מאמר שיטה

בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר

DOI:

10.3791/65890

⸱

11 באוגוסט 2023

 ,  ,  , 
1Department of Oral Pathology, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices, 2Research Unit of Precision Pathologic Diagnosis in Tumors of the Oral and Maxillofacial Regions, Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU034), 3Central Laboratory, Peking University School and Hospital of Stomatology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא סוג נפוץ של הפרעה שעלולה להיות ממאירה בחלל הפה. ניוון אפיתל ופיברוזיס של lamina propria ואת submucosa נמצאים לעתים קרובות על שקופיות היסטופתולוגיות. דיספלסיה אפיתליאלית, ניוון אפיתל ופיברובלסטים מזדקנים הוצעו כקשורים לשינוי ממאיר של OSF. עם זאת, בגלל ההטרוגניות של הפרעות אוראליות שעלולות להיות ממאירות וקרצינומה של תאי קשקש אוראליים, קשה לזהות את המנגנונים המולקולריים הספציפיים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF. כאן, אנו מציגים שיטה להשגת מספר קטן של תאים אפיתליאליים או מזנכימליים הנושאים נתונים מורפולוגיים ומידע מרחבי על ידי לכידת לייזר microdissection על שקופיות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין. באמצעות מיקרוסקופ, אנו יכולים ללכוד במדויק מיקרוסקאלה (~ 500 תאים) רקמת אפיתל דיספלסטית או אטרופית ורקמה תת-אפיתל פיברוטית. ניתן להעריך את התאים שחולצו על ידי ריצוף גנום או שעתוק כדי להשיג נתונים גנומיים ושעתוק עם מידע מורפולוגי ומרחבי. גישה זו מסירה את ההטרוגניות של ריצוף רקמות OSF בתפזורת ואת ההפרעה הנגרמת על ידי תאים באזורים שאינם נגועים, ומאפשרת ניתוח מרחבי מדויק של רקמת OSF.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא מחלה כרונית וחתרנית המתפתחת בעיקר ברירית הבוקאלית וגורמת לפתיחת פה מוגבלת1. בעוד OSF היא מחלה multifactorial, אגוז ארקה או אגוז betel לעיסה היא הגורם העיקרי של OSF 2,3. בגלל הרגל גיאוגרפי ספציפי זה, OSF מרוכז בעיקר באוכלוסיות בדרום מזרח ודרום אסיה3. המאפיינים ההיסטולוגיים הנפוצים של OSF כוללים שקיעת קולגן חריגה ברקמת החיבור מתחת לאפיתל רירית הפה, היצרות כלי הדם וחסימה1. רקמת אפיתל OSF יכולה להציג עם ביטויים של ניוון או hyperplasia ואפילו דיספלסיה כאשר במקביל leukoplakia אוראלי 4,5.

OSF מוגדר על ידי ארגון הבריאות העולמי כהפרעה פומית פוטנציאלית ממאירה נפוצה (OPMD) המציגה את הפוטנציאל להתקדם לקרצינומה של תאי קשקש אוראליים עם שיעור טרנספורמציה ממאירה של 4%-6%6,7,8,9. המנגנון העומד בבסיס הטרנספורמציה הממאירה של OSF הוא מורכב10. גדילה חריגה של האפיתל, כולל דיספלזיה וניוון, מגבירה את הפוטנציאל לקרצינוגנזה, ופיברובלסטים מזדקנים בסטרומה עשויים להיות מעורבים בהתקדמות הממאירה של OSF על ידי גרימת מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) דרך מיני חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות10.

טכנולוגיות לניתוחים מרחביים-אומיים הפיקו נתונים רב-אומיים עם מידע מורפולוגי ומרחבי שסיפקו תובנות לגבי מנגנוני סרטן11,12,13. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אוכלוסיות תאים הקשורות למורפולוגיה מרקמת OSF משובצת פרפין קבועה פורמלין על ידי מיקרודיסקציה בלייזר. ניתוחים רב-אומיים של דגימות אלה יכולים להתגבר על אתגרים עם הטרוגניות תוך רקמתית ולהגביר את ההבנה של הפתולוגיה המולקולרית והמנגנונים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית הספר ובית החולים של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה לא זוהו. סכמת המחקר מוצגת באיור 1.

1. הכנת מדגם

  1. חתכו רקמות פיברוזיס תת-ריריות אוראליות משובצות פרפין קבועות פורמלין למקטעים רציפים בעובי 3 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר על מיקרוטום.
  2. פרשו את המקטעים במים ואז דגו החוצה אל המגלשות. תקן את המקטעים של 3 מיקרומטר ו- 10 מיקרומטר בשקופיות מיקרוסקופ הדבקה (שקופית A) ושקופיות קרום PEN (שקופית B), בהתאמה.
  3. הניחו את המגלשות על פלטה חמה בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים.

2. צביעת Hematoxylin-eosin

  1. מקם שקופיות A ו- B בקסילן (זהירות) למשך 10 דקות וחזור על שלב זה שלוש פעמים.
  2. לחות שקופיות A ו- B בתמיסות אתנול מדורגות בסדר גודל של 100%, 100%, 90%, 80% ו- 70% למשך דקה אחת בכל ריכוז.
  3. הניחו מגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות
  4. מניחים שקופיות A ו- B בתמיסת צבע המטוקסילין של האריס למשך 90 שניות.
  5. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
  6. מקם שקופיות A ו- B בתמיסת div-hematoxylin (זהירות) למשך 2 שניות.
  7. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
  8. מקם שקופיות ב- A ו- B בתמיסת 1% כחול מחדש למשך 2 שניות.
  9. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
  10. מניחים שקופיות בתמיסת eosin למשך 2 שניות.
  11. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
  12. יש לייבש את השקופיות בתמיסות אתנול מדורגות בסדר גודל של 70%, 80%, 90%, 100% ו-100% עבור 2 שניות בכל ריכוז.
  13. הניחו את שקופית A בקסילן למשך 3 דקות וחזרו על שלב זה פעמיים.
  14. הוסף טיפה של אמצעי הרכבה (זהירות) כדי להחליק A ולכסות אותו בזכוכית כיסוי.

3. תצפית על מורפולוגיה היסטולוגית ומיקרודיסקציה לכידת לייזר

  1. הפעל את מערכת המיקרודיסקציה של הלייזר ואת התוכנה (איור 2).
  2. מקם את שקופית A על במת השקופיות והתבונן במורפולוגיה ההיסטולוגית כדי לזהות את אזור העניין למיקרודיסקציה בלייזר.
  3. הסר את שקופית א' ומקם את שקופית ב' הפוך על במת השקופים.
  4. לחצו על הלחצן Unload (איור 2) כדי לדחוף החוצה את התקן האיסוף. הכנס צינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) להתקן האיסוף וודא שהצינור מוחזק קבוע. לחצו על הלחצן OK (איור 3).
  5. בחר מכסה על-ידי לחיצה על העיגול האדום המתאים המסמן את התקן האספן: מכסי צינורות. העיגול שנבחר יהפוך לירוק.
  6. לחץ על לחצן צייר וצייר + גזור כפתור והשתמש בעכבר כדי לשרטט את תחום העניין.
  7. לחץ על התחל גזירה כפתור כדי ללכוד את אזור העניין; הדגימה שתילכד תיאסף על-ידי הכובע (איור 4).
  8. לחץ על הלחצן התחתון כדי לוודא שהדגימה שנלכדה נאספת (איור 5).
  9. לחץ על לחצן הדגימה כדי ללכוד את הדגימה הבאה.
  10. לחץ על Unload כפתור לפריקת צינור ה- PCR עם הדגימה שנתפסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על-ידי ביצוע מיקרודיסקציה בלייזר של רקמות OSF, לכדנו דגימות של אפיתל דיספלסטי, סטרומה מתחת לאפיתל דיספלסטי, אפיתל אטרופי וסטרומה מתחת לרקמת אפיתל אטרופית (איור 1). באמצעות חילוץ דנ"א וריצוף גנום שלם בעומק נמוך, הצלחנו לנתח שינויים הקשורים למורפולוגיה של מספרי העתקים (CNA)15. CNA היא צורה נפוצה של חוסר יציבות גנומית הקשורה לסיכון מוגבר לשינוי ממאיר ב- OPMD15,16. זיהינו דפוסי CNA שונים בין ארבעה סוגים של דגימות....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה דיווח על צינור ללכידת דגימות רקמת OSF עם מידע מורפולוגי ומרחבי לניתוחים מרחביים-אומיים נוספים באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. מהתוצאות המייצגות, זיהינו דפוסי CNA שונים בקרב דגימות שונות הקשורות למורפולוגיה.

OSF, סוג של OPMD, הוא מצב טרום סרטני נפוץ של קרצינומה של תאי קשקש אוראליים6. דווח כי חוסר יציבות גנומית קשורה להתפתחות וטרנספורמציה ממאירה של OPMD17,18. מחקרים רבים דיווחו על שינויים בכרומוזומים, ביט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81671006, 81300894), קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-038), פרויקט הבנייה הלאומי של דיסציפלינה קלינית מרכזית (PKUSSNKP-202102), קרן חדשנות לדוקטורנטים מצטיינים של המרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת פקין (BMU2022BSS001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקופיות מיקרוסקופ הידבקותCITOTESTREF.188105
Div-haematoxylinYiLi20230326
תמיסת אאוזיןBASOBA4098
מגיב אתנולפקיןמס' 32061
תמיסת צבע המטוקסילין האריסYiLi20230326
פלטה חמהLEICAHI1220
מערכת מיקרו-דיסקציה לכידת לייזרLEICALMD7מכונת
מיקרו-דיסקציה בלייזר מיקרו-מערכתLEICA8.2.3.7603תוכנה
מדיום הרכבה מיקרו-הרLEICAREF.3801731
זכוכית כיסוי מיקרוסקופCITOTESTREF.10212450C
מיקרוטוםLEICARM2235
צינורות PCRAXYGEN16421959
מגלשות ממברנתPEN LEICANo.11505158
תמיסה כחולהRe YiLi20230326
מים מזוקקים טהוריםבמיוחד InvitrogenREF.10977-015
מגיב קסילןפקיןמס' 33535

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
  2. Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949(2022).
  3. Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
  4. Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).
  5. Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
  6. Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
  7. Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619(2021).
  8. Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).
  9. Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
  10. Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).
  11. Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).
  12. Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
  13. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  14. Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).
  15. Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
  16. Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
  17. Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
  18. Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).
  19. Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).
  20. Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
  21. Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).
  22. Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
  23. Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).
  24. Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
  25. Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
  26. Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים