פרוטוקול בידוד סיבי שריר

  1. חדש את תמיסת Tyrode בתאי הדיסקציה כדי להסיר פסולת ופרוות עכבר. יוצקים את שרירי ה- FDB לתא דיסקציה אחד, מאמתים את שלמותם ומעבירים אותם לבקבוקון זכוכית חדש עם 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה. חזור על הליך זה עם שרירי EHL, PL ו- PDQA.
    הערה: אם שריר נראה מכווץ יתר על המידה, חתוך או אינו מגיב לגירוי החשמלי, אל תמשיך לשלב הפרוטוקול הבא. במקום זאת, מטבו את פרוטוקול הדיסקציה על-ידי אימות איכות התמיסות (pH, זיהום, אוסמולריות) ורכישת מיומנויות דיסקציה נוספות (איור 1C ווידאו משלים S1).
  2. בצעו חתכים אורכיים או אלכסוניים בשרירי הסולאוס וה-EDL, בהתאם לכיוון הסיבים (איור 2). עבור הסוליאוס, בצע את הגיד המרכזי, חיתוך ~ 80% מאורכו. עבור EDL, פשוט בצע גיד אחד או שניים וחתך בערך באותו אורך כמו עבור soleus. שים כל זוג שרירים בבקבוקוני זכוכית עם 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה.
    הערה: הליך זה הופך את ה-EDL והסוליאוס לקטנים יותר ומאפשר לקולגנאז להיכנס טוב יותר לרקמה. הגדלה מספקת (40-50x), כמו גם מספריים ומלקחיים עדינים, הם חובה. בדוק תמיד את שלמות הדגימה על ידי בדיקה חזותית וגירוי חשמלי לפני שתמשיך לשלב הבא של פרוטוקול הדיסוציאציה.
  3. יש להוסיף 3 מ"ג של collagenase סוג 2 (עם פעילות של 250-300 U / mg) לכל בקבוקון המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה וזוג שרירים. תקנן את הכמות המדויקת של collagenase על ידי התחשבות בפעילות של אצווה האנזים בשימוש.
  4. לדגור על זוגות השרירים באמבט המים במשך 65-90 דקות ב 36.8-37 מעלות צלזיוס, עם רעד עדין.
    הערה: יש להקפיד על בקרת הטמפרטורה. סטנדרטיזציה של ההליך כך השרירים לא להישאר collagenase במשך יותר מ 100 דקות כדי למנוע נזק.
  5. בדוק את הבקבוקונים תחת הגדלה סטריאוסקופית כל 5 דקות לאחר הדקה ה- 65 של הדגירה. כאשר השרירים נראים מעט אדווה, מרופטים ומשוחררים, נערו בעדינות את הבקבוקון וודאו אם חלק מהסיבים מתחילים להתנתק בקלות. אם זה המקרה, לשטוף את השרירים עם Tyrode בטמפרטורת החדר כדי להשבית ולהסיר את collagenase.
    הערה: יש לבצע שטיפה בזהירות, מבלי לגעת בשרירים עם הפיפטות. התחל על ידי הוספת 0.8 מ"ל של Tyrode ולאחר מכן להסיר 0.8 מ"ל של הפתרון. חזור על הליך זה 4-5x וודא שהפתרון הופך לשקוף לחלוטין.
  6. מפרידים יותר סיבים מעיקר השרירים עם טריטורציה עדינה מאוד בטירוד בעזרת סט פיפטות פסטר מלוטשות אש. התחל על ידי תסיסה סביב השריר עם פיפטה רחבה ביותר (5 מ"מ קצה) ולאחר מכן בעדינות למשוך את השרירים למעלה לתוך פיפטה והחוצה 3-4x. כאשר השריר מתחיל לשחרר סיבים ונעשה דק יותר, חזור על התהליך עם פיפטה הבאה (4 מ"מ קצה).
    הערה: סיבים המעובדים באמצעות הליך זה נשארים מעוררים ומתכווצים במהירות במשך יותר מ-24 שעות, כפי שמודגם באמצעות סיבי PL, EDL, EHL ו-soleus ב-Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 ו-Supplemental Video S5.

4. הליכים ניסיוניים

הערה: סיבים מבודדים שימשו להערכות ריכוז סרקופלזמיות Ca2+ , מדידות מורפומטריות ומחקרי ביטוי שרשרת כבדה מיוזין (MHC).

  1. מדידה של Ca סרקופלזמי2+ ריכוז במהלך עווית
    1. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה על תא האמבטיה הניסיוני. מצפים את המגלשה עם 2-3 μL של למינין ומאפשרים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שפכו ~ 400 μL של תרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הרכיבו את תא הניסוי על במה של מיקרוסקופ הפוך המצויד באפיפלואורסנציה (איור 3A).
    3. עורר עוויתות בודדות כדי לאמת את הכדאיות של הסיבים על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 אלפיות השנייה) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי. גם כאשר מחוברים ללמינין, התכווצות הסיבים עדיין ניכרת בעיקר בקצוות.
    4. טען את הסיבים עם 3.5-4.5 מיקרומטר של צבע Ca2+ המהיר Mag-Fluo-4, AM במשך 4-5 דקות בתמיסת Tyrode. לאחר זמן זה, לשטוף בעדינות עם Tyrode כדי להסיר את הצבע החוץ תאי. אפשר לצבע התוך-תאי לעבור דה-אסטריפיקציה למשך ~15-20 דקות בתנאים כהים. תמיד לשמור על הטמפרטורה מתחת 22 °C כדי למנוע את מידור הצבע.
      הערה: הכינו מלאי של Mag-Fluo-4, AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בלבד, כך שהריכוז הסופי של DMSO בתמיסת Tyrode הטעינה יהיה פחות מ-0.5%.
    5. האר את הסיב באמצעות דיודה פולטת אור לבנה (LED) ומסנן עם אורכי הגל הבאים לעירור/דיכרואיק/פליטה: 450-490/510/515 ננומטר (איור 3A).
      הערה: מקורות עירור חלופיים כוללים מנורות פלואורסצנטיות של כספית וקסנון. השתמש בעוצמה ובגודל הנמוכים ביותר האפשריים של נקודת העירור כדי למנוע הלבנה של הצבע ונזק לתא.
    6. עורר את תגובת Ca2+ של הסיב (סרקופלזמי Ca2+ transients) על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 מילישניות) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי ב 20-22 ° C.
    7. אספו ושמרו את אותות האור באמצעות טבילת שמן למרחקים ארוכים פי 40 המתאימה לפלואורסצנטיות וצינור מכפיל אור (PMT) המחובר לדיגיטציה (איור 3A ווידאו משלים S6). ודא קנה מידה בתוכנת הרכישה של 0-200 יחידות שרירותיות (AU) והגדר את פלואורסצנטיות המנוחה (Frest) של הניסוי ל- 10 AU בסולם זה על ידי ויסות גודל נקודת העירור והרווח של PMT. לאחר שההליך מתוקנן, שמור על הרווח ללא שינוי מניסוי אחד לשני וקבע את קנה המידה רק באמצעות התאמות קלות בגודל הספוט.
      הערה: אם מתעוררים תוצרי תנועה, השתמש ב- 20-30 מיקרומטר N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) בתמיסת Tyrode.
    8. נתח וכייל את האותות באופן הבא:
      1. Lowpass מסנן את כל המעקב ב- 1 kHz.
      2. חשב את מנוחת F ב- 1 שניות של העקבה, התאם את משענת F ל- 0, ומדוד את שיא המשרעת הסרקופלזמית Ca2+ transients ' (שיא F). הצג את המשרעת כמו במשוואה (1):
        נוסחת יחס עוצמת הקרינה ΔF/F = Fpeak/Frest, משוואה מתמטית.(1)
      3. חשב את שיא ריכוז Ca2+ ([Ca2+], μM) באמצעות משוואה (2)26 והפרמטרים הבאים: קבוע דיסוציאציה באתרו (Kd) = 1.65 × 105 מיקרומטר2, פלואורסצנטיות מקסימלית (Fmax) של 150.9 AU, פלואורסצנטיות מינימלית (Fmin) של 0.14 AU, ריכוז Mag-Fluo-4 [D]T של 229.1 מיקרומטר26. שיא F הושג כבר בשלב 4.1.8.2.
        נוסחת חישוב ריכוז סידן באנליזה ביוכימית, המציגה את משוואת שיווי המשקל.(2)
      4. מדוד את זמן העלייה מ- 10% ל- 90% מהמשרעת (RT, ms), את משך הזמן בחצי מקסימום (HW, ms) ואת זמן הדעיכה מ- 90% עד 10% מהמשרעת (DT, ms). לאחר מכן, הערך את קינטיקה הדעיכה על פי התאמה עם הפונקציה הדו-מעריכית (משוואה 3):
        נוסחת דעיכה מעריכית, דיאגרמה, ניתוח התאמת נתונים, מידול דינמיקה חולפת.(3)
      5. שמור את הערכים של קבועי הזמן של דעיכה τ1 ו- τ2 (ms) ומשרעת A1 ו- A226.
  2. מדידות מורפומטריות
    1. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה על תא האמבטיה הניסיוני. מצפים את המגלשה עם 2-3 μL של למינין ומאפשרים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שפכו ~ 400 μL של תרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. עורר עוויתות בודדות כדי לאמת את הכדאיות של הסיבים על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 אלפיות השנייה) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי. גם כאשר מחוברים ללמינין, התכווצות הסיבים עדיין ניכרת בעיקר בקצוות.
    3. קבל תמונות של הסיבים החיים באמצעות מטרות 10x ו 20x ומצלמה של לפחות 5 מגה פיקסל רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. אחסן את התמונות ב- . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בקבוצה של ~2-6 תמונות כדי ללכוד לחלוטין סיב ארוך.
    4. דמיינו סרגל כיול מיקרומטר של מיקרוסקופ תחת אותה הגדלה. אחסן את התמונות ב- . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
    5. מדוד את האורכים והקטרים של הסיבים באמצעות כלי הכיול של תוכנה חופשית לניתוחי תמונות באופן הבא:
      1. קבעו קשר בין פיקסלים למרחק הידוע (מיקרומטר) בתמונות בעזרת סרגל כיול המיקרומטר של המיקרוסקופ בעזרת הכלי ניתוח/קביעת קנה מידה כפי שמוצג באיור S1 המשלים.
      2. מדדו אורכים פעם אחת מקצה אחד לשני של הסיב ואת הקטרים ב-2-6 מקומות שונים לאורך הסיב (1-2 מדידות לכל תמונה, בהתאם לאורכו), כמו באיור משלים S1.
      3. דווח על ערך האורך (מיקרומטר או מ"מ) והממוצע של כל הקטרים (מיקרומטר) שנמדדו לסיב.
  3. מחקרי הבעת שרשרת כבדה של מיוסין
    הערה: לפרטים על קביעת MHC על ידי immunofluorescence43 ואלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)33,44,45,46 בשרירים שלמים, ראה קובץ משלים 1. הפרוטוקול להקלדת סיבים על ידי קביעת אימונופלואורסנציה של MHC בתרחיף של סיבים מבודדים FDB הוא כדלקמן:
    1. צפו כל אחת מחמש מגלשות זכוכית נקיות ב-2-3 מיקרוליטר למינין והניחו לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שתשפכו ~300 מיקרוליטר של תרחיף הסיבים על כל מגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. תקנו את התכשירים עם אצטון מקורר במקפיא למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS.
    4. חדרו את קרומי התאים עם PBS בתוספת 0.7% Triton X-100 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS בתוספת אלבומין בסרום בקר 0.2% (BSA) ו-0.04% Triton X-100, ולאחר מכן לחסום עם PBS עם 2% BSA, 2% סרום עיזים ו-0.4% Triton X-100 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS בתוספת 0.2% BSA ו-0.04% Triton X-100 ולדגור עם הנוגדנים העיקריים באופן הבא:
      1. יש לדלל כל נוגדן ראשוני נגד MHC בבקבוקון נפרד ב-PBS עם 1% BSA ו-0.04% Triton X-100: anti-I (1:1,500), anti-II (1:600), anti-IIA (השתמש במדיה מותנית שלמה מההיברידיומה) ו-anti-IIB (1:500).
      2. לדגור על כל שקופית עם נוגדן אחד ואת השקופית הנותרת עם PBS כבקרה במשך 12-16 שעות ב 4 ° C.
        הערה: בפרוטוקול זה, סיבים מסוג IIX נותרו ללא תווית בכל הדגימות.
    7. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS ולדגור על כל המגלשות עם הנוגדן המשני (1:800) המחובר למולקולה ירוקה פלואורסצנטית למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
    8. גרעיני צביעה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst למשך 15 דקות.
    9. יש לשטוף בעדינות 3x עם PBS, להוסיף בזהירות 20-40 μL של אמצעי הרכבה, ולהניח כיסוי.
      הערה: החלפת תמיסה עדינה ושטיפה מבטיחים שעשרות סיבים יישארו מחוברים לשקופית, מה שהופך את הניסוי למבוסס סטטיסטית.
    10. דמיינו כל שקופית באמצעות מטרה של 10x המתאימה לפלואורסצנטיות ומסנן עם אורכי הגל הבאים לעירור/דיכרואי/פליטה: 450-490/510/515 ננומטר וספרו את כל הסיבים החיוביים והשליליים. לחלופין, לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות אותם תנאים טכניים ומצלמה של לפחות 5 מגה פיקסל רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולאחסן אותם ב . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
    11. רשום את הסיבים החיוביים והשליליים של כל שקופית במסד נתונים וחשב את האחוזים של סיבי I, IIA, IIB ו- Total II חיוביים בהתבסס על המספר הכולל של סיבים הקיימים בשקופית המתאימה. חשב את אחוז סיבי IIX על-ידי הפחתת הסכום של IIA+IIB מהאחוז הכולל של סיבי II. הערך את אחוז סיבי I/IIA היברידיים על-ידי הפחתת הסכום של I+II מערך של 100%. לבסוף, הפחיתו את אחוז התאים ההיברידיים מהסכום הכולל של I ו- II כדי לקבל סיבים טהורים מסוג I ו- II.
      הערה: במחקרי הרכב MHC, סוגי סיבים מסומנים באות גדולה ואילו איזופורמים מסומנים באות קטנה46.
  4. צביעת המטוקסילין ואאוזין
    1. מצפים מגלשת זכוכית נקייה ב-2-3 מיקרוליטר למינין ומניחים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני ששופכים ~300 מיקרוליטר מתרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. מקבעים את התכשיר בתמיסה של קרנוי (60% אתנול מוחלט, 30% כלורופורם, 10% חומצה אצטית) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לדגור עם hematoxylin במשך 90 שניות.
    4. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים במי ברז.
    5. לדגור עם 1% eosin Y מוכן 70% אתנול במשך 30 שניות.
    6. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים במי ברז.
    7. לטבול פי 3 לתוך אתנול מוחלט.
    8. לדגור בקסילול במשך 60 שניות.
    9. הוסף 20-40 μL של מדיום הרכבה ולדמיין עם מיקרוסקופ קונבנציונאלי. קבל תמונות בהגדלה הרצויה באמצעות מצלמה צבעונית של לפחות 5 מגה פיקסל.

5. ניתוחים סטטיסטיים וגרפים

הערה: יחידת הניסוי היא סיב שריר.

  1. הצג תוצאות כממוצע ± סטיית תקן וחשב רווחי סמך 95% (CI95%) עבור ניתוחים מסוימים.
  2. כדי להשוות אורך, קוטר וקינטיקה של Ca2+ transients בין קבוצות, בצע ניתוח שונות (ANOVA) ובדיקות פוסט-הוק עם תיקון של Bonferroni.
  3. להעריך נורמליות ושוויון שונות באמצעות מבחני שפירא-וילק ולוין, בהתאמה.
  4. שקול את ההבדלים משמעותיים כאשר p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ריכוז סרקופלזמי Ca2+ במהלך עווית
כדי להדגים את ההיתכנות של ניסויים פיזיולוגיים בקבוצת סיבים מנותקים ולהרחיב את הממצאים הקודמים שלנו על צימוד עירור-כיווץ (ECC) וסוגי סיבים, Ca2+ transients נרכשו בסיבים מכל השרירים. ראשית, FDB (n = 5) ו- EDL (n = 7) הראו קינטיקה Ca2+ המכונה מורפולוגיה מסוג II (MT-II). אלה הם אותות מהירים, קוצניים, אשר RT נמשך ~ 1 ms; שלב הדעיכה שלו יכול להיות מצויד בפונקציה דו-מעריכית כאשר הרכיב הראשון (A1) גדול מ-30% מהמשרעת כולה, והשיא שלו [...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי להשלים את המודלים הזמינים לחקר ביולוגיה של שרירי שלד בוגרים, כאן אנו מדגימים את הדיסוציאציה האנזימטית המוצלחת של מגוון שרירי עכבר עם סיבים קצרים, בינוניים וארוכים. סיבים אלה מאפשרים הדגמה של הכללה של קינטיקה MT-II של Ca2+ transients בשרירי השלד. יתר על כן, סוגי הסיבים בשרירים שלמים שלמים סווגו. בהתחשב בכך שה- FDB הוא השריר הנפוץ ביותר לניסויים פיזיולוגיים, הוערכו סוגי הסיבים הקיימים בתרחיף התא לאחר דיסוציאציה.

סוללה של סיבים שלמים קצרים, בינוניים וארוכים ללימודי ביולוגיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מביעים את תודתם לפרופסור רובינסון רמירז מ-UdeA על העזרה עם בעלי חיים וכמה תמונות ולקרולינה פלאסיוס על התמיכה הטכנית. יוהאן פינדה מקיקה עזר לנו להתקין את מצלמות הצבע והפלורסצנטיות. שיואן נגו, מאוניברסיטת קווינסלנד, הגיה באדיבות את כתב היד. מחקר זה מומן על ידי CODI-UdeA (2020-34909 מה-22 בפברואר 2021, ו-2021-40170 מה-31 במרץ 2022, SIU), ומשרד התכנון UdeA (E01708-K ו-ES03180101), מדיין, קולומביה, ל-JCC. המממנים לא השתתפו באיסוף וניתוח נתונים, בכתיבת כתבי יד או בהגשתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
אתנול מוחלטסיגמא אולדריץ'32221
אצטוןMerck179124
אקרילאמידGibco BRL15512-015
אמוניום פרסולפטPanreac141138.1610
אנטי מיוזין I נוגדןסיגמא אולדריץ'M4276נוגדן ראשוני
נוגדן אנטי מיוזין IIסיגמא אולדריץ'M8421נוגדן ראשוני
אנטי מיוזין IIA נוגדןאמריקאי אוסף תרבותסוג SC-71נוגדן ראשוני. נגזר מ-HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB anti myosin DevelopmentalStudies Hybridoma BankBF-F3-c נוגדן ראשוני
ביס-אקרילאמידAMRESCO0172
אלבומין סרום בקרThermo ScientificB14
מגיב ברדפורדMerck1.10306.0500
ברומופנול כחולקרלו ארבה428658
סידן פחמתיMerck102066
סידן דו-כלוריד (CaCl2)Merck2389
כלורופורםסיגמא אולדריץ'319988
קולגנאז סוג 2וורת'ינגטוןCLS-2/LS004176
קונסול-הרתרמו סיינטיפיק9990440
Coomassie כחול מבריק R 250 Merck112553
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dithiothreitol (DTT)AMRESCO0281
חומצה עידית (EDTAAMRESCO0322,
Eosin YSigma AldrichE4009
גליצרולPanreac 
GlycinePanreac151340.1067
סרום עיזיםSigma AldrichG9023
HematoxylinThermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazoleAMRESCOM136
IsopentaneSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206מוכן רק ב-DMSO. חומצה פלורונית אינה נדרשת ואין להשתמש בה כדי למנוע הידרדרות סיבים.
יישום MercaptoethanolA11080100
MethanolProtokimicaMP10043
עכבריםמספרעבור כתב היד הזה, השתמשנו רק בעכברי C57BL/6. עם זאת, כמה תוצאות ראשוניות הראו שהפרוטוקול עובד היטב עבור עכברי וובסטר שוויצריים באותו גיל ומשקל.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)PromegaV3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)Tocris1870
תרכובת חיתוך אופטימלית (OCT)Thermo Scientific6769006
נוגדן משניThermo ScientificA-11001נוגדן משני נגד עכבר עיזים IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 488
נתרן דודציאל סולפטPanreac 
טריס 0.5 מ', pH 6.8 AMRESCOJ832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethaneAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
<חזק>חומרים
תא חיתוךבהתאמה
Erie Scientific5951PLUS
תא אמבטיה ניסיוניWarner InstrumentsRC-27NE2תא אמבטיה צר עם גירוי שדה, מורכב על פלטפורמה מחוממת PH-6
מלקחיים עדיניםמכשירי דיוק עולמיים500338, 500230
מספריים עדיניםמכשירי דיוק עולמייםמספריים ואנות 501778
פיפטותטיפים
מלוטשים באשבקבוקוני זכוכית עם מכסהמספר2-3 מ"ל
נפח מספריים הפעלהמכשירי דיוק עולמיים501223-G
<חזק>ציוד
צנטריפוגהתרמו סיינטיפיקSL 8R
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסFV1000
CryostatLeicaCM1850
המצלמה הדיגיטליתZeissErc 5s ו-Axio 305Axio 305, יחד עם סטריאוסקופ Stemi 508, שימשו לצילום תמונות במהלך הדיסקציה; בעוד ש-Erc 5s או Axio 208, יחד עם מיקרוסקופ Axio Observer A1, שימשו לצילום תמונות של הסיבים המבודדים ובדיקות האימונופלואורסצנציה
DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
Electrophoresis chamberBio Radמיקרוסקופ הפוך Mini-Protean IV
בשילוב עם פלואורסצנציהZeissAxio Observer A1בשילוב עם מקור אור מתאים, מסננים ומטרות לפוטו-מכפיל פלואורסצנטי
HoribaR928 שפופרת, Hamamatsu, בפוטומטר D104, Horibaמחובר ליציאה הצדדית של מיקרוסקופ הקרינה
Stereoscope ZeissStemi 508
ממריץ כלי דשא אמבט מים S6
 MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
תוכנה חינמית לניתוחי אלקטרופורזותאוניברסיטת קנטקיGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
תוכנה חינמית לניתוח תמונות ומורפומטריההמכונים הלאומיים לבריאותImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
תוכנה מורשית לקליטה וניתוח אותות Ca2+Molecular DevicespCLAMP v10.05
https://www.moleculardevices.com תוכנה מורשית לניתוחים סטטיסטיים וגרפיםOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/
, 14232912111323631209 שקופיות טעונות אישית פסטר מזכוכית מספר

מקורות

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260(2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14(2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939(2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898(2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976(2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118(2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199(2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807(2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074(2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961(2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669(2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796(2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654(2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126(2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075(2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד סיבי שרירתנודות סידןהרכב סוגי סיביםאפיון מורפומטריצימוד עיגור-כיווץעיכול בקולגנאזמיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית
סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.