סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

שריר השלד הבוגר של יונקים הוא רקמה רב תכליתית. הוא מווסת בכבדות את חילוף החומרים, הוא המקור העיקרי לייצור חום, ותכונותיו הדינמיות מעניקות לו תפקיד מפתח בנשימה, תנועה של מקטעי גוף, או תזוזה מנקודה אחת לאחרת ^1,2,3. שרירי השלד רלוונטיים גם לפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל מצבים תורשתיים וכרוניים, כגון מיופתיות, ניוון או סרקופניה, כמו גם מצבים כרוניים רבים שאינם שרירים, כגון מחלות לב מטבוליות 3,4,5,6,7,8.

מחקר ex vivo של התכונות המבניות והתפקודיות של שרירי שלד בוגרים בהקשר של בריאות ומחלות התאפשר בעיקר באמצעות שני מודלים ניסיוניים: שריר שלם וסיבים מבודדים. במאה^ה-20, חוקרים ניצלו את התכונות של השרירים השלמים, השלמים extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ו-gastrocnemius של מינים קטנים שונים כמודלים מרכזיים כדי ללמוד על יחידות מוטוריות, סוגי סיבים ותכונות דינמיות כגון כוח וקינטיקה של כיווץ והרפיה 9,10,11,12,13,14,15^,16. עם זאת, הופעתם של מחקרים מעודנים יותר בביולוגיה של התא העבירה את האזור לחקר סיבי שריר בודדים. עבודה חלוצית אפשרה אז בידוד של סיבי flexor digitorum brevis (FDB) שלמים של חולדות על ידי דיסוציאציה אנזימטית לצורך אפיון עוקב 17,18,19. למרות סיבי FDB ניתן להשיג גם על ידי דיסקציה ידנית²⁰, הקלות והתפוקה הגבוהה של דיסוציאציה אנזימטית של שרירי מורין, בנוסף להתאמתם למגוון גישות ניסיוניות, הפכו את המודל האחרון בשימוש נרחב במהלך שני העשורים האחרונים.

סיבי ה-FDB הקצרים מתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביופיזיקליים אחרים, ניתוחים ביוכימיים, מטבוליים ופרמקולוגיים, ניסויים במיקרוסקופ אלקטרונים ופלואורסצנטיים, טרנספקציה לגישות ביולוגיה של התא, או כמקור לתאי גזע במחקרי מיוגנזה ^{5,21,22,23,24,25,26,27,28,} 29,30,31,32. עם זאת, שימוש רק בסיבי FDB בניסויי שרירים מצמצם את היקף המחקר העוסק בסוגי סיבים ומגביל את כמות החומר הביולוגי הזמין לטכניקות מתודולוגיות מסוימות או להשגת מידע נוסף מחיה אחת. מגבלות אלה מעכבות התאמה ברורה של תופעות פיזיולוגיות תאיות עם מחקרים ביוכימיים ודינמיים קודמים שבוצעו בשרירים שלמים ושלמים שונים (למשל, EDL, soleus, peronei).

התגברות על מגבלות אלה, קבוצות מסוימות הצליחו לנתק את שרירי EDL וסוליאוס הארוכים יותר 24,33,34,35,36,37,38,39,40, ובכך פתחו את הדלת להרחיב עוד יותר את השיטה לשרירים רלוונטיים אחרים. עם זאת, השימוש בסיבי EDL ו-soleus עדיין נדיר, ככל הנראה בשל היעדר פרטים מתודולוגיים לקבלת סיבים שלמים. כאן, אנו מתארים בפירוט כיצד לבודד סיבים באורכים וסוגים שונים משישה שרירים: שלושה מהם כבר תוארו (FDB, EDL, ו soleus) ושלושה מהם בהצלחה מנותקים בפעם הראשונה (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL], ו peroneus digiti quarti [PDQA]). תוצאות העבודה הנוכחית מאשרות כי המודל של סיבים מנותקים אנזימטית מתאים למגוון רחב של מחקרים ומתאמים עתידיים עם נתונים שפורסמו בעבר, ובכך מגדיל את זמינותם של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה בניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת אנטיוקיה (UdeA) (פרוטוקול 104 מיום 21 ביוני 2016 ו-005 מיום 15 באפריל 2021), על פי חוק 84 משנת 1989 והחלטה 8430 משנת 1993 שהונפקו על ידי ממשלת קולומביה ובוצעו ודווחו בהתאם למחקר בבעלי חיים: הנחיות דיווח בניסויי Vivo (ARRIVE)⁴¹. כל התוצאות המוצגות כאן מגיעות מעכברים בריאים, בני 7-13 שבועות, 20-26 גרם, C57BL/6 זכרים. איור 1 מראה את העיצוב הכללי של מחקר זה ואת סדר ההליכים. כל הריאגנטים, החומרים ופרטי הציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים

1. אכלסו עד שישה עכברים לכלוב אקרילי, שקוף, מלבני, עם מצעים מעץ, בתנאים של טמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 מעלות צלזיוס) ומחזורי אור:חושך (12:12 שעות).
2. תנו לבעלי החיים גישה חופשית למזון ומי ברז במתקנים ספציפיים לבעלי חיים נטולי פתוגנים ללא העשרה סביבתית.

2. דיסקציה

1. פתרונות, חומרים וריאגנטים
   1. הכן וסנן (0.22 מיקרומטר) את פתרונות העבודה עם ההרכב הבא (כל הריכוזים ב- mM):
      1. טירוד: 5.4 KCl, 1 MgCl₂, 140 NaCl, 0.33 NaH₂PO₄, 2 CaCl₂, 10 גלוקוז, 10 HEPES, pH 7.3
      2. דיסוציאציה: 2.7 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 0.5 MgCl₂, 138 NaCl, 0.1 Na₂HPO₄, 1 CaCl₂, pH 7.4
      3. מלח חוצץ פוספט (PBS): 137 NaCl, 8.6 Na₂HPO₄, 2.8 KH₂PO₄, pH 7.34
   2. הכינו שני תאי נתיחה; סטריאוסקופ; הפעלת מספריים; מספריים עדינים; מלקחיים עדינים; ובקבוקוני זכוכית נקיים, שקופים, לא חרוטיים, ברוחב 1-1.5 ס"מ, בנפח כולל של 3-4 מ"ל עם מכסים. סדרו מערכת לגירוי חשמלי של השרירים בתאי הדיסקציה.
   3. הכינו פיפטות זכוכית פסטר מלוטשות אש ברוחב שונה: 5, 4, 3, 2 ו-1 מ"מ.
   4. הגדר את אמבט המים ל 37 °C (77 °F). לשקול aliquots של 3 מ"ג של collagenase סוג 2.
2. פרוצדורה
   1. להקריב את העכבר בשיטות שאושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. פריקת צוואר הרחם מומלצת מכיוון שהיא מהירה, פחות מלחיצה ונמנעת מחשיפה לתרופות, שעלולות להשפיע על רקמת השריר (כגון CO₂ או חומרי הרדמה מסוימים). התחל בנתיחה באופן מיידי כדי להשיג תוצאות טובות יותר.
   2. הנח את העכבר על משטח קצף והדביק או נעץ את הגפיים הקדמיות. חותכים את שתי הגפיים האחוריות מעל הברכיים עם מספריים ניתוח, מעבירים כל אחד מהם לתא דיסקציה נפרד, ומוסיפים טיירוד קר (10-20 מעלות צלזיוס) כדי לכסות את הרקמה.
      הערה: כל גפה אחורית תיתן שישה שרירים שונים בסדר הבא: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ו- PDQA. התייחסויות אנטומיות מפורטות לניתוח ששת השרירים השלמים מגיד לגיד ניתנות באיור 2 ובמקומות אחרים⁴².
   3. הצמד את הגפה האחורית הראשונה לחדר הדיסקציה במצב שבו הפנים האחוריות של הרגליים גלויות. הסר את העור תחת הגדלה; לאחר מכן חשפו והסירו את ה-FDB (איור 2). אחסנו אותו בבקבוקון זכוכית מסומן אחד עם 1 מ"ל של תמיסת Tyrode.
      הערה: יש צורך בהגדלה מתאימה ובאימונים קודמים כדי למנוע חתך לא רצוי ברקמת השריר.
   4. חשוף, הסר ואחסן את הסולאוס בבקבוקון נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode. השתמשו במספריים עדינים כדי להפריד תחילה את הגסטרוקנמיוס ולאחר מכן כדי להסיר את הסולאוס כפי שמצוין באיור 2.
   5. לחשוף את הפנים הקדמיות של הרגל, להסיר את העור, ולזהות את הגידים הדיסטליים של שרירי טיביאליס הקדמיים ואת שרירי EDL בקרסול. הסר והשליך את tibialis; לאחר מכן חתכו את הגידים הדיסטליים של ה-EDL (איור 2). המשך בדיסקציה עד להסרת ה-EDL והניחו אותו בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של טירוד.
   6. הסר את שריר ה- EHL, שנמצא רק אחורי ומדיאלי ל- EDL. התחל את הדיסקציה על-ידי זיהוי הגיד ומעקב אחריו לספרה¹ , כפי שמצוין בלוח המתאים באיור 2. שמור את השריר בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
   7. זהו ועקבו אחר הגיד החיצוני ביותר של הפרוני כדי לחתוך אותו ולהסיר את שריר ה-PL (איור 2). מניחים את השריר בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
   8. לזהות ולעקוב אחר הגיד^{לספרה 4} ; חתכו אותו והוציאו את שריר ה-PDQA (איור 2). מניחים אותו בבקבוקון זכוכית נפרד עם 1 מ"ל של Tyrode.
   9. חזור על ההליך עם הגפה האחורית השנייה.
   10. אספו את שני השרירים מאותו סוג בבקבוקון זכוכית מסומן אחד או בצלחת פטרי קטנה עם תמיסת טירוד.
       הערה: אם מתוכננים לנתח יותר משני זוגות שרירים במהלך פגישת עבודה, גייסו שני חוקרים להליך הנתיחה.

3. פרוטוקול בידוד סיבי שריר

1. חדש את תמיסת Tyrode בתאי הדיסקציה כדי להסיר פסולת ופרוות עכבר. יוצקים את שרירי ה- FDB לתא דיסקציה אחד, מאמתים את שלמותם ומעבירים אותם לבקבוקון זכוכית חדש עם 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה. חזור על הליך זה עם שרירי EHL, PL ו- PDQA.
   הערה: אם שריר נראה מכווץ יתר על המידה, חתוך או אינו מגיב לגירוי החשמלי, אל תמשיך לשלב הפרוטוקול הבא. במקום זאת, מטבו את פרוטוקול הדיסקציה על-ידי אימות איכות התמיסות (pH, זיהום, אוסמולריות) ורכישת מיומנויות דיסקציה נוספות (איור 1C ווידאו משלים S1).
2. בצעו חתכים אורכיים או אלכסוניים בשרירי הסולאוס וה-EDL, בהתאם לכיוון הסיבים (איור 2). עבור הסוליאוס, בצע את הגיד המרכזי, חיתוך ~ 80% מאורכו. עבור EDL, פשוט בצע גיד אחד או שניים וחתך בערך באותו אורך כמו עבור soleus. שים כל זוג שרירים בבקבוקוני זכוכית עם 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה.
   הערה: הליך זה הופך את ה-EDL והסוליאוס לקטנים יותר ומאפשר לקולגנאז להיכנס טוב יותר לרקמה. הגדלה מספקת (40-50x), כמו גם מספריים ומלקחיים עדינים, הם חובה. בדוק תמיד את שלמות הדגימה על ידי בדיקה חזותית וגירוי חשמלי לפני שתמשיך לשלב הבא של פרוטוקול הדיסוציאציה.
3. יש להוסיף 3 מ"ג של collagenase סוג 2 (עם פעילות של 250-300 U / mg) לכל בקבוקון המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה וזוג שרירים. תקנן את הכמות המדויקת של collagenase על ידי התחשבות בפעילות של אצווה האנזים בשימוש.
4. לדגור על זוגות השרירים באמבט המים במשך 65-90 דקות ב 36.8-37 מעלות צלזיוס, עם רעד עדין.
   הערה: יש להקפיד על בקרת הטמפרטורה. סטנדרטיזציה של ההליך כך השרירים לא להישאר collagenase במשך יותר מ 100 דקות כדי למנוע נזק.
5. בדוק את הבקבוקונים תחת הגדלה סטריאוסקופית כל 5 דקות לאחר הדקה ה^- 65 של הדגירה. כאשר השרירים נראים מעט אדווה, מרופטים ומשוחררים, נערו בעדינות את הבקבוקון וודאו אם חלק מהסיבים מתחילים להתנתק בקלות. אם זה המקרה, לשטוף את השרירים עם Tyrode בטמפרטורת החדר כדי להשבית ולהסיר את collagenase.
   הערה: יש לבצע שטיפה בזהירות, מבלי לגעת בשרירים עם הפיפטות. התחל על ידי הוספת 0.8 מ"ל של Tyrode ולאחר מכן להסיר 0.8 מ"ל של הפתרון. חזור על הליך זה 4-5x וודא שהפתרון הופך לשקוף לחלוטין.
6. מפרידים יותר סיבים מעיקר השרירים עם טריטורציה עדינה מאוד בטירוד בעזרת סט פיפטות פסטר מלוטשות אש. התחל על ידי תסיסה סביב השריר עם פיפטה רחבה ביותר (5 מ"מ קצה) ולאחר מכן בעדינות למשוך את השרירים למעלה לתוך פיפטה והחוצה 3-4x. כאשר השריר מתחיל לשחרר סיבים ונעשה דק יותר, חזור על התהליך עם פיפטה הבאה (4 מ"מ קצה).
   הערה: סיבים המעובדים באמצעות הליך זה נשארים מעוררים ומתכווצים במהירות במשך יותר מ-24 שעות, כפי שמודגם באמצעות סיבי PL, EDL, EHL ו-soleus ב-Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 ו-Supplemental Video S5.

4. הליכים ניסיוניים

הערה: סיבים מבודדים שימשו להערכות ריכוז סרקופלזמיות Ca²⁺ , מדידות מורפומטריות ומחקרי ביטוי שרשרת כבדה מיוזין (MHC).

1. מדידה של Ca סרקופלזמי²⁺ ריכוז במהלך עווית
   1. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה על תא האמבטיה הניסיוני. מצפים את המגלשה עם 2-3 μL של למינין ומאפשרים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שפכו ~ 400 μL של תרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הרכיבו את תא הניסוי על במה של מיקרוסקופ הפוך המצויד באפיפלואורסנציה (איור 3A).
   3. עורר עוויתות בודדות כדי לאמת את הכדאיות של הסיבים על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 אלפיות השנייה) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי. גם כאשר מחוברים ללמינין, התכווצות הסיבים עדיין ניכרת בעיקר בקצוות.
   4. טען את הסיבים עם 3.5-4.5 מיקרומטר של צבע Ca²⁺ המהיר Mag-Fluo-4, AM במשך 4-5 דקות בתמיסת Tyrode. לאחר זמן זה, לשטוף בעדינות עם Tyrode כדי להסיר את הצבע החוץ תאי. אפשר לצבע התוך-תאי לעבור דה-אסטריפיקציה למשך ~15-20 דקות בתנאים כהים. תמיד לשמור על הטמפרטורה מתחת 22 °C כדי למנוע את מידור הצבע.
      הערה: הכינו מלאי של Mag-Fluo-4, AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בלבד, כך שהריכוז הסופי של DMSO בתמיסת Tyrode הטעינה יהיה פחות מ-0.5%.
   5. האר את הסיב באמצעות דיודה פולטת אור לבנה (LED) ומסנן עם אורכי הגל הבאים לעירור/דיכרואיק/פליטה: 450-490/510/515 ננומטר (איור 3A).
      הערה: מקורות עירור חלופיים כוללים מנורות פלואורסצנטיות של כספית וקסנון. השתמש בעוצמה ובגודל הנמוכים ביותר האפשריים של נקודת העירור כדי למנוע הלבנה של הצבע ונזק לתא.
   6. עורר את תגובת Ca²⁺ של הסיב (סרקופלזמי Ca²⁺ transients) על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 מילישניות) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי ב 20-22 ° C.
   7. אספו ושמרו את אותות האור באמצעות טבילת שמן למרחקים ארוכים פי 40 המתאימה לפלואורסצנטיות וצינור מכפיל אור (PMT) המחובר לדיגיטציה (איור 3A ווידאו משלים S6). ודא קנה מידה בתוכנת הרכישה של 0-200 יחידות שרירותיות (AU) והגדר את פלואורסצנטיות המנוחה (F_rest) של הניסוי ל- 10 AU בסולם זה על ידי ויסות גודל נקודת העירור והרווח של PMT. לאחר שההליך מתוקנן, שמור על הרווח ללא שינוי מניסוי אחד לשני וקבע את קנה המידה רק באמצעות התאמות קלות בגודל הספוט.
      הערה: אם מתעוררים תוצרי תנועה, השתמש ב- 20-30 מיקרומטר N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) בתמיסת Tyrode.
   8. נתח וכייל את האותות באופן הבא:
      1. Lowpass מסנן את כל המעקב ב- 1 kHz.
      2. חשב את _מנוחת F ב- 1 שניות של העקבה, התאם את _משענת F ל- 0, ומדוד את שיא המשרעת הסרקופלזמית Ca²⁺ transients ' (_שיא F). הצג את המשרעת כמו במשוואה (1):
         (1)
      3. חשב את שיא ריכוז Ca²⁺ ([Ca²⁺], μM) באמצעות משוואה (2)²⁶ והפרמטרים הבאים: קבוע דיסוציאציה באתרו (Kd) = 1.65 × 10⁵ מיקרומטר², פלואורסצנטיות מקסימלית (F_max) של 150.9 AU, פלואורסצנטיות מינימלית (F_min) של 0.14 AU, ריכוז Mag-Fluo-4 [D]_T של 229.1 מיקרומטר²⁶. _שיא F הושג כבר בשלב 4.1.8.2.
         (2)
      4. מדוד את זמן העלייה מ- 10% ל- 90% מהמשרעת (RT, ms), את משך הזמן בחצי מקסימום (HW, ms) ואת זמן הדעיכה מ- 90% עד 10% מהמשרעת (DT, ms). לאחר מכן, הערך את קינטיקה הדעיכה על פי התאמה עם הפונקציה הדו-מעריכית (משוואה 3):
         (3)
      5. שמור את הערכים של קבועי הזמן של דעיכה τ₁ ו- τ₂ (ms) ומשרעת A₁ ו- A₂²⁶.
2. מדידות מורפומטריות
   1. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה על תא האמבטיה הניסיוני. מצפים את המגלשה עם 2-3 μL של למינין ומאפשרים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שפכו ~ 400 μL של תרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. עורר עוויתות בודדות כדי לאמת את הכדאיות של הסיבים על ידי הפעלת פולסי זרם מלבניים (0.8-1.2 אלפיות השנייה) דרך שתי אלקטרודות הפלטינה הממוקמות לאורך שני צדי תא הניסוי. גם כאשר מחוברים ללמינין, התכווצות הסיבים עדיין ניכרת בעיקר בקצוות.
   3. קבל תמונות של הסיבים החיים באמצעות מטרות 10x ו 20x ומצלמה של לפחות 5 מגה פיקסל רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. אחסן את התמונות ב- . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בקבוצה של ~2-6 תמונות כדי ללכוד לחלוטין סיב ארוך.
   4. דמיינו סרגל כיול מיקרומטר של מיקרוסקופ תחת אותה הגדלה. אחסן את התמונות ב- . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
   5. מדוד את האורכים והקטרים של הסיבים באמצעות כלי הכיול של תוכנה חופשית לניתוחי תמונות באופן הבא:
      1. קבעו קשר בין פיקסלים למרחק הידוע (מיקרומטר) בתמונות בעזרת סרגל כיול המיקרומטר של המיקרוסקופ בעזרת הכלי ניתוח/קביעת קנה מידה כפי שמוצג באיור S1 המשלים.
      2. מדדו אורכים פעם אחת מקצה אחד לשני של הסיב ואת הקטרים ב-2-6 מקומות שונים לאורך הסיב (1-2 מדידות לכל תמונה, בהתאם לאורכו), כמו באיור משלים S1.
      3. דווח על ערך האורך (מיקרומטר או מ"מ) והממוצע של כל הקטרים (מיקרומטר) שנמדדו לסיב.
3. מחקרי הבעת שרשרת כבדה של מיוסין
   הערה: לפרטים על קביעת MHC על ידי immunofluorescence⁴³ ואלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)33,44,45,46 בשרירים שלמים, ראה קובץ משלים 1. הפרוטוקול להקלדת סיבים על ידי קביעת אימונופלואורסנציה של MHC בתרחיף של סיבים מבודדים FDB הוא כדלקמן:
   1. צפו כל אחת מחמש מגלשות זכוכית נקיות ב-2-3 מיקרוליטר למינין והניחו לה להתייבש במשך 30 שניות לפני שתשפכו ~300 מיקרוליטר של תרחיף הסיבים על כל מגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. תקנו את התכשירים עם אצטון מקורר במקפיא למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS.
   4. חדרו את קרומי התאים עם PBS בתוספת 0.7% Triton X-100 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS בתוספת אלבומין בסרום בקר 0.2% (BSA) ו-0.04% Triton X-100, ולאחר מכן לחסום עם PBS עם 2% BSA, 2% סרום עיזים ו-0.4% Triton X-100 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS בתוספת 0.2% BSA ו-0.04% Triton X-100 ולדגור עם הנוגדנים העיקריים באופן הבא:
      1. יש לדלל כל נוגדן ראשוני נגד MHC בבקבוקון נפרד ב-PBS עם 1% BSA ו-0.04% Triton X-100: anti-I (1:1,500), anti-II (1:600), anti-IIA (השתמש במדיה מותנית שלמה מההיברידיומה) ו-anti-IIB (1:500).
      2. לדגור על כל שקופית עם נוגדן אחד ואת השקופית הנותרת עם PBS כבקרה במשך 12-16 שעות ב 4 ° C.
         הערה: בפרוטוקול זה, סיבים מסוג IIX נותרו ללא תווית בכל הדגימות.
   7. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS ולדגור על כל המגלשות עם הנוגדן המשני (1:800) המחובר למולקולה ירוקה פלואורסצנטית למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
   8. גרעיני צביעה עם 1 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst למשך 15 דקות.
   9. יש לשטוף בעדינות 3x עם PBS, להוסיף בזהירות 20-40 μL של אמצעי הרכבה, ולהניח כיסוי.
      הערה: החלפת תמיסה עדינה ושטיפה מבטיחים שעשרות סיבים יישארו מחוברים לשקופית, מה שהופך את הניסוי למבוסס סטטיסטית.
   10. דמיינו כל שקופית באמצעות מטרה של 10x המתאימה לפלואורסצנטיות ומסנן עם אורכי הגל הבאים לעירור/דיכרואי/פליטה: 450-490/510/515 ננומטר וספרו את כל הסיבים החיוביים והשליליים. לחלופין, לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות אותם תנאים טכניים ומצלמה של לפחות 5 מגה פיקסל רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולאחסן אותם ב . תבנית TIFF לניתוחים לא מקוונים.
   11. רשום את הסיבים החיוביים והשליליים של כל שקופית במסד נתונים וחשב את האחוזים של סיבי I, IIA, IIB ו- Total II חיוביים בהתבסס על המספר הכולל של סיבים הקיימים בשקופית המתאימה. חשב את אחוז סיבי IIX על-ידי הפחתת הסכום של IIA+IIB מהאחוז הכולל של סיבי II. הערך את אחוז סיבי I/IIA היברידיים על-ידי הפחתת הסכום של I+II מערך של 100%. לבסוף, הפחיתו את אחוז התאים ההיברידיים מהסכום הכולל של I ו- II כדי לקבל סיבים טהורים מסוג I ו- II.
       הערה: במחקרי הרכב MHC, סוגי סיבים מסומנים באות גדולה ואילו איזופורמים מסומנים באות קטנה⁴⁶.
4. צביעת המטוקסילין ואאוזין
   1. מצפים מגלשת זכוכית נקייה ב-2-3 מיקרוליטר למינין ומניחים לה להתייבש במשך 30 שניות לפני ששופכים ~300 מיקרוליטר מתרחיף הסיבים על המגלשה. הניחו לסיבים להיצמד ללמינין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. מקבעים את התכשיר בתמיסה של קרנוי (60% אתנול מוחלט, 30% כלורופורם, 10% חומצה אצטית) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. לדגור עם hematoxylin במשך 90 שניות.
   4. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים במי ברז.
   5. לדגור עם 1% eosin Y מוכן 70% אתנול במשך 30 שניות.
   6. יש לשטוף בעדינות 3 פעמים במי ברז.
   7. לטבול פי 3 לתוך אתנול מוחלט.
   8. לדגור בקסילול במשך 60 שניות.
   9. הוסף 20-40 μL של מדיום הרכבה ולדמיין עם מיקרוסקופ קונבנציונאלי. קבל תמונות בהגדלה הרצויה באמצעות מצלמה צבעונית של לפחות 5 מגה פיקסל.

5. ניתוחים סטטיסטיים וגרפים

הערה: יחידת הניסוי היא סיב שריר.

1. הצג תוצאות כממוצע ± סטיית תקן וחשב רווחי סמך 95% (CI95%) עבור ניתוחים מסוימים.
2. כדי להשוות אורך, קוטר וקינטיקה של Ca²⁺ transients בין קבוצות, בצע ניתוח שונות (ANOVA) ובדיקות פוסט-הוק עם תיקון של Bonferroni.
3. להעריך נורמליות ושוויון שונות באמצעות מבחני שפירא-וילק ולוין, בהתאמה.
4. שקול את ההבדלים משמעותיים כאשר p < 0.05.

ריכוז סרקופלזמי Ca2+ במהלך עווית
כדי להדגים את ההיתכנות של ניסויים פיזיולוגיים בקבוצת סיבים מנותקים ולהרחיב את הממצאים הקודמים שלנו על צימוד עירור-כיווץ (ECC) וסוגי סיבים, Ca2+ transients נרכשו בסיבים מכל השרירים. ראשית, FDB (n = 5) ו- EDL (n = 7) הראו קינטיקה Ca2+ המכונה מורפולוגיה מסוג II (MT-II). אלה הם אותות מהירים, קוצניים, אשר RT נמשך ~ 1 ms; שלב הדעיכה שלו יכול להיות מצויד בפונקציה דו-מעריכית כאשר הרכיב הראשון (A1) גדול מ-30% מהמשרעת כולה, והשיא שלו [Ca2+] הוא בין 15 ל-30 מיקרומטר33,47 (איור 3B). התוצאות שלהם מאוגדות (n = 12) בעמודה הראשונה של טבלה 1, בעוד שהתוצאות של הארעיים Ca2+ של הסולאוס (n = 6) מוצגות בעמודה השנייה של טבלה 1. אותות הסולאוס סווגו כמורפולוגיה מסוג I (MT-I, איור 3B) - רחב יותר, עם RT מעל 1.2 מילישניות, A1 נמוך מ-30%, ושיא [Ca2+] בין 7 ל-13 מיקרומטר33,47. שני טורים אלה נחשבו כסימוכין להשוואת מעברי Ca2+ של השרירים החדשים. מאחר שכל הסיבים מ-PDQA (n = 4), PL (n = 6) ו-EHL (n = 4) חלקו את MT-II (איור 3B), הנתונים שלהם מאוגרים (n = 14) בעמודה השלישית של טבלה 1. אותות אלה הראו RT ממוצע של ~1 מילישניות, A1 של ~45%, שיא [Ca2+] מעל 15 מיקרומטר, ומשווים היטב עם התוצאות המוצגות בעמודה הראשונה אך שונות בבירור מאלה המוצגות בטור השני, כפי שאושר על ידי הניתוח הסטטיסטי (טבלה 1). האות המהיר ביותר של כל הדגימה הגיע מסיב EHL, עם ΔF/F של 0.66, [Ca2+] של 16.99 מיקרומטר, RT של 0.85 אלפיות השנייה, HW של 2.42 מילישניות ו-DT של 10.56 אלפיות השנייה. τ1 ו-τ2 היו 1.63 ו-7.21 אלפיות השנייה, בהתאמה, בעוד שהערכים A1 ו-A2 היו 56.60% ו-43.40%. האות האיטי ביותר הגיע מסיב סוליאוס, עם ΔF/F של 0.41, [Ca2+] של 9.76 מיקרומטר, RT של 1.56 אלפיות השנייה, HW של 9.43 מילישניות ו-DT של 31.88 מילישניות. τ1 ו-τ2 היו 2.81 ו-96.42 אלפיות השנייה, בהתאמה, בעוד שהערכים A1 ו-A2 היו 19.55% ו-80.45%. 

סוללה של סיבים קצרים, בינוניים וארוכים
התצפית על הבדלים ברורים בין הסיבים בהתאם למקור השריר שלהם אפשרה אפיון מורפומטרי מלא יותר. ההיסטוגרמות של איור 4 מראות שינויים מרשימים באורכי הסיבים בכל השרירים. זה מודגש כאשר משווים את הסיב הקצר ביותר מ FDB (227.06 מיקרומטר) עם אחד הארוך ביותר מ soleus (5.69 מ"מ). ערכי האורך הממוצע מסוכמים בטבלה 2. נמצאו הבדלים סטטיסטיים מובהקים בין הקבוצות (p < 0.01). תוצאות אלה מאפשרות סיווג סיבי FDB כקצרים (<1 מ"מ); PDQA ו- PL כביניים (1 עד 3 מ"מ); ו-EDL, EHL ו-soleus באורך של >3 מ"מ (איור משלים S2).

לעומת זאת, נצפו הבדלים קלים בקטרים הממוצעים של סיבי כל השרירים (טבלה 2) ובהתפלגות הערכים (איור 4). עם זאת, היו הבדלים סטטיסטיים מובהקים בין הקבוצות (p < 0.01). כאשר הוערכו בפירוט, היו הבדלים בין FDB לבין שריר אחר ובין FDB (FDB 38.40 ± 9.40 מיקרומטר, n = 370) לבין מאגר הסיבים הבינוניים והארוכים (45.07 ± 9.99 מיקרומטר, n = 422, p < 0.05). התא הדק ביותר של כל הדגימה נמדד 18.42 מיקרומטר (FDB) והעבה ביותר הגיע ל-82.79 מיקרומטר (PDQA).

סוגי סיבים המשמשים בניסויים פיזיולוגיים
ראשית, סוגי הסיבים הקיימים בכל שריר שלם נקבעו על ידי immunofluorescence. למעט הסולאוס (soleus), השרירים הראו דומיננטיות של יותר מ-76% מהסיבים מסוג II (איור משלים S3, טבלה 3 וטבלה 4). EHL, PL ו-PDQA הם שרירים מהירים במיוחד, עם יותר מ-90% מהסיבים המהירים ועד 58.8% מהסיבים מסוג IIB, כפי שנמצא ב-PDQA. EHL ו-PDQA היו כמעט נטולי סיבים מסוג I. סיבי I/IIA היברידיים היו נוכחים בכל השרירים באחוזים נמוכים. כצפוי, סיבים מסוג I ו-IIA היוו מעל 82% מכלל סיבי הסולאוס (soleus). שריר זה כמעט נטול סיבי IIB המהירים ביותר. על פי הפרופיל של סוגי סיבים, הסולאוס הוא האיטי ביותר וה- PDQA הוא השריר המהיר ביותר מבין ששת הנבדקים.

לאחר מכן, ומכיוון שהוא רלוונטי יותר לניסויים פיזיולוגיים של סיבים בודדים, נדונה השאלה אילו סוגי סיבים מופיעים בתרחיף התא הנגזר מה-FDB המנותק. נמצא כי פרופיל הסיבים בתרחיף התא משקף את הרכב הסיבים הקיימים בהקפאה: שלושה מתוך ארבעה סיבים מנותקים היו מסוג II (איור 5 וטבלה 3).

לבסוף, הרכב השרירים אושר על ידי הפרדת איזופורמים MHC שלהם באמצעות SDS-PAGE. התוצאות היו עקביות עם הדפוס הכללי שנצפה בבדיקות immunofluorescence. הסולאוס הועשר ב-MHC IIa ו-I, בעוד שה-EDL, EHL והפרוני הועשרו ב-MHC IIx ו-IIb אך היו נטולי I (איור משלים S4).

איור 1: תכנון המחקר. (א) ציוד ופתרונות שיוקמו לפני תחילת הליך הנתיחה. 1. סטריאוסקופ מספר אחת. 2. מלמטה למעלה: סט של חמש פיפטות מלוטשות אש, כלי דיסקציה ובקבוקוני קולגנאז בתוך צידנית ניידת (מארז צהוב). 3. מארז סינון, תא נתיחה, בקבוקוני זכוכית מסומנים עם מכסה, מתלה עם פתרונות מסוננים. 4. כלי נתיחה. 5. סטריאוסקופ עם תא דיסקציה מספר שניים המחוברים למצלמה וממריץ חשמלי. (B) הליך הדיסקציה של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכברים, כפי שמוסבר באיור 2. (C) לאחר הדיסקציה יש לוודא את כיווץ השרירים ותקינתם לפני שממשיכים לשלב הפרוטוקול הבא. השריר השמאלי בפאנל השמאלי מראה שריר PL גלי, מכווץ יתר על המידה ולא מגיב (חץ כחול), אשר לא ישמש להשגת סיבים מנותקים. במקום זאת, פרוטוקול הדיסקציה צריך להיות ממוטב ולהתחיל מחדש. מקבילו PL מנותח היטב (שריר ימין בלוח השמאלי) מציג מראה מוארך ומתכווץ באופן גלוי (וידאו משלים S1). הפאנל מימין מראה שני שרירי EDL (חץ כחול) ושני שרירי FDB בתוך תמיסת הקולגנאז עם המראה הנכון והישר. (D) ברגע שהשרירים מנותקים, שפכו את הסיבים המבודדים לתוך תא הניסוי ובדקו את כיווץ ושלמותם. בלוח השמאלי, סיבי PL חיים (חץ כחול) ומתים. בלוח הימני, סיבי EDL חיים (חץ כחול) ומתים. (ה-ג) שלוש קבוצות של ניסויים בוצעו עם הסיבים המבודדים: (E) מדידות ריכוז Sarcoplasmic Ca2+ במהלך עוויתות (תוצאות באיור 3). (F) ניתוחים מורפומטריים (התוצאות מוצגות באיור 4). דוגמה זו מציגה סיב PL. (G) אימונופלואורסנציה עבור מחקרי ביטוי שרשרת כבדה של מיוזין (התוצאות מודגמות באיור 5). דוגמה זו מציגה סיב FDB מבודד. פסי קנה מידה = 5 מ"מ (B,C), 100 מיקרומטר (D,F,G). קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הפניות אנטומיות ופרוצדורה כללית לניתוח קבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. שורות, מלמעלה למטה, מציגות את השרירים על פי סדר הדיסקציה הטוב ביותר: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ו- PDQA. עמודות, משמאל לימין, מציגות את אבני הדרך במהלך הנתיחה. העמודה הראשונה מראה את השרירים או הגידים הדיסטליים שלהם חשופים כך שהדיסקציה יכולה להתחיל. לדוגמה, חיצים כחולים מצביעים על FDB ו-soleus in situ ועל הגידים הדיסטליים של ה-EDL. שתי העמודות הבאות ממחישות את הדיסקציה עצמה ואת השרירים החשופים לאחר הגיד הדיסטלי שנחתך/נחתך, כפי שמסומן, למשל, עם החץ הכחול בשורה EDL. מומלץ להסיר את ענף ה- FDB המופנה לספרה החמישית. העמודה הימנית ביותר מציגה את השרירים לאחר שהוסרו לחלוטין, כאשר הגידים הפרוקסימליים מכוונים לחלק העליון של התמונות. קווים כחולים ולא רציפים (עמודה ימנית קיצונית) ממחישים את החתכים האורכיים או האלכסוניים שיש לבצע בשרירי הסולאוס וה-EDL כדי להבטיח שהקולגנאז ייכנס לנפחם. מוטות קנה מידה = 5 מ"מ. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: Ca2+ transients שתועדו בסיבים שהתקבלו מקבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. (A) התקנה המשמשת לרכישת ארעי Ca2+ תחת תאורה מעומעמת. פאנל שמאלי: 1. PMT מחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (2). 3. מצלמה צמודה למיקרוסקופ. 4. ממריץ חשמלי המוצמד לתא הניסוי. 5. ניתן להשתמש במערכת המיקרומניפולציה כאשר מתוכננות בדיקות אלקטרופיזיולוגיה והזרקה כדי להשלים את רכישת Ca2+ transients. לוח אמצעי: תא הניסוי (הכנסה) עם התאים הטעונים מותקן על במת המיקרוסקופ ומואר באור כחול (450-490 ננומטר, חץ כחול) כדי לעורר את הצבע. במערך זה, פריטים 1 עד 5 מונחים מעל שולחן נגד רטט ובתוך כלוב של פאראדיי. פאנל ימני: לאחר אימות איכות ההתכווצות וטעינת הצבע באמצעות המצלמה (6), האור הנפלט מופנה ל- PMT, הגירוי החשמלי מתחיל, והאות מוזן לדיגיטציה (7) ולתוכנת הרכישה (8) כדי להקליט את Ca2+ חולף. ניתן לראות את הפונקציה המשולבת של אלמנטים אלה במהלך ניסוי חי בסרטון משלים S6. (B) Ca2+ טרנזיאנטים מייצגים, מכוילים של סיבי עכבר FDB, PDQA, PL, EDL, EHL ו-soleus. האותות הדומים, המהירים והצרים של FDB, PDQA, PL, EDL ו-EHL מאשרים כי MT-II כבר ידוע כי מקורם בסיבי IIX ו-IIB, שהם הנפוצים ביותר בשרירים אלה. לעומת זאת, ארעי הסולאוס איטי וקטן יותר, אופייני ל-MT-I, שתואר במקור בסיבי I ו-IIA. העקומה האדומה מעל אותות EDL וסוליאוס מדגימה כי שלב הדעיכה של MT-I ו- MT-II יכול להיות מצויד בפונקציית דעיכה דו-מעריכית. פסי כיול חלים על כל החלוניות. פס אנכי = 2.5 מיקרומטר של [Ca2+], פס אופקי = 10 אלפיות השנייה. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PMT = צינור מכפיל אור; MT-I = סוג מורפולוגיה I; MT-II = סוג מורפולוגיה II. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מדידות מורפומטריות של סיבים קצרים, בינוניים וארוכים שהתקבלו על-ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכבר. סיבים שלמים, בריאים ומייצגים מכל שריר מתוארים בלוחות העמודים השמאליים ביותר. התמונות נערכו רק כדי להפחית את רעשי הרקע ולשפר את הניגודיות, ללא מניפולציה ישירה של סיבי השריר. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (כל החלוניות). פרוטוקול המדידה, כמו גם המראה והאיכות של הסיבים הארוכים השלמים, ניתן לראות עוד יותר באיור משלים S1. העמודה האמצעית מציגה את התפלגות האורכים, מסודרים מהשריר שיצר את הסיבים הקצרים ביותר (FDB), לשריר עם הסיבים הארוכים ביותר (סולאוס). יש רצף של אורכים כך שיש חפיפה מסוימת בין השרירים, המשתרע על סך של ~ 5.5 מ"מ. התפלגות הקוטר מוצגת בחלוניות העמודות הימניות ביותר. רוב הסיבים הם בין 30 ל 60 מיקרומטר, עם הבדלים קטנים בין השרירים. ניתוחי בדיקה חוזרת (n = 78 סיבים, שווה ערך ל-9.85% מכלל המדגם של n = 792) של המדידות המורפומטריות הראו יכולת שחזור גבוהה מאוד (מקדם שונות ממוצע של 1.77%-רווח בר-סמך 95%, CI95%, 1.26-2.27%─מקדם מתאם ממוצע של 0.99% (CI95% 0.98-0.99)), והדגישו את האמינות הטובה של התוצאות. עקומות התפלגות גאוס נוספו עם תוכנת גרפים מורשית. איור משלים S2 מציג את תרשימי העמודות של הערכים הממוצעים של אורך וקוטר ואת המיזוגים של התפלגות האורך והקוטר של כל השרירים להשוואה קלה יותר. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL, = extensor hallucis longus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מבחני אימונופלואורסנציה עבור סוגי סיבים בתרחיף התא בשרירי FDB מנותקים. תמונות של שדות שונים מציגות סיבי FDB שלמים ומנותקים המודבקים לתחתית השקפים. (A) סיב אנטימיוזין II חיובי (פלואורסצנטיות ירוקה, חץ כחול בהיר אלכסוני) מנוגד בבירור לסיב שלילי (ראש חץ כחול בהיר), מה שמדגים את כוח ההבחנה של הבדיקה. נוכחותם של שני הסיבים בתמונה יכולה להיות מאושרת בגלל תיוג הגרעינים (פלואורסצנטיות כחולה). (B) שדה אחר מראה סיב אנטימיוזין II-חיובי נוסף. (C) זיהוי נכון של שרשרת מיוזין כבדה ברצועות A (פלואורסצנטיות ירוקה) על ידי הנוגדנים אושר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הרצועות השחורות הרוחביות הידועות ביותר לשמצה מתאימות לרצועות I, מועשרות באקטין ולכן צפויות שלא להיות מזוהות על ידי הנוגדנים. (D) המטוקסילין מסמן בסגול את הגרעינים ההיקפיים הטיפוסיים והשופעים, ואוזין מסמן את הסרקופלסמה של הסיב, ומראה תא שלם ובוגר. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A,B,D); 10 מיקרומטר (C). קיצור: FDB = flexor digitorum brevis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: קינטיקה של Ca2+ transients בסיבים מנותקים אנזימטית המתקבלים מקבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. ערכי p מתאימים למבחן ניתוח השונות. *שונה באופן משמעותי מקבוצות FDB ו- EDL. †שונה באופן משמעותי מקבוצות PDQA, PL ו- EHL. קיצורים: F = פלואורסצנטיות; [Ca2+] = שיא ציטוסולי Ca2+ ריכוז; RT = זמן עלייה; HW = משך במחצית מקסימום; DT = זמן ריקבון; τ1 ו- τ2 = קבועי זמן של ריקבון; A1 ו- A2 = אמפליטודות של ריקבון; FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MT-I = סוג מורפולוגיה I; MT-II = סוג מורפולוגיה II.

טבלה 2: מדידות מורפומטריות של סיבים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלות על ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכבר. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. ערכי p מתאימים למבחן ניתוח השונות. *שונה סטטיסטית מ- PDQA, PL, EDL, EHL ו- soleus. **שונה באופן משמעותי מ- PL, EDL, EHL ו- soleus. †שונה באופן משמעותי מ- EDL, EHL ו- soleus. ††שונה באופן משמעותי מ EHL ו soleus. ‡שונה משמעותית מסולאוס. ¶שונה משמעותית מ- EHL. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

טבלה 3: סוגי סיבים בהקפאה ובתרחיף התא בשרירי FDB מנותקים של עכבר. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. N מתייחס למספר בעלי החיים, בעוד n מתייחס למספר הכולל של סיבים שנותחו בניסויים. שורת FDB מציגה נתונים של כל השריר כפי שנקבע בהקפאה, בעוד ששורת FDB מתאימה לסיבים מבודדים בתרחיף התא לאחר ניתוק השריר. העמודה "סה"כ סוג II" משקפת סיבים טהורים מסוג IIA, IIX ו- IIB. קיצור: FDB = flexor digitorum brevis.

טבלה 4: סוגי סיבים בהקפאה של השרירים המעניקים סיבי עכבר בינוניים וארוכים. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. N מתייחס למספר בעלי החיים, בעוד n מתייחס למספר הכולל של סיבים שנותחו בניסויים. כל השורות מציגות נתונים של השריר כולו כפי שנקבע בהקפאה. עמודות מסוג I, IIA, IIX ו- IIB משקפות סיבים טהורים, ואילו עמודת I/IIA מתייחסת לסיבים היברידיים. העמודה "סה"כ סוג II" היא סיכום של העמודות מסוג IIA, IIX ו- IIB. קיצורים: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

קובץ משלים 1: מחקרי הבעת שרשרת כבדה של מיוזין בשרירים שלמים. הפרוטוקולים מציגים פרטים לקביעת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה על ידי אימונופלואורסנציה בקריוסקציה ועל ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד בהומוגנאטים של כל השרירים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S1: פרטים על המורפולוגיה של הסיבים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של עכבר. (A) סרגל כיול המיקרומטר של המיקרוסקופ הפתוח לקביעת קנה המידה בתוכנת ניתוח התמונה מוצג משמאל. הלוח הימני מראה כיצד הקוטר נמדד שוב ושוב כפי שמצוין על ידי הקווים הכחולים המאונכים לציר הארוך של הסיב (חיצים כחולים), בעוד שהאורך נמדד פעם אחת מקצה לקצה כפי שמודגם על ידי הקו הכחול לאורך הציר הראשי של הסיב. (B) מספר תמונות הורכבו בעריכה קלה כדי להדגים את המראה הארוך והבריא של סיבי PDQA, PL, EDL, EHL ו-SOLEUS (תוספות כחולות, ירוקות, צהובות, כתומות וורודות קטנות). התמונות שהורכבו נערכו עוד יותר כדי לתת לסיבים מראה טוב יותר (תמונות גדולות, שחורות ולבנות). (C) תמונות DIC של סיבי FDB, PDQA, PL ו-soleus המדגישות את אי-הסדירות הרגילה של קצהו ואת הפסיעות הרוחביות הידועות שלהם. ניתן לראות את מראה ה-DIC של סיבי ה-EDL וה-EHL הנותרים ב-Supplemental Video S3 וב-Supplemental Video S4. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB, flexor digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, extensor digitorum longus; EHL, extensor hallucis longus; DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: תרשימי עמודות והתפלגויות אורך וקוטר ממוזגים של הסיבים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של קבוצת ששת שרירי הגפיים האחוריות של העכבר. (A) חלקות עמודות (ממוצע ± סטיות תקן) ו-(B) היסטוגרמות ממוזגות מאשרות את הפער באורכים אך את הדמיון בין הקטרים בין כל הקבוצות. *שונה באופן משמעותי מ- PDQA, PL, EDL, EHL ו- soleus. **שונה באופן משמעותי מ- PL, EDL, EHL ו- soleus. †שונה באופן משמעותי מ- EDL, EHL ו- soleus. ††שונה באופן משמעותי מ EHL ו soleus. ‡שונה משמעותית מסולאוס. ¶שונה משמעותית מ- EHL. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: מחקרי אימונופלואורסנציה עבור הרכב סוג סיבים של קבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. קריוסקציות מייצגות עם תווית נוגדנים המשמשות לניתוחים מדגימות את האיכות הטובה והשלמות של הדגימות. יש דומיננטיות ברורה של סוג סיבים II בכל השרירים, למעט הסולאוס שבו כמות הסיבים מסוג I היא גדולה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: הפרדה אלקטרופורטית של איזופורמים MHC בקבוצה של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכבר. (A) שני ג'לים מלאים מייצגים הפועלים בימים שונים עם דגימות שונות מדגימים את האיכות, הניקיון ויכולת השחזור של מרחק ההפרדה והנדידה של איזופורמים MHC כאשר הם מוכתמים בכחול קומאסי. למרות ששתי התמונות הללו נערכו מעט כדי לשפר את הניגודיות והבהירות עבור הקורא, הניתוחים בוצעו בג'לים לא ערוכים. (B) דוגמאות לניתוח הפסים עבור כל אחד מששת השרירים. לאחר בחירת החזר השקעה בנתיבי הג'ל, נוצר פרופיל עלילה והתאמה גאוסיאנית משמשת להערכת חלקם של איזופורמים MHC בקבוצה של שישה שרירים. הרכב MHC שנמצא היה: FDB: I 9.0 ± 5.0%, IIa + IIx 91.0 ± 5.0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25.9 ± 2.4%, IIb 74.1 ± 2.4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24.9 ± 2.2%, IIb 75.1 ± 2.2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22.0 ± 2.3%, IIb 78.0 ± 2.3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27.5 ± 1.0%, IIb 72.5 ± 1.0% (n = 3); soleus: I 35.8 ± 2.5%, IIa (+IIx + IIb כאשר קיים) 64.2 ± 2.5% (n = 4). מקש הצבע בתחתית מסייע לזהות את השרירים. המלבן האפור מתחת לג'ל הימני ביותר ב- A מתייחס לסמן המשקל המולקולרי המציין את נדידת IIa ל~ 200 KDa. קיצורים: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MHC = שרשרת כבדה מיוזין; ROI = אזור עניין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S1: ה-peroneus longus הפגוע, הגלי והפרונוס (PL, משמאל) אינו מתכווץ בעת גירוי, בעוד שה-PL השלם (מימין) מתכווץ היטב, גם כאשר הוא רחוק יותר מהאלקטרודות. הגדלה פי 0.8. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.7 הרץ ו-50 וולט דרך שתי אלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S2: התכווצות סיבי peroneus longus. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S3: התכווצות extensor digitorum longus סיבים. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S4: התכווצות extensor hallucis longus סיבים. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S5. התכווצות סיבי סוליאוס. הגדלה פי 20. מצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו-50 וולט, דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S6: הקלטה חיה של Ca2+ ארעי מסיב extensor digitorum longus טעון Mag-Fluo-4, AM כמתואר בשלב 4.1.4. פרוטוקול הגירוי משחרר פולסי זרם מלבניים של 1.2 אלפיות השנייה, 0.5 הרץ ו- 50 וולט דרך שתי אלקטרודות פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.