פרוטוקול זה מדגים טכניקה אמינה ויעילה לבידוד פיברובלסטים ראשוניים מרקמת הנרתיק האנושית לפני גיל המעבר או לאחר גיל המעבר. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד פיברובלסטים בנרתיק אינם לוקחים בחשבון את האתגרים של בידוד תאים מרקמה מזדקנת. רקמת הנרתיק התקבלה מנשים לאחר ניתוח צניחת איברי האגן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עיבוד רקמות ובידוד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי
במאמר זה
סיכום
תקציר
צניחת איברי האגן היא הפרעה המשפיעה קשות על איכות החיים של נשים. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק. ניתוח לתיקון צניחת איברי האגן היה טיפול עיקרי. לאחרונה גובר העניין בחקר הרכב הרקמה של חולים עם צניחה ברמה התאית.
כיום אין הסכמה לגבי ההשפעה של גיל התורם או המטופל על טיפולים מבוססי תאים. הפרוטוקולים הנוכחיים שפורסמו לבידוד פיברובלסטים בנרתיק מתרכזים ברקמה לפני גיל המעבר או מזניחים את ההערה על גיל הרקמה התורמת. רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים במודלים של בעלי חיים. העקביות של רקמת הנרתיק האנושית צפופה יותר מהרקמות המשמשות ברוב הפרוטוקולים. במחקר זה, רקמת נרתיק אנושית הושגה בעיקר מתורמים מבוגרים, מה שככל הנראה תרם לכישלון הפרוטוקולים הקיימים.
מטרת מחקר זה היא לתאר פרוטוקול סטנדרטי לרכישה אמינה של פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים, ללא קשר לגיל התורם ולמצב גיל המעבר. התוצאות שוחזרו באמצעות רקמות מתשעה תורמים נפרדים שעברו ניתוח לצניחת איברי האגן. שש מטופלות היו לאחר גיל המעבר, כאשר התורמת המבוגרת ביותר הייתה בת 78. הגיל החציוני של תורמי הרקמה היה 59.
במאמר זה אנו מתארים שיטה אמינה ליצירת תרחיף חד-תאי מועשר בפיברובלסטים באמצעות שילוב של דיסוציאציה אנזימטית ומכנית ואיגום תרחיף תאי של ביופסיות נרתיקיות מרובות מתורם יחיד. בידוד אמין של פיברובלסטים ראשוניים בנרתיק האנושי עשוי להיות שימושי בחקר צניחת איברי האגן, כמו גם אינטראקציות מיקרוביום-מארח.
מבוא
פער מגדרי במדע ובמחקר הוא נושא מתמשך. מחקר על הפרעות המשפיעות בעיקר על אנשים ממין נשי אינו ממומן1. צניחת איברי האגן היא הפרעה הקשורה מאוד למין הנשי. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק2. מעט ידוע על אינטראקציות תאיות בהקשר של פתופיזיולוגיה זו, וגם לא כיצד גורמים ברמת הרקמה משפיעים על הצלחת התערבויות כירורגיות3.
תאים ראשוניים ולא קווי תאים מוכרים באופן נרחב כחיוניים למחקר קליני תרגומי במתן רלוונטיות פיזיולוגית רבה יותר4. תאים ראשוניים נלקחים ישירות מרקמת הגוף המעניינת ועשויים לחקות בצורה מדויקת יותר את הפיזיולוגיה in vivo . בידוד של פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי עשוי להיות שימושי לחקר מנגנונים ביולוגיים של צניחת איברי אגן ומידול מחלות, בהתחשב במאפיינים מרכזיים של תורמים, כגון גיל ומצב גיל המעבר.
צניחת איברי האגן משפיעה בדרך כלל על אנשים מבוגרים או לאחר גיל המעבר. הבידוד וההתרבות של תאי פיברובלסט ראשוניים בחקר מצב זה מאתגרים בשל אוכלוסיות תאים מופחתות ויכולת קלונוגנית מתורמים מבוגרים5. מניסיוננו, השימוש בפרוטוקולים שתוארו קודם לכן לדיסוציאציה של רקמת הנרתיק לא הצליח לחלץ פיברובלסטים כלשהם מביופסיה סטנדרטית של רקמהבגודל 1 ס"מ 2.
באמצעות סקירת ספרות, מצאנו כי מחקרים דומים חולקו לשתי קבוצות: מודלים של בעלי חיים, כגון מורין6, ומודלים אנושיים 7,8. כאשר עוקבים אחר פרוטוקול העכבר, השימוש במספריים לעיבוד רקמות של רקמת נרתיק אנושית הניב עיכול מכני לקוי. אקסטרפולציה של פרוטוקולים באמצעות רקמת מורין ואתרי רקמה אחרים9 לא הצליחה.
רוב המאמרים שהשתמשו בדגימות נרתיק אנושיות השתמשו ברקמה מאנשים לפני גיל המעבר עם צניחת איברי אגן 7,10. למרות שכמה מאמרים דיווחו על שימוש בדגימות הן מאנשים לפני גיל המעבר והן לאחר גיל המעבר11, הם לא תיארו בפירוט מספיק את הפרוטוקול המשמש לבידוד מוצלח של פיברובלסטים מתורמים מבוגרים או לאחר גיל המעבר. בידוד ומידול מחלות באמצעות פיברובלסטים מרקמה לאחר גיל המעבר עשויים להיות חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה התאית של צניחת איברי האגן, שכן מצב זה הוא בעל השכיחות הגבוהה ביותר אצל אנשים בעשור שלאחר גיל המעבר12.
אנו מתארים שיטה לבידוד ותרבית של תרחיף חד-תאי מועשר בפיברובלסטים מרקמת נרתיק אנושית באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית ואנזימטית. מאמר זה מתאר פרוטוקול אמין כיצד לרכוש פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים לאחר גיל המעבר או הזדקנות. תאים מבודדים אושרו כפיברובלסטים באמצעות בדיקה מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ואימונופלואורסנציה (IF) כדי להעריך את הביטוי של וימנטין, F-אקטין ואקטין שריר α חלק (α-SMA).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
רקמת הנרתיק התקבלה מנשים שעברו ניתוח צניחת איברי האגן. רקמת הנרתיק שנאספה לאחר הניתוח נחשבה לחומר פסולת ואחרת הייתה מושלכת לפח. המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של מסצ'וסטס גנרל בריגהם.
1. קצירת רקמת הנרתיק מהמטופלת
- אבחון צניחת איברי האגן על ידי לקיחת היסטוריה ושימוש בממצאי בדיקת האגן: במרפאה התקבלו מדידות לכימות צניחת איברי האגן (POP-Q), שהראו עדות לצניחת איברי האגן.
- השתמש בקריטריוני ההכללה הבאים: מעל גיל 18; היסטוריה של צניחת איברי אגן סימפטומטית; בחירה לתיקון כירורגי של צניחת איברי האגן.
- לא לכלול את הדברים הבאים: נשים בהריון וחולים המסרבים לתרום רקמות.
- חתוך את רקמת הנרתיק העודפת כשלב הכרחי בניתוח צניחת איברי האגן. אפיתל נרתיקי זה נכרת בעובי כולל לאחר הניתוחים הבאים: קולפורפיה קדמית, קולפורפיה אחורית וקולפוקליזיס.
- הובלת רקמות למעבדה בכוס איסוף דגימות סטרילית עם מדיית DMEM/F12 (Gibco) רגילה נטולת מלח או סרום. שמור על קרח.
2. עיבוד רקמות ועיכול
- הכנת רקמות
- למדוד ולחתוך את הרקמה כדי להקיף את העובי המלא של אפיתל הנרתיק, יצירת מקטעים של כ 1 ס"מ2.
- יש להקפיד על מדידה מדויקת של גודל הביופסיה 1 ס"מ2.
הערה: הערכת יתר של גודל ביופסיית הרקמה עלולה לפגוע בעיכול הרקמות. - הכינו 2-3 ביופסיות נרתיקיות נוספות בגודל 1 ס"מכל אחת מתורם יחיד והניחו את הביופסיות בצד.
- עיכול מכני
- מניחים את הביופסיה הנרתיקית בצלחת פטרי תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. פיפטה 500-1,000 μL של מדיה ללא סרום בתוספת 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין בונטו רקמת הנרתיק כדי למנוע מהרקמה להתייבש.
- טוחנים את רקמת הנרתיק לשברים קטנים באמצעות שני אזמלים סטריליים (מס' 11 או מס' 15) בשתי הידיים.
- ודא שקצות הלהבים מאונכים לפני השטח של הרקמה. יש להפעיל לחץ שווה ויציב על פני הרקמה, באמצעות שני אזמלים. בצע פעולת משיכה לסירוגין כדי לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד.
- חזור על טכניקת טחינה זו בטכניקת שני אזמלים עד שהדגימה תהיה בעלת עקביות אחידה עם חתיכות 1-2 מ"מ.
הערה: עיכול מכני באמצעות טכניקה זו של שני אזמלים של ביופסיה 1 ס"מ2 צריך לקחת בערך 15-20 דקות כדי להשלים. - הוסף 2-3 מ"ל של מדיה DMEM/F12 ללא סרום בתוספת 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B לצלחת, משהה את הרקמה הטחונה. פיפטה התמיסה המכילה שברי רקמות למעלה ולמטה כדי לשבור את כל הגושים.
- עיכול אנזימטי
- להעביר את הפתרון המכיל שברי רקמות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף מדיה DMEM/F12 ללא סרום לצלחת תרבית הרקמה שבה רקמת הנרתיק נטחנה כדי לאסוף את שברי הרקמה שנותרו. מעבירים את התמיסה המכילה שברי רקמות לצינור החרוט. הוסף מדיה נוספת ללא סרום DMEM/F12 עד שהנפח הכולל הוא 10 מ"ל.
- יש להמיס 5 מ"ג ליבראז ב-1 מ"ל מים סטריליים (5 מ"ג/מ"ל). יש לאחסן ב-230 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש או -80°C למשך 6 חודשים.
- הוסף 230 μL של Liberase (מלאי 13 U / mL) לצינור, עם ריכוז סופי 0.3 U/mL.
הערה: פעילות Liberase עשויה להשתנות בין אצוות. יש להפשיר כל אליקוט מיד לפני השימוש באמצעות אמבט מים. הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. - חזור על שלבים 2.1-2.3 עבור 2-3 ביופסיות נרתיקיות נוספות של אותו תורם.
הערה: יש לשמור כל תמיסה המכילה שברי רקמה מביופסיה בודדת בצינורות חרוטיים נפרדים. לדוגמה, 4 ביופסיות נרתיקיות ב 4 צינורות. זה חשוב עבור כדורי תאים אופטימליים לאחר צנטריפוגה. - לדגור על הצינורות במשך 3 שעות ב 37 ° C עם תסיסה מתמדת ונמרצת באמצעות מיקסר לדוגמה.
- מניחים מערבל לדוגמה באינקובטור CO2 . שמור על תסיסה מתמדת. (הגדרות מיקסר לדוגמה: 25 סל"ד של תנועה סיבובית עבור 5 שניות, 30° של תנועה הדדית (סיבוב הטיה) עבור 5 שניות, ו 2° של תנועת רטט (מערבולת) עבור 3 שניות).
- במהלך הדגירה, מערבלים את הצינורות במרווחים של 30 דקות.
- צנטריפוגה את הדגימות ב 3,000 x גרם במשך 5 דקות. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
- יש להשהות מחדש את הגלולה במדיית DMEM/F12 של 1-2 מ"ל עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B כדי לדלל את אנזים ליבראז. פיפטה נמרצת עד הגלולה הוא resuspended לחלוטין.
3. תרבית תאים
- הסרת שברי רקמות לא מעוכלות
- מניחים מסננת תאים של 100 מיקרומטר מעל מיכל חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
- איגום את תרחיף התא מביופסיות הרקמה המרובות של אותו תורם יחד.
- מסננים את מתלה הרקמה/אנזים, לוחצים באמצעות בוכנה מזרק בנפח 5 מ"ל. חזור על שלב זה עד שנראה כי שברי הרקמה הנותרים נלחצים במלואם.
הערה: ייתכן שיש ריר מסוים משברי רקמת הנרתיק שאינו עובד במלואו דרך המסננת. השליכו את הריר עם מסננת התא.
- איגום תרביות תאים
- תרחיף תאים מאוגד פלטות מביופסיות נרתיקיות מרובות (מאותו תורם) על צלחת פטרי (60 מ"מ x 15 מ"מ).
- לדגור על צלחת פטרי באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
- התבונן ואשר את נוכחותם של תאים שאינם דבקים במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
- ודא שהמיקוד של המיקרוסקופ נמצא בתחתית הצלחת.
הערה: ייתכן שיש תאי חיסון רבים בחזית. מספר קטן יותר של פיברובלסטים יחוברו לתחתית הצלחת. - יש להמתין 18-24 שעות לפני שינוי מדיית תרבית התאים כדי להבטיח היצמדות נאותה של התאים.
- שנה את מדיום התרבות כל שלושה ימים עד 80% מפגש מתרחש. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-90%, יש להתרחב לבקבוק גדול יותר או להקפיא אליציטוטים של תאים לשימוש עתידי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רקמת הנרתיק נאספה מ-10 תורמים עצמאיים שעברו ניתוח צניחת אברי אגן. באמצעות הפרוטוקול המתואר, התאים בודדו מרקמת הנרתיק האנושית. אוכלוסיות התאים היו בעלות מראה מוארך, שטוח ובצורת ציר אופייני. בדומה למחקרים אחרים, נצפתה יכולת הכפלה איטית משמעותית של תאים ויכולת קלונוגנית מופחתת של פיברובלסטים עם העלייה בגיל התורם. הבדלים אלה ניכרו כאשר השוו פיברובלסטים שבודדו מאנשים מבוגרים (בני 75-78) לאלה שבודדו מאנשים צעירים (בני 35-47). תאים מתורמים בגיל העמידה הציגו פרופיל ביניים (56-61 שנים). שיעורי התרבות התאים הוערכו בתחילה על ידי הד...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים קודמים רבים דיווחו כיצד לבודד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי 3,7. מספר מחקרים השתמשו ברקמת נרתיק אנושית מאנשים לפני גיל המעבר עם צניחת איברי האגן. למרות שכמה מאמרים דיווחו על שימוש ברקמה מאנשים לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר 7,11, הם לא תיארו בפירוט מספיק את הפרוטוקול המשמש לבידוד מוצלח של פיברובלסטים מתורמים מבוגרים או לאחר גיל המעבר. דופן הנרתיק עבה יותר אצל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
ברצוננו להביע את תודתנו לכל חברי מרכז וינסנט לביולוגיה של הרבייה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, כמו גם לקרן בית החולים VIncent Memorial, על תמיכתם הנדיבה. תודה מיוחדת לד"ר בו רואדה ולמעבדתו על הצעותיהם יקרות הערך ועל שהשאילו לנו ציוד מעבדה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Bio Techne | B23192 | |
| מסננת תאים (100 μ m) | חרוטיים של ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| (15 מ"ל) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| אזמל חד פעמי נוצות מס' 15 | Socorex | FB.15 | |
| סרום בקר עוברי | סיגמא אולדריץ' | NC1983075 | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטית בהירות גבוהה (50 מ"ל) | פישר סיינטיפיק | 14-432-22 | |
| HulaMixer מיקסר לדוגמא | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| פיברונקטין אנושי DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Human Pro-Collagen I אלפא 1 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| צלחות פטרי, פוליסטירן (100 מ"מ x 20 מ"מ) | Millipore Sigma | P5606 | |
| פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| מזרקים סטריליים (5 מ"ל) | פישר סיינטיפיק | 14-955-458 |
מקורות
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
