הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65873

⸱

18 באוגוסט 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, 2Clinical Medical Research Center, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

במאמר זה

סיכום

החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.

תקציר

פריציטים הם תאי קיר חיוניים הממוקמים בתוך מיקרוסירקולציה מוחית, חיוניים בוויסות פעיל של זרימת הדם במוח באמצעות התאמות התכווצות. באופן קונבנציונלי, ההתכווצות שלהם נמדדת על ידי התבוננות בתזוזות מורפולוגיות ושינויים בקוטר הנימים הסמוכים בנסיבות ספציפיות. עם זאת, קיבוע לאחר רקמות, הערכת חיוניות והתכווצות פריציטים כתוצאה מכך של פריציטים במוח המודמיים נפגעים. באופן דומה, תיוג גנטי של פריציטים במוח אינו מבחין בין פריציטים בני קיימא ושאינם בני קיימא, במיוחד במצבים נוירולוגיים כמו דימום תת-עכבישי (SAH), שם החקירה הראשונית שלנו מאמתת את מותו של פריציטים במוח. פרוטוקול אמין פותח כדי להתגבר על אילוצים אלה, המאפשר תיוג פלואורסצנטי בו זמנית של פריציטים במוח תפקודיים ולא פונקציונליים באזורי מוח. שיטת תיוג זו מאפשרת הדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה, ובו זמנית מסמנת את פרוסת המוח microvasculature. פרוטוקול חדשני זה מציע אמצעי להערכת התכווצות הפריציטים במוח, השפעתה על קוטר הנימים ומבנה הפריציטים. חקירת התכווצות פריציטים במוח בהקשר SAH מניבה הבנה מעמיקה של השפעותיה על מיקרו-סירקולציה מוחית.

מבוא

פריציטים במוח, המובחנים על ידי הבליטות הדקות שלהם וגופי התא הבולטים, מקיפים את microcirculation 1,2. בעוד שהגברת זרימת הדם במוח מונעת בעיקר על ידי התרחבות נימית, עורקים קטנים יותר מציגים קצב התרחבות איטי יותר3. התכווצות פריציטים משפיעה על קוטר הנימים ועל המורפולוגיה של הפריציטים, ומשפיעה על דינמיקת כלי הדם4. התכווצות של פריציטים במוח מובילה להתכווצות נימית, ובתרחישים פתולוגיים, התכווצות יתר עלולה לעכב את זרימת אריתרוציטים5. גורמים שונים, כולל נוראפינפרין המשתחרר מהלוקוס קורולוס, יכולים לגרום להתכווצות פריציטים במוח בתוך נימים6. עם תפקיד מווסת בזרימת הדם במוח, פריציטים מציגים סינתזת 20-HETE, ומשמשים כחיישן חמצן במהלך היפראוקסיה7. התכווצות המופעלת על ידי מתח חמצוני-חנקני של פריציטים במוח משפיעה לרעה על נימים5. למרות מחקרי in vivo ו-ex vivo על התכווצות פריציטים במוח8, קיים ידע מוגבל בנוגע לדימות של פריציטים מוחיים בני קיימא ובלתי ברי קיימא בתוך פרוסות מוח.

באופן מכריע, דימות לאחר קיבוע רקמות של פריציטים במוח פוגע בחיוניותם ובהערכת ההתכווצות שלאחר מכן. יתר על כן, בתרחישים כגון הפרעות נוירולוגיות (למשל, דימום תת-עכבישי - SAH), תיוג מהונדס של פריציטים במוח אינו מצליח להבדיל בין פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא, כפי שאושר במחקר המוות הראשוני שלנו של פריציטים במוח הנגרם על ידי SAH9.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, השתמשנו ב-TO-PRO-3 כדי לתייג פריציטים חיים, בעוד שהמתים הוכתמו בפרופידיום יודיד (PI). השתמשנו בטכנולוגיות דימות קונפוקלי ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש פריציטים חיים ולא בני קיימא במוח בפרוסות מוח, תוך שמירה על פעילות הפרוסות במהלך ההדמיה. מאמר זה נועד להציג שיטה הניתנת לשחזור לדימות פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא במוח בפרוסות מוח, המשמשת ככלי רב ערך לחקירת ההשפעה של פריציטים במוח על מיקרו-סירקולציה מוחית לאחר SAH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) משני המינים, 300-350 גרם.

1. השראת מודל SAH

  1. מרדימים את החולדות באמצעות 2% איזופלורן ו-100% חמצן. לשמור על הרדמה על ידי אספקת הרדמה רציפה עם איזופלורן (1%-3%). אבטחו את ראש החולדה באמצעות מנגנון סטריאוטקסי (ראו טבלת חומרים).
  2. צור את מודל SAH לפי השלבים הבאים.
    1. הכנס מחט מיקרו-הזרקה לבור המים העל-סלרי. לאחר מכן, הזריקו דם אוטולוגי מעורק הזנב של החולדה (ללא נוגדי קרישה) לבור המים העל-סלרי באמצעות משאבת מזרק (ראו טבלת חומרים).
    2. להשתיל מחט microinjection לתוך החדר המוחי לרוחב ימין באמצעות הקואורדינטות שהוזכרו: bregma, −0.8 מ"מ; לרוחב, 1.4 מ"מ; עומק, 4 מ"מ9. עבור קבוצות SAH, להזריק 0.2 מ"ל של דם עורק זנב חולדה. עבור קבוצות דמה, יש לתת את אותו נפח של מי מלח איזוטוניים (איור 1A).

2. הכנת פרוסת המוח וייצוב

  1. מרדימים עמוקות את החולדות באמצעות שאיפת איזופלורן 2%. לאחר עריפת הראש, חלצו את כל המוחות וטבלו אותם בנוזל מוחי מלאכותי קר כקרח (ACSF).
    הערה: השתמש בפתרונות ACSF טריים שהוכנו עם ההרכב הבא: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2ו- 10.11 mM D-Glucose (ראה טבלת חומרים). שמור על pH בין 7.3 ל 7.4.
  2. השתמשו בוויברטום (ראו טבלת חומרים) כדי להכין פרוסות מוח חריפות בעובי של 200 מיקרומטר מחולדות SD ב-ACSF קר כקרח שמאוורר עם 5% CO 2 ו-95% O 2 (איור 2).
  3. הניחו את פרוסות המוח החריפות בעובי 200 מיקרומטר בתא אחסון על רשת ניילון שקועה ב-ACSF. אזנו את תמיסת ACSF עם 95% O 2 ו-5% CO2, תוך שמירה על טווח טמפרטורות של 35-37°C. אפשרו לפרוסות המוח להתייצב במשך שעתיים, מה שנתן להן זמן להסתגל (איור 3).

3. תיוג פריציטים בפרוסות מוח חריפות עם TO-PRO-3

הערה: פריציטים מפרוסות מוח חריפות סומנו באופן פלואורסצנטי באמצעות נותב TO-PRO-310.

  1. הוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי TO-PRO-3 ל-ACSF והגיעו לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. דגרו על פרוסות המוח החריפות בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם ACSF המכיל TO-PRO-3 למשך 20 דקות.
    הערה: זכור ללבוש כפפות לטקס בעת הטיפול ב-TO-PRO-3 להגנה.
  2. מעבירים את מסננת רשת הניילון, הנושאת את פרוסות המוח, מתא ההעמסה לתא שטיפת צלחות בעל 6 בארות (ראו טבלת חומרים). אפשרו לפרוסות המוח להישאר בתא השטיפה במשך 10 דקות (איור 4D).
    הערה: שלב שטיפה זה מסיים את תהליך הצביעה, מפחית את תיוג הרקע ומונע כתמים לא ספציפיים.
  3. שטפו את התכשירים במשך 15 דקות בסך הכל באמצעות תמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 5% CO 2 ו-95% O2. שלב השטיפה הזה עוצר את ספיגת הצבע וממזער את תיוג הרקע (איור 4C).

4. צביעת פריציטים לא חיוניים של microcirculation מוחי בפרוסות מוח חריפה

  1. דגרו פרוסות מוח טעונות מראש ב-TO-PRO-3 בטמפרטורה של 37°C עם איזולקטין B4 מצומד ל-Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 מיקרוגרם/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בסביבה חשוכה. לאחר הדגירה, שטפו את פרוסות המוח במשך 15 דקות ב-ACSF (איור 4E).
  2. לדגור על פרוסות המוח בגז ACSF עם 5% CO 2 ו 95% O2 כרגיל. הוסף פרופידיום יודיד (PI) בריכוז של 37 מיקרומטר לשתי התמיסות ב 37 ° C. זה יתייג פריציטים במוח שאינם חיוניים. דגרו על התכשירים בתמיסת ACSF זו במשך 60 דקות בחושך (איור 4F).
  3. לאחר מכן, שטפו את התכשירים במשך 15 דקות עם תמיסות ACSF כדי לעצור את ספיגת הצבע ולמזער את תיוג הרקע.

5. הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח חריפות

  1. מעבירים בעדינות פרוסות מוח לכלים קונפוקליים בתחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) בעזרת פיפטות פלסטיק של פסטר. מלאו את הכלים בתמיסת ACSF ששוותה בעבר עם 5% CO 2 ו-95% O2. השתמשו ברשת ברזל כדי לאבטח פרוסות מוח של חולדות במקומן.
  2. מעבירים את הכלים הקונפוקליים בתחתית הזכוכית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. מקמו את פרוסת המוח החריפה בתחתית הצלחתונתלו 9 אותה בתמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 95% O2 ו-5%CO2 במהלך דימות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 5A ואיור 5Ab).
  3. דמיינו את תאי הקיר של כלי הדם בקליפת המוח באמצעות מטרה של פי 40. לכוד אוספי תמונות באמצעות תוכנה תואמת (ראה רשימת חומרים). השתמש במסננים מתאימים עבור IB4 (עירור/פליטה 460 ננומטר/520 ננומטר), PI (עירור/פליטה 545 ננומטר/595 ננומטר) ו-TO-PRO-3 (עירור/פליטה 606 ננומטר/666 ננומטר) (איור 5D).
    הערה: צלם תמונות עם הפרטים הבאים: 40× DIC N1 עדשה אובייקטיבית, 3 × 12 סיביות: 512 × 512 פיקסלים (0.22 × 0.22 מ"מ), כיול: 0.42 מיקרומטר/פיקסלים.
  4. לזהות microvasculature מוחי ו pericytes מבוסס על הרשת שלהם ואת המורפולוגיה. אתר אזור ספציפי המכיל רשת כלי דם מוחיים על כל פרוסת מוח וצלם תמונות.
  5. שימו לב בזהירות למיקום ההדמיה כדי להבטיח עקביות בלכידות הבאות (איור 5B,C). לעיבוד וניתוח נוספים, השתמש בתוכנה לניתוח תמונות (ImageJ) ובתוכנה לעריכת תמונות (ראה טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתנאים פיזיולוגיים רגילים, פריציטים במוח בדרך כלל אינם עוברים מוות תאי. איור 6 ממחיש את התופעה הזו, כאשר צהוב מציין נוכחות של פריציטים חיוניים במוח; פריציטים במוח אינם מראים כתמים עם PI, מה שמצביע על יכולת הקיום שלהם. כדי להמשיך ולחקור אם פריציטים נשארים מחוברים לכלי הדם הזעירים לאחר מוות תאי, נעשה שימוש בשיטות במודל של חולדות SAH, ולאחר מכן נערכו הדמיות.

פותחו שיטות לדימות פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר SAH. כפי שמתואר באי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פותחו טכניקות הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה להדמיית פריציטים חיוניים במוח, פריציטים לא חיוניים במוח והמיקרו-כלי דם בפרוסות מוח. בפרוסות מוח חריפות של חולדות, התהליך כרוך בתיוג ראשוני של פריציטים עם TO-PRO-311, ואחריו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם IB412; לאחר מכן, זיהוי של pericytes שנפטרו מתבצע באמצעות PI. פרוטוקול זה הוא פשוט, ניתן לשחזור וישים מאוד למחקר פונקציונלי.

כדי לעקוב באופן ספציפי אחר פריציטים במוח בתוך מערכת העצבים, נעשה שימוש בפלואו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226,81760223); הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045,202301AY070001-011)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 6 בארותABC ביוכימיהABC703006RT
Adobe PhotoshopAdobeAdobe Illustrator CS6 16.0.0
RT רדיד אלומיניוםMIAOJIE225 מ"מ x 273 מ"מRT
CaCl2· 2H2OSigma-AldrichC3881RT
תוכנת הדמיה קונפוקליתNikonNIS-Elements 4.10.00RT
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליNikonN-SIM/C2siRT
מיכל גז (5% CO2, 95% O2)PENGYIDA40L
RT זכוכית תחתון כלים קונפוקלייםBeyotimeFCFC020-10 יחידותRT
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G5767דבק RT
מכונתEVOBONDKH-502RT
מכונת קרחXUEKEIMS-20RT
תוכנת ניתוח תמונההמכונים הלאומיים לבריאותתמונה JRT
מערכת הרדמה אינהלציהSCIENCEQAF700RT
איזולקטין B 4- FITCSIGMAL2895– 2MGחנות ב – 20 מעלות; C
KClSigma-Aldrich7447– 40– 7RT
KH2PO4Sigma-AldrichP0662
RT MgSO4Sigma-AldrichM7506
RT NaClSigma-Aldrich7647– 14– 5RT
NaH2PO4· H2OSigma-Aldrich10049– 21– 5RT
NaHCO3Sigma-AldrichS5761RT
פסטר פיפטהNEST ביוטכנולוגיה318314RT
משאבה פריסטלטיתScientific Industries Incדגם 203RT
פרופידיום (יוד)Med Chem ExpressHY-D0815/CS-7538חנות ב – 20 מעלות; C
מכשיר סטריאוטקסיSCIENCEQART
משאבת מזרק משאבתהרווארדמשאבת 11 ELITE NanomiteRT
אמבט מים תרמוסטטיOLABOHH-2RT
מיקרוטום רוטטLeicaVT1200RT
קרח

מקורות

  1. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
  2. Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
  3. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  4. Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
  5. Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
  6. Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
  7. Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
  8. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  9. Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
  10. Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).
  11. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  12. Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
  13. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  14. Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
  15. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  16. Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
  17. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

כיווצות פריציטיםסימון פלואורסצנטימיקרוסקופיה קונפוקליתדימוי של מיקרו-וסקולטורהחיות פריציטיםפרופידיום יודאידIsolectin B4
הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.