Method Article

הזרקת זרע עגולה לעכבר

DOI:

10.3791/65898

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Reproductive Medicine, First Hospital of Jilin University, 2Center of Prenatal Diagnosis, First Hospital of Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי זרע עגולים, המאופיינים בתכולתם הגנטית הפלואידית, מייצגים את התאים המקדימים לזרעונים בוגרים. באמצעות הטכניקה החדשנית של הזרקת זרע עגולה (ROSI), ניתן להפרות ביציות בהצלחה ולהתפתח לעוברים בני קיימא. באבן דרך פורצת דרך שהושגה בשנת 1995, נולד עובר העכבר הראשון באמצעות טכנולוגיית ROSI. ROSI התגלה מאז ככלי מרכזי לפענוח המנגנונים המורכבים השולטים בהתפתחות העוברית והוא טומן בחובו פוטנציאל משמעותי ביישומים שונים, כולל האצת ייצור עכברים וייצור עכברים מהונדסים גנטית. בשנת 1996 הושגה אבן דרך כאשר נולד העובר האנושי הראשון באמצעות טכנולוגיית ROSI. עם זאת, היישומים הקליניים של שיטה זו הראו דפוס משתנה של הצלחה וכישלון. עד כה, טכנולוגיית ROSI לא מצאה יישום נרחב בפרקטיקה הקלינית, בעיקר בשל יעילות הלידה הנמוכה שלה ותיקוף לא מספיק של בטיחות העובר. מאמר זה מספק תיאור מקיף של השיטות המדויקות לביצוע ROSI בעכברים, במטרה לשפוך אור חדש על מחקר בסיסי והיישומים הקליניים הפוטנציאליים שלו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלב הסופי של הזרע כולל את הפיכתו של זרע עגול לזרע מפותח, המאופיין במבני ראש, צוואר וזנב מוארכים1. טרנספורמציה זו כוללת שינויים משמעותיים במורפולוגיה של התא, כגון עיבוי הכרומטין בגרעין, החלפת היסטונים בפרוטמין, היווצרות אקרוזומים, התפתחות מעטפת מיטוכונדריאלית, נדידה ואובדן צנטריולים, היווצרות מבנה זנב וסילוק שאריות תאיות2.

בשנת 1992, העובר האנושי הראשון נולד בהצלחה באמצעות טכנולוגיית הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI)3. מאז, חוקרים בוחנים את הפוטנציאל של שימוש בזרעונים עגולים, החולקים את אותו הרכב גנטי הפלואידי כמו זרעונים בוגרים, כדי להפרות ביציות ולקיים הריונות בני קיימא 2,4. לאחר מכן, בשנת 1996, העובר האנושי הראשון שנולד באמצעות טכנולוגיית הזרקת זרע עגולה (ROSI) נמסר 5,6. ראוי לציין כי מחקרים הכוללים ICSI ו- ROSI בעכברים פיגרו אחרי אלה בבני אדם בשל הרגישות של קרום ביצית העכבר לנזק במהלך תהליך ההזרקה. בעיה זו נפתרה בהצלחה עם כניסתו של מכשיר שבירת קרום Piezo. כתוצאה מכך, בשנת 1995, העכבר הראשון שהגה באמצעות טכנולוגיית ROSI נולד. בנוסף, מחקר על ROSI בבעלי חיים שונים אחרים נמצא גם הוא בעיצומו 7,8.

כיום, המחקר על ROSI מתמקד בעיקר בהיבטים הבאים: יישום קליני, הבהרת מנגנונים ואסטרטגיות לשיפור היעילות ההתפתחותית, יחד עם יישומים רחבים יותר של טכנולוגיית ROSI. בהקשר של יישומים קליניים, למרות לידתו של העובר האנושי הראשון ROSI באמצעות ROSI בשנת 1996, ההתקדמות סומנה על ידי סדרה של הצלחות וכישלונות 9,10,11,12. עד כה, טכנולוגיית ROSI לא השיגה יישום קליני נרחב, בעיקר בשל יעילותה הנמוכה והצורך בתיקוף נוסף לגבי בטיחות עוברים שנולדו באמצעות טכנולוגיית ROSI. נתונים סטטיסטיים חלקיים מצביעים על כך שברחבי העולם נולדו פחות מ-200 עוברים אנושיים שנולדו כתוצאה מ-ROSI. נקודת מפנה בהבנת הפוטנציאל של טכנולוגיית ROSI התרחשה בשנת 2015 כאשר Tanaka ועמיתיו דיווחו על לידה מוצלחת של 14 עוברים באמצעות טכנולוגיית ROSI, מה שהחדיר אמון מחודש ביישום הקליני שלה ואת היתכנות13,14. טכנולוגיית ROSI טומנת בחובה הבטחה משמעותית להתמודדות עם אתגרים בביולוגיה של הרבייה, במיוחד בחולי אזוספרמיה לא חסימתית. בנוסף ליישומים הקליניים שלה, ROSI משמש כלי רב ערך לחקר המנגנונים המורכבים של התפתחות עוברית 15,16,17.

מחקרים רבים בבעלי חיים נערכו כדי לחקור את הגורמים הבסיסיים התורמים ליעילות הנמוכה של ROSI בהשגת התפתחות עוברית מלאה. גורמים אלה כוללים את הבחירה של שיטות הפעלת ביציות בסיוע (AOA) ואת העיתוי שלהם, חריגות ביציבות הגנומית, ובמיוחד, חריגות בשינויים אפיגנטיים. חשוב להכיר בכך שזרעונים עגולים הם תאי נבט לא בשלים, השונים באופן משמעותי מזרעונים בוגרים בהיבטים פיזיולוגיים שונים. מיזוקי סקמוטו ועמיתיו ציינו כי H3K27me3, שמקורו בזרעונים עגולים, קשור לכרומטין שהוא פחות נגיש ומוביל לביטוי גנים לקוי בעוברי ROSI18. במחקר קשור של ג'ינג וואנג ועמיתיו, פגמים בתכנות מחדש בעוברי ROSI בשלבים הפרו-גרעיניים היו קשורים בעיקר לביטוי שגוי של עוקבה של הגנים האחראים להפעלת גנום זיגוטי מינורי19. הם גם מצאו כי החדרת מעכב היסטון ליזין מתילטרנספראז 2 סלקטיבי, A366, עשויה לשפר את קצב ההתפתחות הכולל בערך פי שניים.

העכבר עומד כאחד מחיות המודל החשובות ביותר לחקר התפתחות עוברית. מאמר זה מפרט כיצד לבצע ROSI על עכברים. פרוטוקול מקיף זה כולל בחירת עכברים מתאימים, הליכי השראת ביוץ מפורטים, טכניקות AOA, טכניקות הזרקה והכנת עכברים פונדקאיים. יתר על כן, אנו מציגים ניתוח השוואתי של ההשפעות של שני משטרי הזרקה על יעילות הלידה: AOA ואחריו ROSI (A-ROSI; משטר ראשון) ו- ROSI ואחריו AOA (ROSI-A; משטר שני). אנו שואפים לעודד חוקרים לבצע ניסויי ROSI בעכברים בדיוק רב יותר, ולהציע תמיכה איתנה יותר ליישום הקליני שלהם ולמחקר הבסיסי של מנגנוני התפתחות עובריים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברי B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 ו-ICR ששימשו בניסוי זה נרכשו מחברת Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (בייג'ינג, סין). כל הטיפולים בבעלי חיים עמדו בנהלים ובסטנדרטים הניסיוניים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים ניסיוניים של בית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ילין (מספר אישור: 20200435).

1. הכנת ריאגנטים רלוונטיים

  1. לרכוש כמה ריאגנטים באופן מסחרי ולהכין עצמית את ריאגנטים הנותרים.
    1. השג את M2, מערכת חיץ לעיבוד חוץ גופי של זרעונים עגולים (RS), זרעונים וביציות מהספק.
    2. הכינו את המדיום C.L. Chatot, C.A. Ziomek ו-B.D. Bavister (CZB) ללא Ca2+ עבור AOA בהתאם לפרוטוקול20 שפורסם בעבר.
    3. קבל מהספק את המדיום הממוטב לאשלגן סימפלקס בתוספת תמיסת חומצות אמינו (KSOMaa) לתרבית עוברים.
    4. הכינו היאלורונידאז, עם ריכוז עבודה של 0.1% (1 גרם / ליטר), על ידי המסת 0.1 גרם של היאלורונידאז ב 1 מ"ל של מים עובריים. קח 10 μL של פתרון אחסון מרוכז להתמוסס ב 990 מ"ל של M2, אשר יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C במשך שבוע אחד.
    5. הכנת פוליוויניל פירולידון (PVP), עם משקל מולקולרי ממוצע של 360,000 וריכוז מסה של 12%, על ידי המסת 1.2 גרם PVP ב 10 מ"ל של M2. הפתרון המתקבל יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C במשך שבוע 1.
    6. אחסן את תמיסת המלאי cytochalasin B (CB) (2 μL), מסיסה ב- 18 μL של DMSO ב- -20 ° C. קח 5 μL של פתרון אחסון מרוכז להתמוסס ב 995 מ"ל של M2. הפתרון המתקבל יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C במשך שבוע 1.

2. הכנת ביציות

  1. התאקלמו נקבות עכברי B6D2F1, בגילאי 6-8 שבועות, בסביבתן החדשה למשך שבוע אחד לפחות. יש להזריק תוך צפקית 7.5 IU של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) בשעה 17:00, ולאחר מכן 7.5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) 48 שעות מאוחר יותר. יש לוודא שלא נוצר מגע עם עכברים זכרים לאחר ההזרקה.
    הערה: השעה שצוינה (17:00) אינה חובה. זה רק לנוחות העבודה. 14 השעות לאחר השעה 17:00 הן 7 בבוקר, כאשר הביציות מוכנות, וההזרקה מבוצעת, כך שזמן ההזרקה נקבע לבוקר. ניתן להתאים את שעת תחילת ההזרקה בהתאם לסדר היום של המעבדה.
  2. לאחר 14 שעות של הזרקת HCG, הרדימו את העכברים בשיטת פריקת צוואר הרחם. פתח את חלל הבטן ואתר את הרחם. לזהות את השחלות לאורך הרחם ולנתק את החצוצרות ליד השחלות באמצעות מספריים. חזור על אותו הליך בצד השני ומקם את החצוצרות ב- M2, אשר מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. תחת מיקרוסקופ זקוף (10x), אתר את החלק המוגדל של החצוצרה, מראה שקוף ונפוח. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לאבטח את החצוצרה בעת חיתוך החלק המוגדל, איסוף ביצית קורונל קומולוס קומפלקסים (OCCCs).
  4. הכניסו OCCCs לתמיסת הפעלה M2 שחוממה מראש המכילה 0.1% היאלורונידאז והוציאו תאי גרנולוזה על ידי נשיפה עדינה דרך פיפטה אוראלית.
    הערה: יש לשמור את ה-OCCCs ב-0.1% היאלורונידאז למשך זמן קצר, כ-2 דקות, במידת הצורך.
  5. לאחר הסרת תאי הגרנולוזה מעבירים את הביצית ל-KSOMaa, שוטפים 3x ומניחים באינקובטור פחמן דו חמצני לשימוש מאוחר יותר (37°C, 5% CO2).

3. הכנת זרעונים עגולים וזרעונים

  1. אספו זרעונים עגולים וזרעונים מהאשכים והאפידידימיס של עכברי C57BL/6 זכרים (8-10 שבועות), בהתאמה.
    1. עבור זרעונים, להרדים את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם. פתח את חלל הבטן, אתר את האפידידימיס ליד האשכים, ובעדינות הבלו עם מספריים.
    2. מניחים את האפידידימיס בתווך M2 ומוציאים בעדינות באמצעות מזרק 1 מ"ל כדי לאפשר לזרעונים לזרום החוצה תחת מיקרוסקופ זקוף (10x).
    3. סיפון הזרעונים הזורמים ותרחיף M2 לתחתית צינור המכיל 0.5 מ"ל של M2, ומאפשר לזרעונים לזרום במעלה הזרם באופן טבעי. הניחו אותם בצד לשימוש מאוחר יותר.
    4. עבור זרעונים עגולים, להסיר את האשכים מחלל הבטן ומניחים אותם M2. חותכים בעדינות את הממברנה הלבנה באמצעות מזרק 1 מ"ל וסוחטים את צינוריות הזרע המפותלות החוצה תחת מיקרוסקופ זקוף (10x).
    5. הבלו את tubules seminiferous בזהירות באמצעות שני מזרקים 1 מ"ל. חלצו את המתלה והמסנן בעזרת מסננת בעלת 400 רשת (38 מיקרומטר).
  2. צנטריפוגו את התאים המסוננים, השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 200 μL של Hoechst 33342 לצביעה, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות.
  3. בצע מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להבחין בין זרעונים עגולים לבין סוגי תאים אחרים. הכניסו את התאים המוכתמים לצינור ציטומטריית זרימה ובצעו בדיקת זרע עגולה.
    1. מודלים שונים של מכונות ציטומטריית זרימה יש פרמטרים רגולטוריים שונים וניתן לתקשר עם תמיכה טכנית במהלך המבצע. כצעד ראשון, כוונן את המתח ובחר את אוכלוסיית התא לפי פיזור קדמי (FSS) ופיזור צדדי (SSC; ראה טבלה משלימה 1).
    2. בשלב השני, הסירו הידבקויות תאים בהתאם ל-FSC והפעילו את רוחב הדופק.
    3. כשלב השלישי, בחר את הזרעונים העגולים הפלואידיים המטרה. Hoechst 33342 נקשר לדנ"א, ותאים עם פלואידיות שונות מפגינים עוצמות פלואורסצנטיות שונות. הגדר את אורך גל העירור ל- 355. בחר שני ערוצי גילוי, 460/50 ו- 670/30, תחת לייזר באורך גל 355 כדי למיין זרעונים עגולים. לאחר מכן, אחסנו את הזרעונים העגולים הממוינים במקרר בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: ניתן גם לבחור ישירות זרעונים עגולים על סמך המורפולוגיה שלהם תחת מיקרוסקופ, אך נדרשת הכשרה כדי להבטיח דיוק בחירה.

4. הזרקת זרע עגולה (ROSI)

  1. בצע את הליך ROSI באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מערכת מיקרומניפולציה.
  2. בשלב ההכנה הראשוני, לעשות מחטים החזקה והזרקה על פי הליך שתואר לעיל21. שמור על הקוטר הפנימי של מחט ההזרקה בין 6-7 מיקרומטר, המיועד למיצוי זרעונים עגולים, ולמחט המחזיק, יש קוטר פנימי של 20 מיקרומטר לאבטחת הביצית.
  3. בשלב ההכנה הבא, צור כלי הזרקה על ידי הנחת 10 μL של טיפות M2 המכילות CB לריכוך הביציות ו -10 μL של טיפות M2 לאחסון זרעונים עגולים. השתמש בטיפות PVP כדי להרטיב ולנקות את מחטי ההזרקה.
    הערה: הוספת CB כאן אינה צעד הכרחי, אך הוספת CB יכולה לשפר מאוד את שיעור ההישרדות לאחר ההזרקה.
  4. חילוץ זרעונים עגולים באמצעות מחט הזרקה.
  5. סובבו את הביצית עם מחט החזקה, ומקמו את גוף הקוטב של הביצית בשעה 12 או בשעה 6.
  6. מניחים את מחט ההזרקה בזהירות במצב השעה 3 על הביצית, תוך היצמדות הדוקה לזונה פלוסידה. השתמש במכשיר PiezoXpert כדי ליצור חור בזונה פלוסידה. התאם את הכוח מקטן לגדול, שהוא בערך עוצמה = 5 ומהירות = 15 כאן.
  7. מקדמים בעדינות את מחט ההזרקה דרך הזונה פלוצ'ידה ונכנסים לביצית בצורה אופקית. כאשר הוא עובר את מרכז הביצית, יש למרוח פייזו (עוצמה = 1 ומהירות = 1), וכתוצאה מכך לקרע של קרום הביצית ולהזרקה הדרגתית של הזרע העגול לתוך הציטופלסמה של הביצית.
  8. משכו את מחט ההזרקה ושאפו כמות קטנה מקרום הביצית ליד הפתח כדי לאטום אותה. שלב זה הוא קריטי, שכן אי אטימה תגרום לדליפה ציטופלזמית ולמוות של ביציות.
    הערה: ראוי לציין כי ROSI נדרש AOA לפני או אחרי הזרקת זרעונים עגולים, אשר דנו בסעיפים הבאים.

5. הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI)

  1. בצע את אותם צעדים עבור ICSI כמו עבור ROSI, כאשר ההבדל היחיד הוא קוטר מחט ההזרקה ICSI, אשר מודד 9-10 מיקרומטר.
  2. הניחו זרעונים על מסלול PVP כדי להפחית את מהירות השחייה שלהם ולהקל על שאיבת הזרע.
  3. בצע הפרדה של ראש זרע וזנב עבור ICSI. שאפו את הזרעונים מהזנב ומקמו את צוואר הזרע בדיוק בפה של מחט ההזרקה. מרחו פייזו (ניתן להשתמש בפיזו מרובים לפי הצורך, עוצמה = 5 ומהירות = 15) כדי להפריד את הראש והזנב של הזרעונים.

6. הפעלת ביציות בסיוע (AOA)

  1. על פי הפרוטוקול, הכינו מדיום CZB ללא סידן ומגנזיום.
  2. השתמש סטרונציום כלוריד hexahydrate (SrCl26H2O), עם משקל מולקולרי של 266.62, בריכוז של 10 mM. כדי להכין אותו, להמיס 0.26662 גרם של SrCl26H2O ב 1 מ"ל של מים עובריים. בזמן השימוש, יש להוסיף 10 μL של תמיסת אחסון מרוכזת ל-990 μL של מדיום CZB נטול Ca2+ ולהשתמש מיד.
  3. מניחים את הביציות בתווך CZB נטול Ca2+ המכיל SrCl26H2O להפעלה; לכל טיפה יש נפח של 20 μL, ובכל פעם מניחים 20 ביציות. דוגרים במשך 20 דקות.
  4. במקביל, להקים קבוצה להפעלת parthenogenesis ללא הזרקת זרעונים עגולים או זרעונים. יש לציין כי קבוצת ההפעלה parthenogenesis מוצג ללא ניתוח סטטיסטי, וקבוצת הביקורת היא ICSI.

7. החזרת עוברים

  1. אכלסו את העכברים הזכרים והנקבות של ICR ביחס של 1:2. למחרת בבוקר, בדקו את נקבות העכברים לנוכחות פקק נרתיקי ובחרו את אלה עם פקק נרתיקי להשתלה.
  2. להזריק את העוברים המועברים המורכבים מעוברים של 2 תאים בבוקר הקודם ולהחזיר אותם למחרת אחר הצהריים.
  3. בצעו חתך בגבה של נקבת העכבר, חשפו את השומן הלבן ואת השחלות, ואתרו את החלק המוגדל של החצוצרה תחת מיקרוסקופ זקוף (פי 10).
  4. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי ליצור פתח בחלק המוגדל של החצוצרה ולשאוף את העוברים דרך פיפטה אוראלית. בעדינות להציג את העוברים לכיוון הרחם. תפר את הפצע, באמצעות 4 x 10 מודלים של מחטים מעוקלות עם חוט, עם עובי של 5-0 (0.09-0.11 מ"מ). התפר נעשה בשתי שכבות, עם שכבה אחת עבור הצפק ושכבה אחת עבור העור החיצוני.
  5. עבור עכברים פונדקאיים, לבצע ניתוחים קיסריים על בסיס לוח הזמנים של הניסוי. הרדימו את העכברים בשיטת פריקת צוואר הרחם, חיטאו באלכוהול ופתחו את חלל הבטן. בעדינות ובמהירות לפתוח את הרחם ולפתוח את חלל מי השפיר כדי להראות את העובר ואת השליה. הסר את חבל הטבור וחתך מהצד הקרוב לעובר; העובר ניזון מאותה תקופה של עכברים מניקים.
    הערה: בשל הצורך לחשב את שיעורי הילודה, ניתוח קיסרי מדויק יותר לגבי כושר הייצור. בלידה טבעית, הצאצאים עלולים להיאכל על ידי האם, וכתוצאה מכך נתונים סטטיסטיים לא מדויקים. הניתוח הקיסרי מבוצע בעכברים פונדקאים שהושתלו בשלב מוקדם, וניתוח קיסרי המתת חסד מבוצע לפני הלידה.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש ב- GraphPad Prism 5 כדי לנתח. הנתונים מבוטאים בממוצע ± SD; P < 0.05 מציין הבדל סטטיסטי, ו-P < 0.01 מציין הבדל סטטיסטי משמעותי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחלנו את החקירה שלנו על ידי בחינת ההשפעה של AOAעל היכולת ההתפתחותית של עוברים. המחשה סכמטית של תכנון הניסוי מוצגת באיור 1A. לפני הזרקת הזרע, הביציות עברו AOA (A-ICSI) או נותרו ללא טיפול (ICSI). נתונים מפורטים על התפתחות העובר מוצגים בטבלה 1. התוצאות לא הראו הבדלים משמעותיים בשיעורי המחשוף, הבלסטוציסט או הילודה בין קבוצות A-ICSI ו- ICSI (P > 0.05; איור 1B). ממצאים אלה מצביעים על כך ש- AOA באמצעות 10 mM SrCl2 במשך 20 דקות לא השפיע על הפוטנציאל ההתפתחותי של העוברים.

בעבר דווח כי לא היו הבדלים ניכרים ביעילות ההתפתחותית של עוברי ROSI שנבחרו על ידי FACS או על ידי בדיקה חזותית ישירה תחת מיקרוסקופ22. הניסויים שלנו השתמשו בטכנולוגיית FACS כדי לזהות RS (איורים 2A,B). מתחת למיקרוסקופ, תאי זרע עגולים של עכברים היו בקוטר של כ-10 מיקרומטר והציגו מבנה גרעין דמוי בליטה באמצע (איור 2C). אנו מניחים כי ברירה באמצעות FACS מדויקת יותר מאשר בדיקה חזותית ישירה תחת מיקרוסקופ. בנוסף, הספרות תומכת בחקירה ישירה של RS באמצעות הבדלים מורפולוגיים. עוברי ROSI נוצרו בשתי שיטות שונות: קבוצת A-ROSI, שבה הביציות היו נתונות ל- AOA לפני הזרקת הזרע העגולה, וקבוצת ROSI-A, שבה הביציות היו נתונות ל- AOA לאחר הזרקת הזרע העגולה. התרשים הסכמטי של תכנון הניסוי מוצג באיור 1C. יש לציין כי לא נמצאו הבדלים משמעותיים בשיעורי המחשוף והבלסטוציסט בין קבוצות A-ROSI, ROSI-A ו-ICSI (P > 0.05; איור 1D). שיעורי הבלסטוציסטים של קבוצות A-ROSI, ROSI-A ו- ICSI היו גבוהים משמעותית מאלה של קבוצת ההפעלה (P < 0.05; איור 1D). עם זאת, שיעור הילודה של קבוצת ROSI היה נמוך מזה של קבוצת ICSI, ללא קשר אם הביציות הופעלו לפני או אחרי ההזרקה (P < 0.05; איור 1D). חשוב לציין ששיעור הילודה של קבוצת A-ROSI היה מעט גבוה יותר מזה של קבוצת ROSI-A (איור 1D). פרטים נוספים על נתוני התפתחות העובר מוצגים בטבלה 1.

figure-results-1
איור 1: עוברי ROSI הציגו יעילות התפתחותית נמוכה יותר בהשוואה לעוברי ICSI. (A) המחשה סכמטית של פרוטוקול הניסוי להערכת השפעת ההפעלה על התפתחות עוברית ICSI. כחול = הביציות לא הופעלו; צהוב = הביציות הופעלו. (B) יעילות התפתחותית של עוברים שמקורם ב-A-ICSI וב-ICSI. (C) המחשה סכמטית של פרוטוקול הניסוי ליצירת סוגים שונים של עוברים. (D) יעילות התפתחותית של עוברים שמקורם ב-A-ROSI, ROSI-A, A ו-ICSI. **, P < 0.01. קיצורים: A = הפעלה E = יום עוברי; ROSI = הזרקת זרע עגולה; ICSI = הזרקת זרע תוך ציטופלזמית. קווי השגיאה מציגים סטיית תקן. השוואת התעריפים מתבצעת באמצעות מבחן chi-square. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: זרעונים עגולים נבחרו באמצעות מיון ציטומטרי של זרימה. (A) נעשה שימוש בדיאגרמת מיון ציטומטרית של זרימה לבחירת זרעונים עגולים. (B) תמונות מייצגות המציגות את בחירת הזרעונים העגולים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. קיצורים: FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צד; 355 הוא אורך גל העירור; 460/50 ו- 670/30 הם שני ערוצי גילוי תחת לייזר באורך גל 355. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קבוצותפיתוח טרום השרשההתפתחות לאחר ההשתלה
עותקים משוכפליםשיעור המחשוף (%)שיעור בלסטוציסט (%)עוברים בני 2 תאים שהוחזרו/ לא. של נמעניםשיעור הילודה (%)
A-ICSI599.33 (149/150)75.17 (112/149)49/548.98 (24/49)
א-רוסי599.33 (149/150)73.83 (110/149)44/518.18 (8/44) **
ROSI-A598.00 (147/150)64.63 (95/147)45/513.33 (6/45) **
ההפעלה5100.00 (150/150)12.00 (18/150) **51/50.00 (0/51) **
ICSI598.00 (147/150)73.47 (108/147)46/552.17 (24/46)

טבלה 1. היעילות ההתפתחותית של עוברים הנגזרת מקבוצות שונות.

טבלה משלימה 1. שיעור אוכלוסיות התאים השונות ממוינות לפי ציטומטריית זרימה. חלק P3 הוא זרעונים עגולים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפעלת ביציות בסיוע
תנאי מוקדם קריטי עבור ROSI הוא AOA מכיוון שזרעונים עגולים לבדם אינם יכולים ליזום הפעלת ביציות. כיום, השיטה המבוססת ביותר בעכברים כוללת שימוש בסטרונציום כלוריד23,24, בעוד היישום האנושי המתקדם ביותר משתמש בהפעלה חשמלית13,14. גם לעיתוי הפעלת הביציות יש משמעות רבה. כפי שדווח בספרות, גישת ההפעלה האופטימלית ביותר בעכברים כוללת תחילה הפעלה של הביצית ולאחר מכן הזרקת זרע עגול25. זאת בניגוד לתהליך ההפריה הקונבנציונלי, שבו הזרע נכנס תחילה לביציות, ולאחר מכן משחרר פוספוליפאז C ζ כדי להפעיל את הביצית26. מחקר מיוחד שנערך על ידי סאטושי קישיגאמי ועמיתיו מדגיש את היכולת הדיפרנציאלית של ROSI ליצור גרעין זכר בביציות לפני או אחרי הפעלה. כדי להשיג קצב ייצור יעיל של צאצאים, שני סוגי ההזרקות חייבים להתבצע לפני שהביציות נכנסות לשלבG1 25.

קוטר מחט ההזרקה
בהקשר של ROSI, חשוב לציין כי קוטר גדול יותר של מחט ההזרקה לא בהכרח מתורגם לתוצאות טובות יותר. מחט ההזרקה המשמשת היא בעלת קוטר של 6-7 מיקרומטר, מעט קטנה יותר מזרע עגול. לכן, כאשר שואפים זרע עגול, קרום התא נתון לאפקט סחיטה, מה שעלול להוביל לחשיפה ישירה של הגרעין. חשיפה ישירה זו עשויה לתרום לדה-פולימריזציה ולהיווצרות הגרעין הגברי27.

טיפול איטום
ביציות עכבר מציגות פחות צמיגות ציטופלזמית בהשוואה למינים אחרים. אפילו פרצה קטנה בקרום התא יכולה לגרום לציטופלסמה לזרום החוצה בקלות, וכתוצאה מכך ניוון ביציות28. כדי להפחית את הסיכון, לאחר הזרקת הזרע העגול לציטופלסמה של הביצית ומשיכת מחט ההזרקה, חובה לשאוף חלק קטן מקרום התא בסמוך לפתח קרום תא הביצית כדי לאטום את החלל, בדומה להליך ב- ICSI21. תהליך איטום זה מפחית משמעותית את הסיכון לניוון ביציות.

יישום ROSI כמודל
מעבר ליישומים קליניים, לטכנולוגיית ROSI יש יישומים שונים נוספים כמודל. הוא יכול לזרז את יצירת העכברים פי29, להציל קטלניות נשית הנובעת ממחיקת Xist תורשתי אבהי בעכברים17, ליצור עכברים לאחר הזרקת זרע עגולה לבלסטומרים דו-תאיים פרתנוגנטיים הפלואידיים15, ליצור צאצאי עכבר טרנסגניים16, ולשמר פוריות אצל ילדים מתבגרים לפני טיפול בסרטן30,31. מחקר חרוץ על ROSI עכבר יכול לתרום באופן משמעותי להתקדמות במחקר בריאות הרבייה.

מגבלות המאמר
מאמר זה משמש כמדריך מתודולוגי בעל מספר מגבלות, ביניהן היעדר בחירה השוואתית ישירה של RS תחת מיקרוסקופ להזרקה וחוסר חדשנות נתפס.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים כספיים או אחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לוונג'יה ג'או על עזרתה רבת הערך במיון זרעונים עגולים באמצעות ציטומטריית זרימה ולפאנג וואנג על מומחיותה בהחזרת עוברי עכבר. עבודה זו קיבלה תמיכה חלקית מהקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ילין (No. YDZJ202301ZYTS461). אנו מודים ל-Bullet Edits Limited על העריכה הלשונית וההגהה של כתב היד.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl22H2O סיגמאC7902 הכנת CZB
גלוקוז סיגמאG6152 הכנת CZB
HEPES-Na (בסיסי) סיגמאH3784 הכנת CZB
Hoechst 33342Beyotime C1025FACS
גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG)חברת ההורמון השני של נינגבוHCGתרופות מקדמות ביוץ
HyaluronidaseSigmaH3506הסרת תאי גרנולוזה סביב הביצית
KCl SigmaP5405הכנת CZB
KH2PO4 סיגמאP5655 הכנת CZB
KSOMaaCaisson LabsIVL04-100MLאשלגן סימפלקס מדיום אופטימלי בתוספת חומצות אמינו
L-גלוטמין  סיגמאG8540 הכנת CZB
M2SigmaM7167-50MLנוזל הפעלה
MgSO47H2O סיגמאM1880 הכנת CZB
Na2-EDTA2H2O סיגמאE5134 הכנת CZB
NaCl SigmaS5886הכנת CZB
NaHCO3SigmaS5761 הכנת CZB
סירופ Na-lactate 60% d = 1.32 גרם/ליטרSigmaL7900 הכנת CZB
דגם סיגמאP4562 הכנת CZB
טיפים למקדחת פייזו (ICSI) אפנדורף piezoXpertקרע בקרום פיזואלקטרי
בסרום סוסה בהריון גונדוטרופין (PMSG)חברת ההורמון השני של נינגבוPMSGתרופות מקדמות ביוץ
PVA סיגמאP8136הכנת CZB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Redgrove, K. A., McLaughlin, E. A. The role of the immune response in Chlamydia trachomatis infection of the male genital tract: A double-edged sword. Front Immunol. 5, 534(2014).
  2. Yanagimachi, R. Intracytoplasmic injection of spermatozoa and spermatogenic cells: Its biology and applications in humans and animals. Reprod Biomed Online. 10 (2), 247-288 (2005).
  3. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  4. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development. 121 (8), 2397-2405 (1995).
  5. Tesarik, J., et al. Spermatid injection into human oocytes. II. Clinical application in the treatment of infertility due to non-obstructive azoospermia. Human Reprod. 11 (4), 780-783 (1996).
  6. Tesarik, J., Mendoza, C. Spermatid injection into human oocytes. I. Laboratory techniques and special features of zygote development. Human Reprod. 11 (4), 772-779 (1996).
  7. Hirabayashi, M., et al. Activation regimens for full-term development of rabbit oocytes injected with round spermatids. Mol Reprod Dev. 76 (6), 573-579 (2009).
  8. Ogonuki, N., et al. Birth of a marmoset following injection of elongated spermatid from a prepubertal male. Mol Reprod Dev. 86 (8), 928-930 (2019).
  9. Niederberger, C., et al. Forty years of IVF. Fertil Steril. 110 (2), 185(2018).
  10. Gross, K. X., Hanson, B. M., Hotaling, J. M. Round spermatid injection. Urol Clin North Am. 47 (2), 175-183 (2020).
  11. Hanson, B. M., et al. Round spermatid injection into human oocytes: a systematic review and meta-analysis. Asian J Androl. 23 (4), 363-369 (2021).
  12. Tekayev, M., Vuruskan, A. K. Clinical values and advances in round spermatid injection (ROSI). Reprod Biol. 21 (3), 100530(2021).
  13. Tanaka, A., et al. Fourteen babies born after round spermatid injection into human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14629-14634 (2015).
  14. Tanaka, A., et al. Ninety babies born after round spermatid injection into oocytes: survey of their development from fertilization to 2 years of age. Fertil Steril. 110 (3), 443-451 (2018).
  15. Yang, H., Shi, L., Chen, C. D., Li, J. Mice generated after round spermatid injection into haploid two-cell blastomeres. Cell Res. 21 (5), 854-858 (2011).
  16. Moreira, P., et al. Transgenic mouse offspring generated by ROSI. J Reprod Dev. 62 (1), 37-42 (2016).
  17. Federici, F., et al. Round spermatid injection rescues female lethality of a paternally inherited Xist deletion in mouse. PLoS Genet. 12 (10), e1006358(2016).
  18. Sakamoto, M., et al. Paternally inherited H3K27me3 affects chromatin accessibility in mouse embryos produced by round spermatid injection. Development. 149 (18), 200696(2022).
  19. Wang, J., et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the reprogramming defects in embryos generated by round spermatid injection. Sci Adv. 8, (2022).
  20. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (1), (2018).
  21. Yoshida, N., Perry, A. C. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  22. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2013).
  23. Kong, P., et al. Effects of the histone deacetylase inhibitor 'Scriptaid' on the developmental competence of mouse embryos generated through round spermatid injection. Hum Reprod. 32 (1), 76-87 (2017).
  24. Hosseini, S., Salehi, M. Tricostatin A-treated round spermatid enhances preimplantation embryo developmental competency following round spermatid injection in mice. Zygote. 30 (3), 373-379 (2022).
  25. Kishigami, S., Wakayama, S., Nguyen, V. T., Wakayama, T. Similar time restriction for intracytoplasmic sperm injection and round spermatid injection into activated oocytes for efficient offspring production. Biol Reprod. 70 (6), 1863-1869 (2004).
  26. Tao, Y. Oocyte activation during round spermatid injection: state of the art. Reprod Biomed Online. 45 (2), 211-218 (2022).
  27. Ogura, A., Ogonuki, N., Miki, H., Inoue, K. Microinsemination and nuclear transfer using male germ cells. Int Rev Cytol. 246, 189-229 (2005).
  28. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod. 52 (4), 709-720 (1995).
  29. Ogonuki, N., et al. A high-speed congenic strategy using first-wave male germ cells. PLoS One. 4 (3), e4943(2009).
  30. Abdelaal, O., et al. Fertility preservation for pediatric male cancer patients: illustrating contemporary and future options; a case report. Transl Androl Urol. 10 (1), 520-526 (2021).
  31. Eyni, H., et al. Advanced bioengineering of male germ stem cells to preserve fertility. J Tissue Eng. 12, (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Round Spermatid InjectionMouse ROSIOocyte ActivationIntracytoplasmic Sperm InjectionEmbryonic DevelopmentFlow CytometrySpermatid IsolationOocyte MicroinjectionAssisted ReproductionGenetically Modified Mice

Related Articles