Method Article

עיבוד רקמות ובידוד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי

DOI:

10.3791/65864

⸱

November 22nd, 2024

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים טכניקה אמינה ויעילה לבידוד פיברובלסטים ראשוניים מרקמת הנרתיק האנושית לפני גיל המעבר או לאחר גיל המעבר. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד פיברובלסטים בנרתיק אינם לוקחים בחשבון את האתגרים של בידוד תאים מרקמה מזדקנת. רקמת הנרתיק התקבלה מנשים לאחר ניתוח צניחת איברי האגן.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צניחת איברי האגן היא הפרעה המשפיעה קשות על איכות החיים של נשים. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק. ניתוח לתיקון צניחת איברי האגן היה טיפול עיקרי. לאחרונה גובר העניין בחקר הרכב הרקמה של חולים עם צניחה ברמה התאית.

כיום אין הסכמה לגבי ההשפעה של גיל התורם או המטופל על טיפולים מבוססי תאים. הפרוטוקולים הנוכחיים שפורסמו לבידוד פיברובלסטים בנרתיק מתרכזים ברקמה לפני גיל המעבר או מזניחים את ההערה על גיל הרקמה התורמת. רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים במודלים של בעלי חיים. העקביות של רקמת הנרתיק האנושית צפופה יותר מהרקמות המשמשות ברוב הפרוטוקולים. במחקר זה, רקמת נרתיק אנושית הושגה בעיקר מתורמים מבוגרים, מה שככל הנראה תרם לכישלון הפרוטוקולים הקיימים.

מטרת מחקר זה היא לתאר פרוטוקול סטנדרטי לרכישה אמינה של פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים, ללא קשר לגיל התורם ולמצב גיל המעבר. התוצאות שוחזרו באמצעות רקמות מתשעה תורמים נפרדים שעברו ניתוח לצניחת איברי האגן. שש מטופלות היו לאחר גיל המעבר, כאשר התורמת המבוגרת ביותר הייתה בת 78. הגיל החציוני של תורמי הרקמה היה 59.

במאמר זה אנו מתארים שיטה אמינה ליצירת תרחיף חד-תאי מועשר בפיברובלסטים באמצעות שילוב של דיסוציאציה אנזימטית ומכנית ואיגום תרחיף תאי של ביופסיות נרתיקיות מרובות מתורם יחיד. בידוד אמין של פיברובלסטים ראשוניים בנרתיק האנושי עשוי להיות שימושי בחקר צניחת איברי האגן, כמו גם אינטראקציות מיקרוביום-מארח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פער מגדרי במדע ובמחקר הוא נושא מתמשך. מחקר על הפרעות המשפיעות בעיקר על אנשים ממין נשי אינו ממומן1. צניחת איברי האגן היא הפרעה הקשורה מאוד למין הנשי. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק2. מעט ידוע על אינטראקציות תאיות בהקשר של פתופיזיולוגיה זו, וגם לא כיצד גורמים ברמת הרקמה משפיעים על הצלחת התערבויות כירורגיות3.

תאים ראשוניים ולא קווי תאים מוכרים באופן נרחב כחיוניים למחקר קליני תרגומי במתן רלוונטיות פיזיולוגית רבה יותר4. תאים ראשוניים נלקחים ישירות מרקמת הגוף המעניינת ועשויים לחקות בצורה מדויקת יותר את הפיזיולוגיה in vivo . בידוד של פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי עשוי להיות שימושי לחקר מנגנונים ביולוגיים של צניחת איברי אגן ומידול מחלות, בהתחשב במאפיינים מרכזיים של תורמים, כגון גיל ומצב גיל המעבר.

צניחת איברי האגן משפיעה בדרך כלל על אנשים מבוגרים או לאחר גיל המעבר. הבידוד וההתרבות של תאי פיברובלסט ראשוניים בחקר מצב זה מאתגרים בשל אוכלוסיות תאים מופחתות ויכולת קלונוגנית מתורמים מבוגרים5. מניסיוננו, השימוש בפרוטוקולים שתוארו קודם לכן לדיסוציאציה של רקמת הנרתיק לא הצליח לחלץ פיברובלסטים כלשהם מביופסיה סטנדרטית של רקמהבגודל 1 ס"מ 2.

באמצעות סקירת ספרות, מצאנו כי מחקרים דומים חולקו לשתי קבוצות: מודלים של בעלי חיים, כגון מורין6, ומודלים אנושיים 7,8. כאשר עוקבים אחר פרוטוקול העכבר, השימוש במספריים לעיבוד רקמות של רקמת נרתיק אנושית הניב עיכול מכני לקוי. אקסטרפולציה של פרוטוקולים באמצעות רקמת מורין ואתרי רקמה אחרים9 לא הצליחה.

רוב המאמרים שהשתמשו בדגימות נרתיק אנושיות השתמשו ברקמה מאנשים לפני גיל המעבר עם צניחת איברי אגן 7,10. למרות שכמה מאמרים דיווחו על שימוש בדגימות הן מאנשים לפני גיל המעבר והן לאחר גיל המעבר11, הם לא תיארו בפירוט מספיק את הפרוטוקול המשמש לבידוד מוצלח של פיברובלסטים מתורמים מבוגרים או לאחר גיל המעבר. בידוד ומידול מחלות באמצעות פיברובלסטים מרקמה לאחר גיל המעבר עשויים להיות חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה התאית של צניחת איברי האגן, שכן מצב זה הוא בעל השכיחות הגבוהה ביותר אצל אנשים בעשור שלאחר גיל המעבר12.

אנו מתארים שיטה לבידוד ותרבית של תרחיף חד-תאי מועשר בפיברובלסטים מרקמת נרתיק אנושית באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית ואנזימטית. מאמר זה מתאר פרוטוקול אמין כיצד לרכוש פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים לאחר גיל המעבר או הזדקנות. תאים מבודדים אושרו כפיברובלסטים באמצעות בדיקה מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ואימונופלואורסנציה (IF) כדי להעריך את הביטוי של וימנטין, F-אקטין ואקטין שריר α חלק (α-SMA).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת הנרתיק התקבלה מנשים שעברו ניתוח צניחת איברי האגן. רקמת הנרתיק שנאספה לאחר הניתוח נחשבה לחומר פסולת ואחרת הייתה מושלכת לפח. המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של מסצ'וסטס גנרל בריגהם.

1. קצירת רקמת הנרתיק מהמטופלת

  1. אבחון צניחת איברי האגן על ידי לקיחת היסטוריה ושימוש בממצאי בדיקת האגן: במרפאה התקבלו מדידות לכימות צניחת איברי האגן (POP-Q), שהראו עדות לצניחת איברי האגן.
  2. השתמש בקריטריוני ההכללה הבאים: מעל גיל 18; היסטוריה של צניחת איברי אגן סימפטומטית; בחירה לתיקון כירורגי של צניחת איברי האגן.
  3. לא לכלול את הדברים הבאים: נשים בהריון וחולים המסרבים לתרום רקמות.
  4. חתוך את רקמת הנרתיק העודפת כשלב הכרחי בניתוח צניחת איברי האגן. אפיתל נרתיקי זה נכרת בעובי כולל לאחר הניתוחים הבאים: קולפורפיה קדמית, קולפורפיה אחורית וקולפוקליזיס.
  5. הובלת רקמות למעבדה בכוס איסוף דגימות סטרילית עם מדיית DMEM/F12 (Gibco) רגילה נטולת מלח או סרום. שמור על קרח.

2. עיבוד רקמות ועיכול

  1. הכנת רקמות
    1. למדוד ולחתוך את הרקמה כדי להקיף את העובי המלא של אפיתל הנרתיק, יצירת מקטעים של כ 1 ס"מ2.
    2. יש להקפיד על מדידה מדויקת של גודל הביופסיה 1 ס"מ2.
      הערה: הערכת יתר של גודל ביופסיית הרקמה עלולה לפגוע בעיכול הרקמות.
    3. הכינו 2-3 ביופסיות נרתיקיות נוספות בגודל 1 ס"מכל אחת מתורם יחיד והניחו את הביופסיות בצד.
  2. עיכול מכני
    1. מניחים את הביופסיה הנרתיקית בצלחת פטרי תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. פיפטה 500-1,000 μL של מדיה ללא סרום בתוספת 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין בונטו רקמת הנרתיק כדי למנוע מהרקמה להתייבש.
    2. טוחנים את רקמת הנרתיק לשברים קטנים באמצעות שני אזמלים סטריליים (מס' 11 או מס' 15) בשתי הידיים.
    3. ודא שקצות הלהבים מאונכים לפני השטח של הרקמה. יש להפעיל לחץ שווה ויציב על פני הרקמה, באמצעות שני אזמלים. בצע פעולת משיכה לסירוגין כדי לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד.
    4. חזור על טכניקת טחינה זו בטכניקת שני אזמלים עד שהדגימה תהיה בעלת עקביות אחידה עם חתיכות 1-2 מ"מ.
      הערה: עיכול מכני באמצעות טכניקה זו של שני אזמלים של ביופסיה 1 ס"מ2 צריך לקחת בערך 15-20 דקות כדי להשלים.
    5. הוסף 2-3 מ"ל של מדיה DMEM/F12 ללא סרום בתוספת 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B לצלחת, משהה את הרקמה הטחונה. פיפטה התמיסה המכילה שברי רקמות למעלה ולמטה כדי לשבור את כל הגושים.
  3. עיכול אנזימטי
    1. להעביר את הפתרון המכיל שברי רקמות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף מדיה DMEM/F12 ללא סרום לצלחת תרבית הרקמה שבה רקמת הנרתיק נטחנה כדי לאסוף את שברי הרקמה שנותרו. מעבירים את התמיסה המכילה שברי רקמות לצינור החרוט. הוסף מדיה נוספת ללא סרום DMEM/F12 עד שהנפח הכולל הוא 10 מ"ל.
    2. יש להמיס 5 מ"ג ליבראז ב-1 מ"ל מים סטריליים (5 מ"ג/מ"ל). יש לאחסן ב-230 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש או -80°C למשך 6 חודשים.
    3. הוסף 230 μL של Liberase (מלאי 13 U / mL) לצינור, עם ריכוז סופי 0.3 U/mL.
      הערה: פעילות Liberase עשויה להשתנות בין אצוות. יש להפשיר כל אליקוט מיד לפני השימוש באמצעות אמבט מים. הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
    4. חזור על שלבים 2.1-2.3 עבור 2-3 ביופסיות נרתיקיות נוספות של אותו תורם.
      הערה: יש לשמור כל תמיסה המכילה שברי רקמה מביופסיה בודדת בצינורות חרוטיים נפרדים. לדוגמה, 4 ביופסיות נרתיקיות ב 4 צינורות. זה חשוב עבור כדורי תאים אופטימליים לאחר צנטריפוגה.
    5. לדגור על הצינורות במשך 3 שעות ב 37 ° C עם תסיסה מתמדת ונמרצת באמצעות מיקסר לדוגמה.
    6. מניחים מערבל לדוגמה באינקובטור CO2 . שמור על תסיסה מתמדת. (הגדרות מיקסר לדוגמה: 25 סל"ד של תנועה סיבובית עבור 5 שניות, 30° של תנועה הדדית (סיבוב הטיה) עבור 5 שניות, ו 2° של תנועת רטט (מערבולת) עבור 3 שניות).
    7. במהלך הדגירה, מערבלים את הצינורות במרווחים של 30 דקות.
    8. צנטריפוגה את הדגימות ב 3,000 x גרם במשך 5 דקות. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
    9. יש להשהות מחדש את הגלולה במדיית DMEM/F12 של 1-2 מ"ל עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B כדי לדלל את אנזים ליבראז. פיפטה נמרצת עד הגלולה הוא resuspended לחלוטין.

3. תרבית תאים

  1. הסרת שברי רקמות לא מעוכלות
    1. מניחים מסננת תאים של 100 מיקרומטר מעל מיכל חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
    2. איגום את תרחיף התא מביופסיות הרקמה המרובות של אותו תורם יחד.
    3. מסננים את מתלה הרקמה/אנזים, לוחצים באמצעות בוכנה מזרק בנפח 5 מ"ל. חזור על שלב זה עד שנראה כי שברי הרקמה הנותרים נלחצים במלואם.
      הערה: ייתכן שיש ריר מסוים משברי רקמת הנרתיק שאינו עובד במלואו דרך המסננת. השליכו את הריר עם מסננת התא.
  2. איגום תרביות תאים
    1. תרחיף תאים מאוגד פלטות מביופסיות נרתיקיות מרובות (מאותו תורם) על צלחת פטרי (60 מ"מ x 15 מ"מ).
    2. לדגור על צלחת פטרי באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
    3. התבונן ואשר את נוכחותם של תאים שאינם דבקים במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
    4. ודא שהמיקוד של המיקרוסקופ נמצא בתחתית הצלחת.
      הערה: ייתכן שיש תאי חיסון רבים בחזית. מספר קטן יותר של פיברובלסטים יחוברו לתחתית הצלחת.
    5. יש להמתין 18-24 שעות לפני שינוי מדיית תרבית התאים כדי להבטיח היצמדות נאותה של התאים.
    6. שנה את מדיום התרבות כל שלושה ימים עד 80% מפגש מתרחש. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-90%, יש להתרחב לבקבוק גדול יותר או להקפיא אליציטוטים של תאים לשימוש עתידי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת הנרתיק נאספה מ-10 תורמים עצמאיים שעברו ניתוח צניחת אברי אגן. באמצעות הפרוטוקול המתואר, התאים בודדו מרקמת הנרתיק האנושית. אוכלוסיות התאים היו בעלות מראה מוארך, שטוח ובצורת ציר אופייני. בדומה למחקרים אחרים, נצפתה יכולת הכפלה איטית משמעותית של תאים ויכולת קלונוגנית מופחתת של פיברובלסטים עם העלייה בגיל התורם. הבדלים אלה ניכרו כאשר השוו פיברובלסטים שבודדו מאנשים מבוגרים (בני 75-78) לאלה שבודדו מאנשים צעירים (בני 35-47). תאים מתורמים בגיל העמידה הציגו פרופיל ביניים (56-61 שנים). שיעורי התרבות התאים הוערכו בתחילה על ידי הדמיה ישירה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם אותה צפיפות זריעה ידועה.

figure-results-1
איור 1: ייצוג דיאגרמטי של הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 1 מראה ייצוג דיאגרמטי של פרוטוקול הדיסוציאציה והבידוד. בעקבות צעדים אלה, פרוטוקול זה הניב שיעור הצלחה של 90% של בידוד פיברובלסטים ראשוני בתשעה מתוך עשרה תורמים במספר תאים מספיק כדי לאפשר תאים תת-תרבותיים. הגיל החציוני של התורמים היה 59.

פרוטוקול (מחבר, שנה)רקמת תורם של פרוטוקול מקורימספר תורמיםגיל התורם בשניםפיברובלסטים שהתקבלומורפולוגיה
רואיז-זפטה ואח', 2013נרתיק אנושי356-78לאלא ישים
חאן ואחרים, 2016אוזן עכבר וזנב248-65לאלא ישים
Waise et al., 2019רקמה אנושית356-75לאלא ישים
Nadalutti et al., 2020עורלה אנושית165לאלא ישים
הנוכחינרתיק אנושי1035-79כןבצורת ציר

טבלה 1: השוואה בין פרוטוקולים לבידוד מוצלח של פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים. השוואה בין פרוטוקולים קיימים שונים לשלנו ועדות לכך היא תוצאות מורפולוגיות.

טבלה 1 מציגה את התוצאות של שימוש בפרוטוקולים אחרים כדי לנסות בידוד פיברובלסטים בנרתיק במחקר זה. פיתחנו פרוטוקול סטנדרטי לבידוד פיברובלסטים ראשוניים מרירית הנרתיק ומתורמים מבוגרים5.

במחקר שלנו בדקנו כמה פרוטוקולים מבוססים, כולל אלה המפורטים בטבלה 1, ולא ראינו הצלחה בבידוד תאים באמצעות פרוטוקולים אלה במחקר שלנו. אנו מציעים את הסיבות הבאות למגבלותיהם.

הפרוטוקול שפורסם על ידי Ruiz et al.3 כולל גירוד הפאשיה וחיתוך הרקמה לחתיכות קטנות. מניסיוננו, קשה להבחין בפאשיה, וניסיונות גירוד עשויים לגרום לירידה משמעותית בתפוקת התאים. בעוד שיטה זו היא פשוטה, היא חסרה פרטים קריטיים, אשר מגביל את הכללתה. בנוסף, העיכול המכני בפרוטוקול זה נראה לא מספיק עבור רקמה לאחר גיל המעבר, אשר נוטה להיות צפוף יותר.

פרוטוקולים שפורסמו על ידי Khan et al.9 ו- Waise et al.13 משתמשים במספריים לטחינת רקמות, שאינם מציגים כוחות גזירה רב-כיווניים משמעותיים בהשוואה לטכניקת האזמל. מניסיוננו, גם שיטת המספריים לא עבדה ביעילות.

לבסוף, פרוטוקול Nadalutti et al.14 , שהשתמש בשיטת explant, לא הניב בהצלחה פיברובלסטים בידינו. שיטה זו עשויה להיות פחות יעילה בשל טבעה של רקמה לאחר גיל המעבר, אשר עשוי לדרוש עיבוד מכני ואנזימטי אגרסיבי יותר כדי לנתק פיברובלסטים בהצלחה.

figure-results-2
איור 2: תמונת ניגודיות פאזה של תאים תלויים ביום 0. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 מראה תאים מרחפים ביום 0 באמצעות הפרוטוקול שלנו.

figure-results-3
איור 3: תמונת ניגודיות פאזה של פיברובלסטים ראשוניים בנרתיק ביום ה-14 של התרבית בהגדלה של פי 100 מתרחיף תאים מאוגד של שלוש ביופסיות של 1 ס"מ2 רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 מראה פיברובלסטים ראשוניים בהגדלה של פי 100 מתרחיף תאים מאוגד של 3 ביופסיות רקמה בממדים של 1 סמ"ר.

זהות פיברובלסט נחקרה על ידי טכניקות אימונופלואורסצנטיות כפי שתואר קודם לכן עם שינויים קלים. כדי לאמת את המקור התאי של תאי נרתיק ראשוניים, השתמשנו בסמנים ביולוגיים ספציפיים ממקור פיברובלסטי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. התאים זוהו כפיברובלסטים בהתבסס על צביעה חיובית של וימנטין (איור 4), F-אקטין ו-α-SMA מדגימות רקמה לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר (איור 5). פיברובלסטים תורבתו להתפשטות עם כדאיות גבוהה (>90%) לשימוש בניסויים.

figure-results-4
איור 4: צביעה חיובית של וימנטין של פיברובלסטים בנרתיק. הפיברובלסטים הראשוניים של הרקמה המבודדת לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר עברו ניתוח IF והתמונות צולמו בהגדלה של פי 200. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: צביעה חיובית של F-אקטין ו-α-SMA של פיברובלסטים בנרתיק. תוצאות ביטוי חלבונים בהשוואה לבקרת IgG. התמונות נאספו בהגדלה של פי 200. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים קודמים רבים דיווחו כיצד לבודד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי 3,7. מספר מחקרים השתמשו ברקמת נרתיק אנושית מאנשים לפני גיל המעבר עם צניחת איברי האגן. למרות שכמה מאמרים דיווחו על שימוש ברקמה מאנשים לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר 7,11, הם לא תיארו בפירוט מספיק את הפרוטוקול המשמש לבידוד מוצלח של פיברובלסטים מתורמים מבוגרים או לאחר גיל המעבר. דופן הנרתיק עבה יותר אצל נשים לאחר גיל המעבר עם צניחת איברי המין מאשר אצל נשים לפני גיל המעבר, מה שעשוי להסביר את הקושי המוגבר בבידוד באוכלוסייה זו13. בידוד מוצלח מתורמות לאחר גיל המעבר חיוני למידול וחקירת מחלות, שכן הפרעות ברצפת האגן שכיחות ביותר בקבוצות הגיל שלאחר גיל המעבר או מבוגרות יותר.

קבענו פרוטוקול לקציר וגידול מוצלח ועקבי של פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים מתורמים בגילאי 35-78. המקור התאי של תאי נרתיק ראשוניים אושר על ידי סמנים ביולוגיים ממוצא פיברובלסטי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית.

הליך בידוד הפיברובלסטים בנרתיק האנושי המוצג כאן מאפשר בידוד ותרבית של תאי פיברובלסט ראשוניים. מניסיוננו, השימוש בפרוטוקולים שפורסמו בעבר עבור רקמות בעלי חיים9ורקמותאנושיות 3,14,16 לדיסוציאציה של תאים ראשוניים לא הצליח לחלץ פיברובלסטים כלשהם מדגימות נרתיק אנושיות במחקר זה14.

שיערנו שתי סיבות אפשריות לאתגרים של ניתוק תאים מרקמת נרתיק אנושית: (1) עובי העור של הרירית גדול יותר אצל תורמים מבוגרים ובהשוואה לזה של רקמה לא רירית מתורמים מבוגרים13,17 מה שמקשה על דיסוציאציה של תאים ו-(2) צפיפות הפיברובלסטים עשויה להיות מופחתת במידה ניכרת אצל אנשים מבוגרים17.

בהתחשב באתגרים אלה, ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שאין לשנותם. הצעד הקריטי הראשון הוא יישום של עיכול מכני קפדני מאוד. כאן, אנו משתמשים בטכניקת שני אזמלים. מניסיוננו, החלפה במספריים לטחינת הרקמה אינה מניבה שברים קטנים מספיק כדי לנתק פיברובלסטים מרקמת הנרתיק האנושית.

השלב הקריטי השני הוא איגום תרחיף התאים ואיגום של 3-4 ביופסיות בעובי מלא (1 ס"מ2) מתורם יחיד. זה הכרחי כדי להשיג מספיק תאים לטיפוח מתמשך. בכל המקרים, קצרנו הרבה יותר רקמה מ 1 ס"מ2 כמו אפיתל הנרתיק עודף נחתך כחלק הכרחי של ניתוח צניחת איברי האגן. במחקר זה, איגמנו רק תרחיפים של תאים שמקורם באותו תורם, כאשר ביקשנו לחקור ולהבדיל מאפיינים תאיים והתפשטות בין תורמים שונים.

לפרוטוקול שלנו יש יתרון מובהק: העיכול המכני והאנזימטי מובילים לתפוקה טובה יותר לרקמות לאחר גיל המעבר, אך אין להם השפעה שלילית על דגימות לפני גיל המעבר.

אנו מכירים במספר מגבלות לפרוטוקול שלנו. גישה לרקמת נרתיק אנושית עשויה להיות מאתגרת במצבים בהם ניתוח צניחת נרתיק אינו מבוצע. הצורך באיגום תרחיפים של תאים של דגימות ביופסיה מרובות של רקמות עשוי להיות גם מגבלה.

לסיכום, פרוטוקול זה לרכישת פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים יהווה כלי שימושי למחקרים עתידיים בהפרעות רצפת האגן, במיוחד אצל אנשים לאחר גיל המעבר, כמו גם תוספת חשובה למחקר בריאות האישה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להביע את תודתנו לכל חברי מרכז וינסנט לביולוגיה של הרבייה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, כמו גם לקרן בית החולים VIncent Memorial, על תמיכתם הנדיבה. תודה מיוחדת לד"ר בו רואדה ולמעבדתו על הצעותיהם יקרות הערך ועל שהשאילו לנו ציוד מעבדה.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BBio TechneB23192
מסננת תאים (100 μ m)חרוטיים של ThermoFisher Scientific22363549
(15 מ"ל)Fisher Scientific 14-959-53A
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
אזמל חד פעמי נוצות מס' 15SocorexFB.15
סרום בקר עובריסיגמא אולדריץ'NC1983075
צינורות צנטריפוגה חרוטית בהירות גבוהה (50 מ"ל)פישר סיינטיפיק 14-432-22
HulaMixer מיקסר לדוגמאThermoFisher Scientific15920D
פיברונקטין אנושי DuoSet ELISAR& D SystemsDY1918-05
Human Pro-Collagen I אלפא 1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
פניצילין/סטרפטומיצין (5000U/ml)ThermoFisher Scientific15070063
צלחות פטרי, פוליסטירן (100 מ"מ x 20 מ"מ)Millipore SigmaP5606
פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)ThermoFischer Scientific170356N
מזרקים סטריליים (5 מ"ל)פישר סיינטיפיק14-955-458
צינורות צנטריפוגה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).">Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
  2. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).">MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
  3. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).">Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
  4. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).">Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  5. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).">Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
  6. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).">Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
  7. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
  8. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).">Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
  9. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).">Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
  10. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
  11. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).">Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
  12. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).">Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
  13. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).">Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
  14. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).">Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
  15. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).">Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
  16. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).">Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
  17. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).">Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vaginal Fibroblast IsolationPrimary FibroblastsPelvic Organ ProlapseHuman Vaginal TissueMechanical DissociationEnzymatic DigestionCell Suspension PoolingPostmenopausal TissuePhase Contrast MicroscopyImmunofluorescence Analysis

Related Articles