זיהוי בזמן אמת של השפעות חומצה פרולית על החדר השמאלי של חולדה באמצעות צנתר מוליכות בנפח לחץ

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת לחץ ונפח בחדר שמאל באמצעות טכניקת מוליכות לחץ-נפח. שיטה זו מאפשרת ניטור רציף בזמן אמת של השפעות התרופות על הלב.

תקציר

ירידה בתפקוד הלב יכולה להשפיע לרעה על איברים אחרים. הקשר לחץ-נפח בחדר השמאלי נחשב לשיטה תקפה להערכת תפקוד הלב. ניטור בזמן אמת של תפקוד הלב חשוב להערכת תרופות. בתנאי חזה סגור, המתמר המיניאטורי, שהוא מרכיב חשוב בצנתר נפח הלחץ, נכנס לחדר השמאלי של החולדה דרך עורק התרדמה הימני. המכשיר מדמיין את השינויים בתפקוד הלב במהלך הניסוי בצורה של לולאת נפח לחץ. הנפח בפועל של החדר מחושב על ידי שינוי מוליכות הדם על ידי הזרקת 50 μL של תמיסת נתרן כלורי 20% לתוך וריד הצוואר השמאלי של החולדה. הנפח האמיתי של חלל החדר של החולדה מחושב על ידי מדידת מוליכות הדם בנפח ידוע באמצעות צנתר מוליכות לחץ-נפח. פרוטוקול זה מאפשר תצפית רציפה על השפעות התרופות על הלב ויקדם את הרציונל לשימוש בתרופות אתניות מיוחדות במחלות לב וכלי דם.

מבוא

מחלות לב וכלי דם יש את שיעור התמותה הגבוה ביותר בעולם¹. הגורמים לה כוללים היצרות עורקים כליליים (איסכמיה שריר הלב), חסימת עורקים כליליים (אוטם שריר הלב), ופגיעה איסכמיה-רפרפוזיה². מכיוון שהלב נמצא במחזור סיסטולי ודיאסטולי קבוע, זהו אחד החלקים התובעניים ביותר לאנרגיה בגוף. לכן, כאשר העורקים הכליליים מתקשים לשמור על מספיק אנרגיה וחמצן, תפקוד הלב בהכרח פוחת, אשר יש השפעה שלילית על איברים אחרים ^3,4. הלב הוא תחנת כוח במערכת הדם, ויש להעריך את תפקוד הלב באופן רציונלי.

הערכת תפקוד הלב על ידי לחץ חדרי ויחסי נפח נחשבת לשיטה מקיפה⁵. שינויים בזמן אמת בלחץ החדרים ובנפח במהלך מחזור הלב המלא מרכיבים את לולאת נפח הלחץ. לולאת לחץ-נפח חדרית מאפשרת ניתוח כמותי של תפקוד הלב ויכולת מילואים במונחים של פאזות ואנרגיות שונות של החדר. לחדר הרגיל יש נפח סיסטולי קטן עם עבודת פעימות טובה ויעילות ^5,6,7.

טכניקת צנתר הולכה בלחץ-נפח היא שיטה פולשנית לאיתור מצב החדר השמאלי. ניתן להשתמש בו כדי להשיג לולאת נפח לחץ רציפה^{בזמן אמת 8}. צנתרי מוליכות נפחית בלחץ הם כלים רבי עוצמה, ונהלי טיפול בקול חיוניים לתוצאות ניתנות לשחזור ואמינות, כולל ניתוח in vivo של מוליכות מקבילית שריר הלב במהלך כיול מי מלח ומדידת מוליכות דם במבחנה בכיול קובטה³.

חומצה פרולית (FA), חומצה פנולית, נפוצה באופן נרחב בממלכות צמחים כגון Avena sativa ו- Ligusticum chuanxiong hort ^9,10. חומצה פרולית יש השפעות פרמקולוגיות של הורדת לחץ דם והפרעות קצב. FA הוא מוצר טבעי ביו-אקטיבי עם פונקציות מרובות. FA יכול להתנגד לנזק חמצוני, להפחית תגובות דלקתיות, לעכב צבירת טסיות דם ולמנוע מחלות לב כליליות וטרשת עורקים¹¹. עם זאת, רוב המחקרים על חומצה פרולית התמקדו בהיבט אחד של הלב ורק לעתים רחוקות ההשפעות של חומצה פרולית הוערכו במערכת הדם 12,13,14,15. כאן אנו מתארים גישה של הרדמה בחזה סגור להרדמה איזופלורנית בשילוב קטמין (50 מ"ג/ק"ג) עם דגש על התגובה הלבבית לתמיסת חומצה פרולית במהלך הזרקת ורידים ג'וגולריים.

נתאר את ההליך המלא לשימוש בכלי בתנאי חזה סגור, כולל הכנת תמיסה, הכנת המתמר, הכנת חולדות טרום ניסוי, החדרת קטטר לעורק התרדמה הימני וניתוח נתונים. משך הניסוי הוא בדרך כלל פחות מ -4 שעות והוא נקבע על ידי פרוטוקולי הניסוי השונים. בניסוי אחד אנו יכולים לקבל מידע לבבי מפורט כגון לחץ בחדר שמאל, נפח וקצב לב.

פרוטוקול

פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה הניסיונית לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (רשומה מס' 2023-04). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות זכרים מסוג Sprague Dawley (SD) (280 ±-20 גרם, בני 8-10 שבועות). החולדות הוחזקו בתא בעלי חיים והיו חופשיות לשתות ולאכול.

1. הכנת פתרון

1. הכינו תמיסת NaCl 0.9% לשימוש כדי לשמור על אזור העבודה לח כראוי.
2. להכנת תמיסת NaCl היפרטונית 20%, יש להמיס 2 גרם NaCl ב-10 מ"ל מים מזוקקים כפול (ddH₂O). על מנת לקבוע את המוליכות המקבילה של שריר הלב, יש צורך לשנות את המוליכות של הנוזל תוך חדרי.
3. הכינו תמיסת אבקת ניקוי 1% פעילה באנזים. השתמש בו בסיום הניסוי, כדי לטבול את הצנתר החשמלי בנפח הלחץ בתמיסה למשך 1-2 שעות.
4. הכן תמיסת FA על ידי המסת 10 מ"ג של חומצה פרולית ב 20 מ"ל של ddH₂O. סנן את התמיסה דרך קרום 0.22 מיקרומטר. הזריקו לחולדה 1 מ"ל/ק"ג תמיסת חומצה פרולית.

2. הכנת החיישן

1. טבלו את חיישן נפח הלחץ בתמיסת NaCl של 0.9% ב-37°C למשך כ-30-60 דקות לפני תחילת הניסוי, מה שמאפשר את יציבות נתוני הניסוי.
2. חבר את מנגנון הניסוי. המערכת למדידת לולאות לחץ-נפח מורכבת מצנתר לחץ-נפח, שתי יחידות בקרה, יחידת הקלטה ותוכנת הפעלת מחשב. מודול לולאת נפח הלחץ בתוכנה יספק הליך ניסיוני ייחוס.
3. לחץ על לחצן התחל והתוכנה תתעד באופן אוטומטי את נתוני הניטור מחיישן עוצמת הלחץ.
4. השתמש בתוכנת Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) כדי לכייל את הלחץ והמוליכות.

3. הכנת חולדות טרום ניסויית

1. מתן קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ופנטניל (0.25 מ"ג/ק"ג) לחולדות באמצעות הזרקה תוך שרירית⁵.
2. צבטו את אצבעות הרגליים של החולדות כדי לוודא עומק הרדמה על ידי היעדר רפלקסים. הרגש משפיע על המצב הפיזיולוגי של חולדות וכאב גורם לשינויים בתפקוד הלב¹⁶. השתמש במכונות גילוח קטנות של בעלי חיים וקרמים מסירי שיער כדי להסיר שיער באתרי ניתוח. השתמש יודופור ו 75% אלכוהול כדי לנגב את העור כדי לשמור על סטריליות.
3. יש לשתק חולדות בהרדמה מלאה על פלטת חימום איזותרמית כשהגב בא במגע עם פלטת החימום.
4. הכנס בדיקת טמפרטורה מצופה ג'ל פטרולאום לתוך פי הטבעת של החולדה. שמרו על טמפרטורת גוף החולדה ב-37°C ±-0.5 על ידי התאמת פלטת החימום.
   הערה: יש צורך לשמור על נתיב האוויר ללא הפרעה במהלך הניסוי.

4. החדרת קטטר לעורק התרדמה הימני

1. חותכים את העור בצד ימין של הקו החציוני של הצוואר של חולדות, לאורך. ביצוע חתך של 4 ס"מ והפרדת שריר ורקמת חיבור על ידי מלקחיים. עורק התרדמה הממוקם בצד ימין של קנה הנשימה גלוי. עורק התרדמה הימני של החולדה הוא אדום כהה, פועם בחוזקה, ויש לו עצב הואגוס לבן מקביל אליו.
2. להפריד את עורק התרדמה מרקמות ועצבים אחרים באמצעות מלקחיים. מניחים שלושה קווי ניתוח 5-0 מתחת לעורק התרדמה הנקי. טפטוף תמיסת נתרן כלורי סטרילית 0.9% על אזור הניתוח כדי לשמור על לחות עורק התרדמה.
3. חותכים את העור מעל עצם הבריח השמאלית ומקלפים את הרקמה סביב הווריד הצווארי. לאחר מכן, מניחים חוט כירורגי 5-0 מתחת לווריד הצוואר השמאלי.
4. השתמש אטבים עורקיים כדי להשעות את זרימת הדם קרוב, באמצעות מספריים מיקרו לחתוך קטע בכלי שבו זרימת הדם נעצרה. זה נורמלי עבור כמות קטנה של דם להופיע בחתך הפצע. אם הדם יוצא מכלי הדם במהירות ולסירוגין, הרימו את הקו הכירורגי הפרוקסימלי והפעילו שוב את מהדק העורקים.
5. הכנס את הצנתר מהחתך לאורך עורק התרדמה עמוק לתוך החדר השמאלי. ודא שערך הלחץ הסיסטולי הנמוך ביותר לאחר הכניסה לחדר השמאלי קרוב ל -0 מ"מ כספית.
6. כדי להשיג יחס לחץ-נפח סביר, כוונן מעט את צנתר נפח הלחץ בחדר החדר. כדי למנוע איבוד דם מסיבי והצנתר מלשנות את מיקומו עקב פעימות הלב, יש לקשור את הקצה הפרוקסימלי של קו הניתוח.
   הערה: טמפרטורת הגוף, רמת ההרדמה, אות הלחץ ואות ההולכה של החולדה צריכים להישאר יציבים במהלך תהליך זה. דרכי הנשימה של החולדה צריכות להישמר פתוחות.

5. הזרקת תרופות וכיול מוליכות

1. לשמור על מיקום צנתר נפח הלחץ בחדר החדר, לאחר ייצוב הנתונים, לקשור את הקו הניתוחי הדיסטלי לווריד הצוואר ולהזריק באיטיות עד 1 מ"ל / ק"ג של תמיסת חומצה פרולית. התבוננו במשך 5-10 דקות.
2. הזריקו 50 μL של 20% תמיסת NaCl מווריד הצוואר השמאלי כדי להסיר את המוליכות המקבילה שנוצרה על ידי שריר הלב. טווח הנפח של המוליכות המקבילית היה בערך 130-280 μL⁵. חזור על פעולה זו 3 פעמים במרווח של 2 דקות.
3. לאחר בדיקת לחץ חדרי ונפח בחולדות, יש לקחת דם מאבי העורקים הבטני של החולדה באמצעות מחט איסוף דם. מניחים את הדם שנאסף בצינורית איסוף נתרן הפרין והופכים למעלה ולמטה פי 2 כדי למנוע קרישת דם. הרדימו את חולדות הניסוי על ידי הזרקת 120 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטלי דרך וריד הצוואר השמאלי.
4. בצע המרה של מוליכות מדודה לנפח הדם בפועל באמצעות צינורות כיול נפח חולדה. הכניסו דם מעורבב עם נתרן הפרין, ברצף, לתוך פתחי צינור הכיול, והצנתר מזהה את ערכי ההולכה של הדם בפתחים השונים ורושם אותם במודול ניטור נפח הלחץ.

6. ניתוח נתונים

1. על ידי הוספת ערך המוליכות הנמדד של נפח ידוע של דם למיקום שצוין, התוכנה משרטטת באופן אוטומטי את העקומה ומבצעת אקסטרפולציה של מוליכות הדם. השתמש לפחות שלוש קבוצות של ערכי מוליכות דם כדי להסיק את מוליכות הדם של החולדה הנבדקת. מוליכות הדם היא אינדיבידואלית. עבור כל חולדה תחת הבדיקה, לבצע הליך זה בנפרד.
2. כיול היפרטוני: על ידי הוספת הנתונים המתקבלים משלוש זריקות של מי מלח היפרטוניים למיקום מוגדר, התוכנה מחשבת ממוצעי מוליכות מקבילים ומכיילת באופן אוטומטי את נתוני הניסוי.
3. השתמשו באזורים עם ערכי לחץ דם והולכה יציבים כדי לנתח את תפקוד החדר השמאלי של חולדות.
4. לחץ על נתח והתוכנה תחשב באופן אוטומטי מגוון פרמטרים בהתבסס על האזור שנבחר, כולל EF (שברי פליטה של החדר השמאלי), SW (עבודת שבץ), CO (פלט לב) וכו '.

תוצאות

כל בדיקה (n = 3) התבססה על כניסת צנתר מוליכות לחץ-נפח לחדר השמאלי. ישנם שינויים משמעותיים בסיגנל, כמו למשל עלייה ניכרת בטווח הלחץ, כאשר הצנתר נכנס לחדר השמאלי מעורק התרדמה (איור 1). ניתוח גרפי של יחסי לחץ-נפח הושלם על ידי שרטוט הנפח (μL) על ציר Y והלחץ (mmHg) על ציר X. לחץ החדר השמאלי של חולדה היה בטווח של 10-105 מ"מ כספית, וערכי ההולכה של הנפח היו בטווח של 65-115 מיקרוליטר.

מחזור הלב המלא נוצר על-ידי לולאת נפח הלחץ נגד כיוון השעון (איור 2). שינויים משמעותיים בתפקוד הלב נצפו בחולדות לאחר מתן חומצה פרולית להן (איור 3). לחץ החדר השמאלי של חולדה היה בטווח של 0-85 מ"מ כספית וערכי ההולכה של הנפח היו בטווח של 30-100 מיקרוליטר.

כפי שניתן לראות באיור 4, שינויים מתרחשים בלולאת לחץ-נפח בחדר השמאלי כאשר מלח היפרטוני הוזרק לווריד הצווארי של חולדות. בשל מדידה ישירה של אותות לחץ ומוליכות בתוך חלל החדר, הזרקת מי מלח היפרטוניים דרך וריד הצוואר השמאלי עלולה לגרום לעלייה בערכי המוליכות. ניתן לבטל הפרעות משריר הלב על ידי ביצוע מדידות מרובות של השינויים בערכי המוליכות.

מוליכות נפחית בלחץ שימשה לכיול קובטות (איור 5). זאת כדי להמיר את ערכי המוליכות הנמדדים לנפחיים.

איור 1: לולאות שונות של נפח לחץ בעורק התרדמה ובחדר שנוצרו על-ידי צנתרי מוליכות לחץ-נפח. (A) קיימים הבדלים משמעותיים בלחץ ובמוליכות בין עורקים לחדרים. (B) החדרת חיישן זעיר לחדר יכולה ליצור לולאת לחץ-נפח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: לולאת לחץ-נפח. לולאת נפח הלחץ כוללת ארבעה שלבים: דיאסטולה, התכווצות איזונפומטרית, סיסטולה, והרפייה איזונפומטרית. האזור של לולאת לחץ-נפח מייצג את העבודה הנוצרת על ידי התכווצות לב אחת. חיסור הנפח הסיסטולי הסופי (ESV) מהנפח הדיאסטולי הסופי (EDV) מניב את פלט החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תפקוד החדר השמאלי מושפע בחולדות לאחר הזרקת תמיסת חומצה פרולית. (A) לולאת לחץ-נפח של החדר השמאלי מושפעת. (B) מקטע פליטה (EF) מייצג את אחוז נפח השבץ ביחס לנפח הדיאסטולי הסופי של החדר: שינוי במקטע פליטת החדר השמאלי עם ספירת פעימות הלב. (C) נפח החדר השמאלי בקצה הסיסטולי משתנה עם מספר הולך וגדל של פעימות לב. (D) חדר שמאל סוף דיאסטולי לחץ דיאסטולי יחס זמן, זמן שינויים קבועים עם עלייה בקצב הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שינויי לחץ והולכה בחדר השמאלי של חולדות לאחר שתמיסת NaCl של 20% הוזרקה לווריד. (A) נתונים מנותחים שבהם המוליכות השתנתה. (B) טבעת נפח הלחץ זזה ימינה עקב מוליכות מוגברת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: צנתרי מוליכות בנפח לחץ משמשים למדידת ההולכה של נפח ידוע של קובטה מלאה בדם חולדה. (A) מוליכות של נפחים שונים. (B) מתאם טוב של מוליכות הנמדד על ידי צנתרי מוליכות לחץ-נפח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

חיוני לאמץ אסטרטגיית מינון רציונלית למצבים שונים של תפקוד הלב. טכניקת צנתר מוליכות לחץ-נפח היא הדרך האינטואיטיבית ביותר לחקור את תפקוד החדר השמאלי⁵. שיטה זו מאפשרת לחקור את ההשפעות של תרופות על תפקוד הלב מנקודת מבט שלמה. אנו מתארים בפירוט את השלבים השונים של הניסוי. זה יספק מתקן כלשהו לחקר תפקוד הלב.

טכניקת צנתר מוליכות נפח לחץ היא השיטה המקיפה והקפדנית ביותר. ניתן לקבל מידע על עד 30 אינדיקטורים בניסוי אחד, כולל ערכים מוחלטים (לחץ ונפח) וערכים יחסיים (EF), ואפילו מידע מסוים על מטבוליזם של תרופות.

טמפרטורת הגוף של חולדות נשמרה על 37 מעלות צלזיוס ± 0.5 במהלך הליך ניסיוני מלא⁵. יש למזער את איבוד הדם מחולדות במהלך הניסוי⁵. יש לציין את נפח הדם של החולדה במהלך הניסוי¹⁷.

טכנולוגיית צנתר הולכה בנפח לחץ מאפשרת זיהוי בזמן אמת של מצב החדרים¹⁸. טכנולוגיה זו יכולה להיות מועילה מאוד בחקר ההשפעה של תרופה בודדת או שילוב של תרופות על הלב. צנתר ההולכה ימדוד ישירות את הלחץ וההולכה של החדר השמאלי. זה קשור קשר הדוק לטמפרטורת הגוף ולמידת ההרדמה של החולדה הנבדקת. בניסוי זה, לאחר הזרקת תמיסת חומצה פרולית, השינויים בתפקוד החדר השמאלי הודגמו בבירור על-ידי לולאת נפח הלחץ, כולל ירידה בלחץ הסיסטולי הסופי ובנפח הסיסטולי הסופי (איור 2A). מקטע פליטת החדר השמאלי של החולדות גדל באופן משמעותי, עם ערך שיא של 89.87% (איור 2B). הלחץ הסיסטולי הסופי של החדר השמאלי בחולדות הופחת באופן משמעותי, עם ערך מינימלי של 55.44 μL. זה עולה בקנה אחד עם ההשפעה הפרמקולוגית של חומצה פרולית בהפחתת לחץ הדם כפי שדווח בעבר¹¹.

תרכובות טבעיות מסוימות המצויות במזון ובצמחי מרפא יכולות לתרום לשמירה על הבריאות. חומצה פרולית היא תרכובת פנולית הנפוצה בצמחים, כולל Ligusticum chuanxiong ו- Angelica sinensis¹⁹, שהם מרכיבים פעילים חשובים בתרופות סיניות מסורתיות שונות. מחקרים עדכניים דיווחו כי לחומצה פרולית יש פעילויות ביולוגיות רבות, כולל השפעות אנטי דלקתיות, אנטי-פיברוטיות ונוגדות אפופטוטיקה¹¹. יש צורך ללמוד את ההשפעה של מוצר טבעי זמין זה מן המזון על תפקוד הלב במערכת הדם, אם כי מחקרים הצביעו על ההשפעות החיוביות שלה על המבנה המורפולוגי הלב^12,20.

ניתן למקם את צנתר נפח הלחץ בחדר החדר של חיית הניסוי כדי לקבל לחץ ומוליכות חדרית ישירות. כיול מי מלח וכיול קובטה משמשים להשגת נפחי חדרים אמיתיים. ניסוי זה מאפשר לקבל לולאת נפח לחץ רציפה, אשר תשקף חזותית שינויים בתפקוד החדר. ישנן שתי שיטות לגישה לחדר החדר עם צנתר נפח הלחץ, כולל מצב החזה הפתוח ומצב החזה הסגור. במצב חזה פתוח קל יותר לשלוט על המיקום של צנתר נפח הלחץ בחלל החדר. מדידת תפקוד החדר בתנאי חזה סגור אינה דורשת סיוע בנשימה של החיה, מזיקה פחות לבעל החיים ובעלת אחוזי הצלחה גבוהים יותר. בנוסף, לולאת נפח הלחץ נצפתה בתנאי חזה סגור כדי לקבוע אם צנתר נפח הלחץ נמצא בחלל החדר. אם קטטר זה נדחס על ידי שריר הלב, לולאת נפח הלחץ תראה שיא חריג.

הלב הוא איבר חיוני המזרים דם בכל הגוף. יש צורך בגישה רציונלית יותר להערכת תפקוד הלב, כולל עומסים לפני ואחרי וכן מצב הלב עצמו²¹ . לולאות לחץ-נפח משמשות לתיאור השינויים בלחץ ובנפח של חדר החדר המרכזי לאורך מחזור הלב המלא בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטה שלמה למדידת תפקוד החדר השמאלי באמצעות חיישנים זעירים. שינוי מודל המיקרו-חיישנים בפרוטוקול הניסוי מאפשר מדידה של תפקוד הלב בבעלי חיים שונים, כגון חזירים, עכברים וכו' ^4,8,22. השימוש בצנתרי מוליכות לחץ-נפח מאפשר תצפית בזמן אמת על השפעות התרופות על לחץ ונפח החדר השמאלי, כמו גם על ההשפעה הכוללת על מערכת הדם של נבדק הניסוי. טכניקה זו מסייעת למזער את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של תרופות על הלב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 1 מ"ל	Sartorius AG,	גרמניה-שומר
טמפרטורה לבעלי חיים	Rayward Life Technology Co., Ltd	69020
Dual Bio Amp	Millar, Inc., ארה"ב	DA-100
אבקת ניקוי פעילה אנזימים	Alconox Inc., ארה"ב	1104
חומצה פרולית	Macklin Biochemical Co., Ltd, שנחאי, סין	F900027
מתמרי צנתר Mikro-Tip, SPR-838NR	Millar, Inc., ארה"ב	SPR-838NR
נפח לחץ Miro-Tip Millar (MPVS) Ultra	Millar, Inc., ארה"ב	SPR-869
קוצץ חשמלי לחיות מחמד	Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd.	-
Power Lab 8 / 35	Millar, Inc., ארה"ב	PL3508
נתרן כלורי, NaCl	Kelong Chemical Reagent, צ'נגדו, סין	KX829463
קרם הסרת שיער Veet	שנחאי Songqi מסחר אלקטרוני ושות', בע"מ

3226470