הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

3.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65906

⸱

26 בינואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

במאמר זה

סיכום

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

תקציר

בקטריופאג'ים (פאג'ים) הם וירוסים שמדביקים חיידקים ברמת המינים והזנים, והם הישויות הביולוגיות הנפוצות ביותר בכל המערכות האקולוגיות הידועות. בתוך קהילות חיידקים, כמו אלה שנמצאות במיקרוביוטה של המעיים, פאגים מעורבים בוויסות הדינמיקה של אוכלוסיית המיקרוביוטה ובהנעת אבולוציה חיידקית. בעשור האחרון התעורר עניין מחודש במחקר פאגים, בין השאר הודות ליכולות ההרג הספציפיות לפונדקאי של פאגים ליטיים, המציעים כלי מבטיח נגד האיום הגובר של חיידקים עמידים מיקרוביאלית. יתר על כן, מחקרים אחרונים המוכיחים כי פאגים נצמדים לליחה במעי מצביעים על כך שייתכן שיש להם תפקיד מגן במניעת פלישת חיידקים לאפיתל הבסיסי. חשוב לציין, שבדומה למיקרוביום חיידקי, פגיאומים משובשים נקשרו להחמרה בתוצאות במחלות כמו מחלות מעי דלקתיות. מחקרים קודמים הראו כי פאגים יכולים לווסת את המיקרוביום של בעלי חיים ובני אדם באמצעות השתלות תסנין צואה, מה שיועיל לבריאות הפונדקאי. עם גל המחקר האחרון מגיע הצורך לבסס ולתקנן פרוטוקולים לחקר פאגים בהקשר של מיקרוביום המעי. פרוטוקול זה מספק סדרה של נהלים לחקר פאגים מבודדים מסוג T4 והפונדקאי החיידקי שלהם, Escherichia coli, בהקשר של מערכת העיכול של מורין. השיטות המתוארות כאן מתארות כיצד להתחיל מליזט פאגים, לתת אותו לעכברים ולהעריך את ההשפעות על רמות החיידקים המארח והפאגים. פרוטוקול זה יכול להשתנות ולהיות מיושם על זוגות פאג'ים-חיידקים אחרים, והוא מספק נקודת מוצא לחקר הדינמיקה של פונדקאי-פאג'ים in vivo.

מבוא

בקטריופאג'ים, או פאגים, הם וירוסים שמדביקים והורגים חיידקים עם מינים וספציפיות ברמת הזן1. פאגים ממלאים תפקידים חשובים בקהילות חיידקים מורכבות כמו מיקרוביוטת המעיים, שם הם היו מעורבים בוויסות דינמיקת האוכלוסייה ובהנעת כושר חיידקי2. במהלך העשור האחרון, התעורר עניין מחודש במחקר פאגים עקב עלייתם של פתוגנים עמידים אנטי-מיקרוביאליים3, והפוטנציאל לטיפול בפאגים כאסטרטגיית טיפול אלטרנטיבית. בשנים האחרונות נעשה שימוש בקוקטיילים של פאגים ליטיים דרך הווריד בהצלחה מסוימת בזיהומים ספטיים חיידקיים חמורים ועמידים לאנטיביוטיקה בבני אדם 3,4. טיפול בפאגים דרך הפה הוצע גם כחלופה פוטנציאלית לאנטיביוטיקה לטיפול בדלקות מעיים ודלקות. יתר על כן, פאגים היו מעורבים בהצלחה של השתלות תסנין צואה (FFT), שהם תכשירי מיקרוביוטה צואתיים שסוננו לסילוק חיידקים, בטיפול בזיהום חוזר של Clostridioides difficile (rCDI)5,6, הפרעות מעי דלקתיות (IBD)7,8 ודלקת מעיים נמקית בפגים9. בהתחשב בתוצאות אלה, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציות הן בין פאגים ומיקרוביוטת המעיים, והן בין פאגים לבין פונדקאי היונקים, שכן להוספת פאגים חדשים לקהילה קיימת עשויות להיות השפעות עקיפות על הקהילה כולה, ולא רק על חיידקי המטרה שלה 2,10.

המחקר של אינטראקציות פאגים עם חיידקי המטרה שלהם במבחנה הוכח כיעיל להבנת המנגנונים וההשפעות של אינטראקציות פאגים וחיידקים במעיים. במסגרת זו, הוכח כי פאגים T4 ספציפיים ל- Escherichia coli מסדר Caudovirales דורשים תחומים דמויי אימונוגלובולין (Ig) הממוקמים בתוך חלבוני קפסיד חיצוני אנטיגני מאוד (Hoc) על פני השטח של הנגיפים כדי להיצמד לליחה במעי11. בנוסף, מבחני טרנסוול הראו כי פאגים מסוג T4 מסוגלים לקיים אינטראקציה עם תרביות תאי אפיתל ולבצע טרנסלוקציה דרך שכבות התא על ידי מקרופינוציטוזה12,13. תוצאות אלה תומכות בהשערה שפאגים יכולים לתקשר עם הפונדקאי המטזואני שלהם, אף על פי שהם אינם מסוגלים להדביק תאים איקריוטים. מודלים אלה, למרות שהם שימושיים, חסרים את כל טווח האינטראקציות המורכבות המתרחשות במערכת האקולוגית של המעיים הדרושות לחקירה מקיפה של האינטראקציה המשולשת בין פאגים, חיידקים והפונדקאי המטזואני.

מודלים של עכברים הם כלי חשוב לחקר פאגים בסביבות מורכבות. יישום רצוי של מתן פאגים הוא כאסטרטגיה חלופית לטיפול בזיהומים עמידים מיקרוביאליים או פתוביונטים הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות, כולל IBD. עם זאת, ספרות חדשה מציעה כי התנהגות פאגים במבחנה אינה מייצגת באופן מלא פונקציות in vivo. Buttimer et al.14 הראו כי קוקטייל פאגים היה מסוגל לרוקן את חיידקי המטרה בקונסורציום מיקרוביוטה אנושית פשוטה במבחנה, אך לא ניתן היה לשכפל אותו in vivo בעכברים גנוטוביוטיים שהתיישבו באותו קונסורציום חיידקים-פאגים. יתר על כן, במיקרוביום עכבר קונבנציונלי, פאג T7 הוביל לדלדול סלקטיבי של חיידקי המעיים שלו, אם כי נצפתה התאוששות הדרגתית לאורך זמן, המעידה על עמידות מפותחת15. מחקרים אחרים הוכיחו דו-קיום של פאגים הניתנים דרך הפה וזני חיידקי המטרה שלהם in vivo 2,16. ואכן, מעבר לדו-קיום של פאגים/חיידקים, מתן פאגים הוביל לשינויים נרחבים בהרכב ובתפקוד הכולל של קהילת המיקרוביוטה 2,16. זה רלוונטי במצבי מחלה, שכן מספר מחקרים מצאו קשרים בין שפע יחסי מוגבר של Caudovirales ו- IBD 7,8,17 שהיו בלתי תלויים בשינויים בשפע חיידקים7. עדיין לא ידוע אם זהו מניע או תוצאה של פתוגנזה של המחלה.

המוקד ההיסטורי של חקר הפאגים היה סביב הקשר בין פאג לבין חיידק המטרה שלו. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון אינטראקציות אפשריות בין פאגים לבין הרירית, האפיתל ומערכת החיסון של הפונדקאי המטזואני. כל האינטראקציות האלה ממלאות תפקיד חשוב בתגובה הכוללת לזיהום פאגים במעי. כדי להדגים זאת, פאגים נחקרו באמצעות עכברים נטולי חיידקים (GF) כדי להבהיר את השפעתם על מערכת החיסון ללא הפרעה של המיקרוביוטה8. במערכת זו, חומצות גרעין פאגים זוהו על ידי קולטנים דמויי טול (TLR) הממוקמים בתוך אנדוזומים של תאי חיסון פגוציטיים (מקרופאגים ותאים דנדריטיים). זה הפעיל איתות במורד הזרם ועורר ייצור תלוי תאי T של אינטרפרון (IFN)-γ8 או סוג I IFNs18. יתר על כן, Fluckiger et al.19 עירבו תאי זיכרון CD8+ T בזיהוי אנטיגנים מקודדי פאגים (פרופאג'ים), מה שהביא לתגובתיות צולבת של תאי T עם אנטיגנים סרטניים, וכתוצאה מכך נטל הגידול מופחת. לבסוף, ייצור נוגדנים ספציפיים לפאגים תועד במחקרי עכברים שבהם פאגים הועברו למודלים של בעלי חיים באופן מתמשך באמצעות מי שתייה 8,20, או על ידי גאגים פומיים חוזרים ונשנים במשך מספר חודשים20, מה שמדגים את יכולתם של חלבוני פאגים לקדם תגובות חיסוניות הומורליות. אף על פי ששיטות אלה של חיסון פאגים מאפשרות הכנה אופטימלית ומתמשכת של מערכת החיסון, ייתכן שהן אינן מייצגות את האינטראקציות הטבעיות בין פאגים לסביבת המעי, וגם לא את הקינטיקה של טיפול בפאגים המיושמים דרך הפה. עד כה, מספר מצומצם של מחקרים בחנו את יחסי הגומלין של פאגים עם מין חיידק יחיד במודלים של עכברים חד-מושבתיים21. עם זאת, עכברים חד-מושבתיים הוכיחו את עצמם כקריטיים בפענוח השפעות ספציפיות של חיידקים של מינים בודדים על מערכת העיכול (GI) ועל התפתחות מערכת החיסון 22,23,24, והם עדיין עשויים להיות שימושיים בהבנת אינטראקציות משולשות בין פאגים, חיידקי המטרה שלהם והפונדקאי המטזואני.

באופן מלהיב, יש עדיין הרבה מה ללמוד על יחסי הגומלין בין פאגים במעיים לבין חיידקי מעיים, כמו גם על יחסי הגומלין המתרחשים בין המאכסן המטזואני לבין הפאגים השוכנים בתוכו. פרוטוקול זה מספק סדרה של הליכים לחקר פאג T4 מבודד ומקבילו החיידקי, E. coli (K-12, BW25113), באמצעות מודל עכבר גנוטוביוטי. נהלים סטנדרטיים אלה מספקים גם בסיס לאופטימיזציה של דיאדות פאגים/חיידקים אחרות על ידי התאמת פרמטרי הגידול לזוגות המעניינים. השיטות המתוארות כאן מתארות: (1) הכנת פאגים מסוג T4 וליזאטים של כלי רכב לגידול אוראלי של עכברים; (2) מתן פומי של פאג T4 לעכברים גנוטוביוטיים חד-מושבתיים מסוג E. coli ; (3) ניטור רמות הפאגים מסוג T4 בצואת עכברים וברקמות לאורך זמן.

עבור התוצאות המייצגות שהוצגו כאן, ליזטים מטוהרים של פאגים מסוג T4 הופצו ממניות בנק פאגים שהוחזקו על ידי מעבדת רוהוור. שיטת פאג-און-ברז להפצת פאג T4 הותאמה25, כפי שמוזכר בפרוטוקול זה. השיטה מניבה מלאי פאגים גבוה ואנדוטוקסין נמוך תוך שלושה ימים. באמצעות גישה זו, 10 מ"ל של ≥ 1010 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/מ"ל של פאג T4 עם < 0.5 יחידות אנדוטוקסין (EU)/מ"ל נאספו באופן שגרתי. רמות האנדוטוקסין המומלצות למתן פומי או תוך ורידי בעכברים הן ≤ 20 EU/מ"ל ו-≤ 5 EU/kg/h (או 0.1 EU מנוהל מעל שעה אחת עבור עכבר במשקל 20 גרם), בהתאמה, מה שהופך זאת לשיטה מתאימה להכנת פאגים לחיסון in vivo . כל מלאי הפאגים אוחסן בטמפרטורה של 4°C במאגר פאגים של מגנזיום מלוחים (SM) (מתכון סופק בשלב 1.1.5.1). E. coli טופח במדיה LB. עבור זוגות שונים של חיידקי פאג'ים, ניתן להתאים מצעי תרבית ותנאי גדילה מגוונים מפרוטוקול זה. פאגים יכולים גם להיות מופקים מהסביבה, כגון שפכים, מים ימיים, קרקע ותכולת מעיים, וניתן לבודד ולטהר אותם לפי סמברוק וראסל26 לפני ההכנה תוך שימוש בתנאי הגידול והריבוי המתאימים לכל זוג פאגים-פונדקאים25 . לחלופין, ניתן לקבל פאגים ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) או מבנקי פאגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של UBC והפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית (A23-0113, B19-0038). עכברים שוכנו באוניברסיטת קולומביה הבריטית בתנאים נטולי פתוגנים במרכז למידול מחלות. עכברי C57BL/6 גודלו בתוך המתקן במבודד סרט גמיש סטרילי, שסופק עם תזונת עכברים סטרילית, מים, מצעים וחומר קינון. העכברים הוחזקו במחזור יום / לילה של 12 שעות. עכברי ניסוי, הן זכר והן נקבה, היו תואמי גיל בכל ניסוי, בטווח של 6 עד 12 שבועות ובמשקל של 15-30 גרם עבור כל הניסויים.

1. הכנת פאגים וליזאטים לרכב לפליטה אוראלית לעכברים

  1. טיהור פאגים ויצירת מלאי
    הערה: במחקר זה, פאגים מסוג T4 גדלים ומעובדים על ידי ציפוי על מדשאה של חיידקים בשיטת שכבת אגר יחידה, המתוארת להלן. שיטת שכבת האגר הכפולה תוארה בעבר25,27וניתן להשתמש בו גם ביעילות דומה. שיטת שכבת אגר יחידה נבחרה עבור פרוטוקול זה מכיוון שהיא מספקת נראות פלאק משופרת28.
    1. לגדל E. coli ב 5 מ"ל של מדיה LB סטרילית פוליסטירן סטרילי או צינורות תרבית זכוכית (עם כובעים). דוגרים על צינורות ב-37°C עם רעידות ב-200 סל"ד למשך הלילה, עד שמגיעים לשלב נייח.
    2. הכינו אגר רך בבקבוק מדיה מזכוכית על ידי כריתה אוטומטית של LB עם אגר 0.5% וקירור לטמפרטורה של 50°C ומטה (תוך השארת נוזל) לפני התוסף. הכינו מספיק אגר רך עבור 15 מ"ל לצלחת.
    3. יש להוסיף אגר רך עם MgSO4 ו-CaCl2 לריכוז סופי של 1 מ"מ לכל אחד. הוסף 100 μL של תרבית E. coli לילה עבור כל 3 מ"ל של אגר רך. ערבבו בעדינות בעזרת מוט ערבוב מגנטי כדי ליצור הומוגניות בין התוספים והתרבית באגר הרך.
      הערה: עקביות בנפח ובצפיפות של E. coli המתווסף להכנת אגר רך היא קריטית (מתואר בסעיף התוצאות המייצגות).
    4. מוסיפים 15 מ"ל אגר רך + אי קולי לכל צלחת פטרי (קוטר 15 ס"מ) באמצעות פיפטה סרולוגית. הניחו לצלחות להתייצב בטמפרטורת החדר לשימוש באותו יום.
      הערה: הצלחות ישקעו תוך כ-20 דקות עם מכסים פתוחים. האגר יישאר רך אך לא יזוז כאשר הצלחות הפוכות.
    5. הכינו 8-10 דילולים סדרתיים של פאג המקור T4 בפקטורים של 10 על ידי דילול במאגר SM. נקודה 5 μL של כל דילול על לוחות. אפשרו לכתמים להתייבש, להפוך ולדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
      1. להכנת חיץ פאגים של מגנזיום מלח (SM), ב-1 ליטר של H2O שעבר דה-יוניזציה, יש להמיס 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4·7H2O ו-50 mM Tris-HCl (pH 7.4). Autoclave ולאחסן בטמפרטורת החדר.
        הערה: למחרת, E. coli היה צריך לגדול לתוך דשא ברחבי LB אגר רך. פלאקים, או אזורי צמיחה מנוקים הנראים במדשאה של E. coli , יופיעו במקום שבו הרג פאגים של פונדקאים נגועים של E. coli . כל לוח מייצג יחידה ליצירת לוח (pfu).
    6. בחרו לוח בודד מצלחת האגר הרכה על ידי דחיפת קצה פיפטה סטרילי למרכז הלוח, ויצרו תקע אגר בקצה הקצה. השהה מחדש את תקע הפלאק לתוך 1 מ"ל של חיץ SM בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל. מערבבים את הצינור במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי לערבב.
    7. צנטריפוגה את הצינור ב 4000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כל לכלוך מן הליזט. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
    8. כדי להפיץ את הפאג המבודד, חזור על שלבים 1.1.1-1.1.3. הוסף 100 μL של הפאג המבודד לאליקוט 15 מ"ל של אגר רך המכיל E. coli בצינור חרוט. הופכים את הצינור שלוש פעמים כדי לערבב ולשפוך את האגר לתוך צלחת פטרי.
    9. הניחו לצלחות להתייבש לפני היפוך ודגירת לילה ב-37°C. הכינו פלטת בקרת דשא ללא פאגים כדי לאשר את כדאיות האי-קולי .
      הערה: לאחר דגירה של לילה, לוחית הבקרה צריכה להיות בעלת מדשאה של E.coli ואילו הצלחת המכילה פאגים צריכה להיות מונחת לחלוטין.
    10. כדי לחלץ את הפאג' מהצלחת, הוסיפו 5 מ"ל של חיץ SM לפני השטח של הצלחת שסולקה בפאגים ונערו במהירות 70 סל"ד על נדנדה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    11. אספו את החיץ מהצלחת לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את כל הפסולת מצלחת האגר.
    12. אספו את מלאי הפאגים T4 ליזט לתוך צינור חדש ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד לטיטרציה והתפשטות.
      הערה: פאגים מסוג T4 יציבים מעל 10 שנים25; עם זאת, היציבות תהיה תלויה בסוג הפאגים ובתנאי האחסון. טיטר פאגים ישתנה גם הוא עם זמן האחסון. פאגים רגישים לקיפאון. לכן, מומלץ לשמור בהקפאה בחנקן נוזלי ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מכיוון שהדבר עלול לפגוע בפאגים, מה שמפחית את טיטר הפאגים25.
    13. Titer the T4 phaage stock lysate כדי לקבוע את הריכוז ב-pfu/mL, כפי שתואר קודם לכן 25,29,30. מלאי פאגים T4 עם טיטר גבוה יכיל 108 pfu/mL או יותר.
  2. הכנת ליזטים ניסיוניים של פאגים
    1. תרבית E. coli ב 5 מ"ל של מדיה LB פוליסטירן סטרילי או צינורות תרבית זכוכית (עם כובעים). דוגרים על צינורות לילה ב-37°C עם רעידות ב-200 סל"ד, עד שמגיעים לשלב נייח.
    2. תת-תרבית את תרבית הלילה E. coli 1:50 ב 100 מ"ל LB מדיה בבקבוק חרוטי זכוכית. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם רעידות ב-200 סל"ד עד שהחיידקים מגיעים לשלב מעריכי מוקדם עד אמצע (כ-1.5 שעות).
      הערה: ניתן לבצע עקומת גדילה ראשונית כדי לקבוע את הצפיפות האופטית בטווח של 600 ננומטר (OD600) שבו תרבית החיידקים נמצאת בפאזה מעריכית. תרבית בצינור חרוטי זכוכית מוצעת מכיוון שראיות עדכניות מצאו כי פאגים מסוגלים להיצמד לפלסטיק כגון פוליפרופילן31.
    3. הוסיפו 100 μL של מלאי הפאגים T4 בעל הטיטר הגבוה משלב 1.1 לתת-תרבית E . coli ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם טלטול במשך 3 שעות, או עד שהליזט החדש כבר לא יהיה מעונן. אספו את הפאג' ליזט T4 לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל והמשיכו ישירות לשלבי הניקוי או, במידת הצורך, אחסנו בטמפרטורה של 4°C עד למחרת.
      הערה: גודל התפרצות פאגים גדול יותר (המציין מספר ממוצע גבוה יותר של נגיפים המשתחררים בכל מחזור שכפול) מחייב תקופת דגירה ארוכה יותר עבור תת-תרבית החיידקים בשלב 1.2.2. זה מספק צפיפות חיידקים מוגברת לפני זינוק עם מלאי פאגים.
    4. צנטריפוגה ליזט ב 4000 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את כל החיידקים שנותרו פסולת תאית. מסננים ומעקרים את הסופרנאטנט המתקבל באמצעות מסנן ניילון 0.22 מיקרומטר ומעבירים את התסנין לצינורות צנטריפוגות חרוטיות חדשים של 50 מ"ל.
    5. הוסף 0.1 נפחים של כלורופורם לכל נפח של ליזה פאג T4 מסונן כדי להרוג את כל החיידקים שנותרו ולמנוע צמיחת חיידקים. מערבבים לזמן קצר כדי לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
      הערה: פאגים עטופים בשומנים רגישים לכלורופורם, מה שעשוי להפחית את טיטרהפאגים 25. דלג על שלב זה במידת הצורך.
      אזהרה: כלורופורם הוא ממס אורגני רעיל המסוכן בשאיפה, בליעה או ספיגה דרך העור. יש להשתמש במכסה אדים ובציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת עבודה עם כלורופורם. השתמש זכוכית במקום פיפטות סרולוגיות פוליסטירן בעת עבודה עם כלורופורם, כפי שהוא אינו תואם את רוב הפלסטיק. כלורופורם יכול להיות ממוקם בצינורות צנטריפוגות חרוטיות פוליפרופילן עבור שלבים 1.2.5-1.2.6 אבל לא צריך להיות מאוחסן לטווח ארוך בצינורות פלסטיק.
    6. צנטריפוגה את הליזט ב 4000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את הכלורופורם מן הליזט. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר בזהירות את שכבת הליזט העליונה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל מבלי להפריע לשכבת הכלורופורם שמתחת. יש להשליך את פסולת הכלורופורם למיכל הפסולת הנוזלית המסוכנת המתאים. יש לאחסן את הליזטים בטמפרטורה של 4°C עד לריכוז ולהחלפת החיץ למחרת.
    7. רכז פאגים ליזטים במכשיר מסנן צנטריפוגלי של 100 kDa (ראה טבלת חומרים) על ידי הוספת 13 מ"ל של פאג ליזט למאגר העליון של המכשיר וצנטריפוגה במהירות של 4000 x גרם למשך 5 דקות, או עד שרוב הליזט עבר דרך המסנן לתוך המאגר התחתון.
      הערה: יש לשאוף לקבל בערך 2 מ"ל של ליזט בסוף זמן הסחיטה. ככל שריכוז הפאגים עולה במסנן בתוספת ליזט, זמני הספין צפויים לגדול. להתקני מסנן צנטריפוגלי יש עצירה פיזית מתה כדי למנוע מהם להסתובב יבש32. אין לתת לקרום המסנן להתייבש אם הכוונה להמשך השימוש (כלומר, על ידי הוצאת כל הנוזלים מהמאגר העליון). זמני הסחיטה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הפאג' והטיטר.
    8. באמצעות פיפטה P200 או P1000, פיפטה עדינה את ~ 2 מ"ל הנותרים של ליזט למעלה ולמטה בתוך המאגר העליון כדי לפתוח את סתימת קרום המסנן לאחר כל סיבוב. השליכו את התסנין מהמאגר התחתון למיכל פסולת, והשאירו את הפאגים המרוכזים במאגר העליון.
    9. חזור על שלבים 1.2.7-1.2.8 עד שכל נפח הפאג ליזט יעבור דרך התקן המסנן, כאשר ~2 מ"ל של פאגים מרוכזים נשמרים במאגר העליון לאחר כל סיבוב.
    10. פתח את קרום המסנן לאחר הסחרור האחרון על ידי פיפטציה של הליזט הנותר (~ 2 מ"ל) במאגר העליון למעלה ולמטה. שטפו את הפאג' (חילופי חיץ) על ידי הוספת 12 מ"ל של חיץ SM למאגר העליון ולצנטריפוגה במהירות 4000 x גרם למשך 10 דקות, או עד שרוב החיץ עבר דרך המסנן.
    11. השליכו את התסנין וחזרו על שלב השטיפה (שלב 1.2.10). השהה מחדש את 2 מ"ל הליזט הנותרים במאגר SM לנפח סופי של 10 מ"ל (או פחות), לאחסון לטווח ארוך. מעבירים את הליזט לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להסרת אנדוטוקסין.
      הערה: אופציונלי לקשור את הפאגים בשלב זה כדי להבטיח שהפאג ליזט היה מרוכז (> 108 pfu/mL), ולקבוע אובדן פאגים במהלך תהליך הסרת האנדוטוקסין.
    12. הסר אנדוטוקסינים מזהמים מהפאג ליזט T4 על-ידי הוספת 0.4 נפחים של 1-אוקטאנול (ראה טבלת חומרים) לנפח הכולל של ליזט.
      הערה: אנדוטוקסינים מוסרים מכיוון שהם מעוררים מאוד את מערכת החיסון, ולכן נוכחותם עלולה להוביל להשראת תגובה חיסונית מולדת בלתי תלויה בפאגים25.
      זהירות: 1-אוקטאנול הוא תרכובת ארומטית, אורגנית, דליקה עם ריח חזק ומהווה גירוי לעיניים. יש ללבוש PPE מתאים בעת עבודה עם 1-אוקטאנול. בצע את כל העבודה במכסה אדים כדי למנוע שאיפת אדים. השתמש בסרט איטום כדי למנוע דליפה של צינורות בעת עבודה מחוץ למכסה האדים.
    13. אטמו את מכסה צינור הצנטריפוגה החרוטי בסרט איטום למניעת דליפה. יש לנער ב-120 סל"ד על פלטפורמה או לנדנד שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לדגור ב-4°C במשך שעה וחצי, ללא רעידות.
    14. צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 10 דקות כדי להפריד את הליזט מנוקה אנדוטוקסין מן 1-אוקטאנול. שכבת האוקטאנול 1 תצוף על גבי הליזט. השתמש פיפטה P1000 כדי להסיר בזהירות 1-אוקטאנול ככל האפשר ולהשליך לתוך מיכל פסולת נוזלית מסוכנת/דליקה המתאים.
    15. השתמש במחט 18 G ומזרק 10 מ"ל כדי לאסוף את הפאג ליזט מתחת לשכבת 1-אוקטאנול הנותרת, תוך הקפדה לא לאסוף את שכבת 1-אוקטאנול. יש לאחסן את הליזט בטמפרטורה של 4°C עד לשאיבת אבק מהירה.
    16. העבר 1 מ"ל aliquots של T4 פאג lysate לתוך סטרילי 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. יש לשאוב במהירות עם מכסים פתוחים ב-4000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאדות שאריות 1-אוקטאנול מהליזט. יש לשאוב במהירות למשך 3 שעות או עד שנפח הפאג' ליזט יופחת ב-30%25. יש לאחסן ב-4°C עד לטיטרציה.
    17. Titer את הפאג lysate כדי לקבוע את הריכוז pfu/mL. לדלל את T4 פאג ליזט שנוצר ב SM חיץ לריכוז הרצוי re-titer כדי לאשר.
    18. כמת אנדוטוקסינים הנמצאים בפאג ליזט T4 באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). השוו את רמות האנדוטוקסין בפאג ליזט הסופי עם דגימה לפני הסרת אנדוטוקסין, בקרות רכב, חיץ ומי שתייה של עכברים.
      הערה: ערכת כימות האנדוטוקסין הכרומוגנית מושבתת על-ידי 1-אוקטאנול25. בצע שלבי ואקום מהירים כדי להסיר 1-אוקטאנול (שלב 1.2.16) לפני כימות אנדוטוקסינים. תכולת האנדוטוקסין במים מזוקקים מוערכת ב -20 האיחוד האירופי / מ"ל25; עם זאת, תכולת האנדוטוקסין במי השתייה של עכברים עשויה להשתנות בין מתקנים. אם רמות האנדוטוקסין בפאג ליזט עולות על הכמות הקיימת במי השתייה, שקול לחזור על שלבים לסילוק אנדוטוקסין (1.2.12-1.2.16).
    19. אחסנו ליזטים מרוכזים של T4 שעברו ניקוי אנדוטוקסין במאגר SM בטמפרטורה של 4°C.
  3. הכנת ליזט חיידקי נטול פאגים לבקרות רכב
    הערה: ניתן להכין ליזט חיידקי נטול פאגים ככלי לבקרה על כל השפעה הנובעת ממזהמים חיידקיים (למשל, אנדוטוקסין) הנוצרים בייצור פאג ליזט בשלב 1.2, אשר יכול להשפיע על תוצאות הניסוי כאשר מחוסנים בעכברים.
    1. מתרבית לילה של E. coli, תת-תרבית של E. coli 1:50 לתוך 100 מ"ל של מדיה LB. מבלי להוסיף פאגים, המשיכו לגדל את החיידקים תוך כדי רעידות בטמפרטורה של 37°C במשך 3 שעות, או התאמת זמן הדגירה של הפאג ליזט המיוצר בשלב 1.2.
    2. העבירו את תרבית E. coli לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ולתאי ליז באמצעות בדיקה סוניקטורית (ראו טבלת חומרים) על קרח במהירות של 30 קילוהרץ למשך 30 פולסים של שניות (3x) כדי לבצע ליזה ידנית של תאי חיידקים.
    3. בצע את שאר הפרוטוקול לפי שלב 1.2, החל משלב 1.2.4, כולל כל שלבי הניקוי, השטיפה והסרת האנדוטוקסין.
      הערה: במהלך הריכוז באמצעות התקן הסינון הצנטריפוגלי, הליזט של הרכב יזרום דרך המסנן מהר יותר מאשר הפאג ליזט, בשל היעדר פאגים. לכן, קצרו את זמני הצנטריפוגה מ-5 דקות ל-2-5 דקות כדי להבטיח שקרום האולטרה-פילטר לא יתייבש במהלך צנטריפוגה ממושכת.
    4. כווצו את הליזט של הרכב כדי לוודא שהוא אינו מכיל פאגים.
    5. השתמש בערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד את רמות האנדוטוקסין בליזט הרכב. דללו את הליזט של הרכב במאגר SM כדי להתאים לרמות האנדוטוקסין בפאג ליזט.
  4. בקרות ניסיוניות חלופיות: הכנת פאג ליזט מומת בחום
    הערה: חלופה לליזט חיידקי נטול פאגים היא פאג' ליזט מומת בחום. נטרול חום מנתק נגיפים של פאגים, בעוד שאנדוטוקסינים שיוריים כגון ליפופוליסכרידים (LPS) יציבים בחום 8,33. Gogokhia et al.8 השתמשו בשיטה זו כדי לקבוע אם נגיפי פאגים שלמים וברי קיימא דרושים להפעלה חיסונית. החוקרים מוזמנים לבחון את שתי השיטות (ללא פאגים לעומת מומתים בחום) ולקבוע איזו בקרה מתאימה ביותר לצרכי הניסוי שלהם. לא משנה מה נבחר, חשוב להכיר בכך שבקרת חיץ אינה צפויה להיות מתאימה בשל המניפולציה המשמעותית הנדרשת כדי לרכז ולנקות מלאי פאגים.
    1. העבר את הנפח הדרוש של פאג ליזט T4 מנוקה, מטוהר ומדולל משלב 1.2 (100 מיקרוליטר לעכבר) לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים המצוידים במנעולי מכסה.
    2. מחממים ליזטים על בלוק חום ב 95 ° C במשך 15 דקות16.
    3. אופציונלי: אם נדרשת הסרה של פאגים/חומצות גרעין חיידקיות, בצע טיפול DNase I ו-RNase A לפי Jakočiūnė ו-Moodley34. על רגל אחת:
      1. הוסף 50 μL DNase I 10x buffer, 1μL DNase I (1 U/μL) ו- 1 μL RNase A (10 mg/mL) (ראה טבלת חומרים) ל- 450 μL של פאג ליזט מומת בחום.
      2. לדגור על ליזטים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה וחצי בבלוק חום, ללא רעידות.
      3. נטרל את DNase I ו- RNase A על ידי הוספת 20 μL 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)34.
    4. החזיקו ליזטים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להתקרר ושלבו ליזטים אם משתמשים במספר צינורות. יש לאחסן ב-4°C עד לטיטרציה.
    5. בצעו טיטר פאגים כדי לוודא שאין פאג T4 בר קיימא בליזט. יש לאחסן ליזטים מומתים בחום בטמפרטורה של 4°C.
    6. השתמש בערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד את רמות האנדוטוקסין בליזט המומת בחום. דללו את הליזט המומת בחום במאגר SM בהתאם לרמות האנדוטוקסין הקיימות בפאג ליזט התואם.

2. מתן וניטור של פאג T4 בעכברי E. coli חד-מושבתיים

  1. מונוקולוניזציה של עכברים עם E. coli
    1. הכינו את E. coli למתן בעכברי GF8 על ידי גידול E. coli שנקטף ממושבה אחת במדיה LB במשך הלילה.
    2. בתנאים מחמירים וסטריליים35, יש לתת 200 מיקרוליטר של תרבית E. coli לעכברי GF השוכנים במבודדי ויניל סטריליים או בכלובים אטומים להרחקה ביולוגית על ידי גבאג' אוראלי. אם משתמשים בחיידקים אירוסובלניים, עכברים עשויים גם להיות מאוכלסים על ידי יישום של 200 μL של תרבית חיידקים על גבו של כל עכבר.
      הערה: מנת החיסון תהיה תלויה בזן, מכיוון שחיידקים שונים מפגינים יכולת הישרדות pH שונה36,37. Zucoloto et al.35 ממליצים על חיסון עם 1 x 108 cfu לכל חיה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן נוצרו מעכברים שחוסנו בתרבית לילה (cfu לא נקבע). ניתן לבצע ניסויי פיילוט כדי לקבוע מינון שמביא להתיישבות אמינה של זן העכבר המעניין. נפח החיידקים שיש לתת על ידי gavage אוראלי עשוי להיות מושפע על ידי גיל ומשקל של העכברים. יש להיוועץ בפרוטוקול אתיקה פרטני של בעלי חיים במעבדה או במוסד לקבלת המינונים המרביים המותרים. הנפח המוצע כאן מבוסס על קצבת gavage של 10% ממשקל גוף העכבר (למשל, 200 μL לכל היותר עבור עכבר 20 גרם). חלק מזני החיידקים לא יסבלו את חומציות הקיבה ולא יצליחו ליישב את המעיים. שקלו תחילה לנטרל 100 מיקרוליטר של 1 M NaHCO3 כדי לנטרל חומצות קיבה2. אם משתמשים באנאירוב קפדני כדי להתיישב, יהיה צורך לגדל את החיידק בתנאים אנאירוביים ולהעביר אותו למתקן החיות הגנוטוביוטיות במיכלים אטומים לאוויר שהוכנו בנפרד (1 לכל עכבר). בצעו כל בדיקה במהירות ברגע שהמיכל נפתח כדי להגביל את אובדן הכדאיות המיקרוביאלית עקב חשיפה לחמצן.
    3. עקוב אחר עכברים לאיתור השפעות בריאותיות שליליות.
      הערה: במקרה של השפעות בריאותיות שליליות, עיין בתקנים שנקבעו על-ידי המתקן הרלוונטי לטיפול בבעלי חיים. השפעות בריאותיות שליליות אפשריות כוללות, אך אינן מוגבלות ל: (1) שאיפת נוזל gavage: הסימפטומים כוללים גירוש של בועות דרך האף, "פה פתוח" נשימה / התנשמות. (2) ניקוב הוושט: הסימפטומים כוללים בריאות חולה במהירות, כיפוף, עייפות, המוביל למוות של בעל החיים בתוך 24 שעות. (3) דלקת בוושט עקב gavages חוזרים: הסימפטומים כוללים קושי להחדיר את מחט gavage. (4) שלשול עקב שינויים במיקרוביום.
    4. לאשר התיישבות חיידקים בכדוריות צואה על ידי תרבית לפחות פעם בשבוע ו / או על ידי ריצוף rRNA 16S35.
      הערה: אם מגדלים מאכלסים בתוך איזולטור גנוטוביוטי לייצור עכברי ניסוי, תכננו לפחות 9 שבועות מראש ליצירת דור ראשון של צאצאים בני 6 שבועות (F1) עכברי ניסוי. לחלופין, עכברים בוגרים GF יכולים להיות monocolonized. בגישה זו, מומלץ להמתין 7 שבועות לאחר הנשאות לפני חיסון הפאגים, שכן זהו הזמן הדרוש לרירית המעי להתייצב לאחר החדרת מיקרוביוטה מורכבת לעכברי GF38.
  2. חיסון אוראלי של פאג T4 לעכברי E. coli monocolonized
    1. דילול ליזטים של פאגים T4 ובקרות רכב לריכוז קבוע מראש במאגר SM. לפי Hsu et al.2, לדלל פאג lysates כדי לאפשר מתן של 2 x 106 pfu לכל עכבר2.
      הערה: ניתן להשתמש בריכוז גבוה או נמוך יותר של פאגים בהתאם ליציבות הפאג in vivo. מינונים של 2 x 102, 2 x 104 ו- 2 x 106 pfu של פאג T4 לכל עכבר הביאו להתיישבות יציבה וארוכת טווח במעיים שלא נראתה תלויה במינון (מוצג בסעיף התוצאות המייצגות). לכן יש לבצע פיילוט של קינטיקה של חיידקי פאגים in vivo לפני ניסויים בקנה מידה גדול.
    2. בתנאים סטריליים וגנוטוביוטיים, יש לערבב כל עכבר ב-100 μL של 1 M NaHCO3 אוטוקלאבד כדי לנטרל את חומצות הקיבה. המתינו 10 דקות, ולאחר מכן השתו עם 100 מיקרוליטר של ליזט פאג T4 או בקרת רכב.
    3. עקוב אחר עכברים לאיתור השפעות בריאותיות שליליות.

3. ניטור רמות הפאגים T4 in vivo

הערה: לאחר חיסון עכברים בפאגים, ניתן למדוד את ריכוז הפאגים וחיידקי המטרה בדגימות צואה או רקמות. זה מספק מידע על הקינטיקה של זיהום הפאגים ודינמיקת ההתיישבות של שני האורגניזמים.

  1. ציפוי נקודתי של פאג T4 לקביעת ריכוז בכדורי צואה
    1. אספו כדורי צואה מכל עכבר לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים, שנשקלו מראש, כדי למדוד את רמות הפאגים T4 והאי-קולי . אחסנו את הצינורות על קרח עד לציפויים.
      הערה: הניחו דגימות על קרח בתקופת הביניים שבין האיסוף לציפוי כדי להאט את צמיחת החיידקים האווירו-סובלניים. במשך מספר שעות, עדיין עשויה להיות צמיחה של חיידקים אירוביים, או מוות כלשהו של חיידקים אנאירוביים עקב חשיפה לחמצן אשר יכול להוביל ספירת חיידקים מוטה. לכן, חיידקים וציפוי פאגים צריך להתבצע בהקדם האפשרי לאחר איסוף הדגימה. חיידקים אנאירוביים מחייבים לא יסבלו חשיפה לחמצן. כדי לשמר את הדגימה, יש לאסוף דגימות לצינורות אטומים ולהעביר את הצינורות לתא אנאירובי בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. אם לא זוהה גידול בדגימות צואה, שקול חלופות כגון 16S rRNA qPCR לכימות חיידקי.
    2. רשום את המשקלים הסופיים של כל צינור וחשב את משקל הדגימה על ידי הפחתת משקל הצינור הראשוני. זה ישמש לנרמול ריכוז T4 פאג ואי קולי למשקל הדגימה (pfu/g או cfu/g, בהתאמה).
    3. הוסף 1 מ"ל של חיץ SM סטרילי לכל צינור ומערבול ביסודיות במהירות מרבית (>1 דקות) כדי ליצור הומוגניות של כדורי צואה. אם הדגימה קטנה מ-15 מ"ג, ניתן להוסיף נפח קטן יותר של מאגר SM. רשום את עוצמת הקול של מאגר SM שנוסף לכל דגימה לצורך חישובים של cfu/g או pfu/g של הדגימה.
    4. הכינו סדרה של 8 (או יותר, תלוי בריכוז הפאגים הצפוי) דילולים סדרתיים של 20 μL מכל דגימה במאגר SM של 180 μL, בפקטורים של 10. מערבלים כל דגימה הומוגנית לערבוב קצר לפני הוספה לצינור/באר הראשונה. פיפטה לערבב בין כל תוספת ולשנות טיפים בין כל דילול כדי למנוע ניפוח של ספירת פאגים או חיידקים באמצעות נשיאת דגימה.
      הערה: אם סיבים ופסולת הנמצאים בדגימה מפריעים לפיפטציה, הוסף חיץ נוסף לתרחיף הצואה כדי לדלל עוד יותר את דגימת המלאי.
    5. כתם 5 μL מכל דילול על לוחות אגר רכים LB המכילים E. coli (עבור בדיקות פלאק פאגים) או לוחות אגר LB (1.5% אגר, עבור בדיקות מושבת חיידקים) כדי לקבוע T4 פאג וריכוז E. coli בכל דגימה. לקבלת דיוק, אתר כל דגימה בשלשה.
      הערה: בעת הכנת דילולים סדרתיים בצלחת של 96 בארות, ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית P20 בעלת 8 ערוצים כדי לקלף כל עמודה של דגימה בדילול סדרתי על צלחות. החליפו קצוות בין כל דילול, גם אם עוברים מרוב הדלילות למרוכזות ביותר, שכן הפאגים עשויים להיצמד לדפנות קצה הפיפטה ולשנות את כמות הפאגים שמתווספת לכל באר חדשה31.
    6. מניחים לכל נקודה להתייבש לפני שהופכים את הצלחת ומניחים אותה באינקובטור. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F).
    7. עבור כל דגימה, בחר את הדילול שבו יש 3-30 לוחות ספירה לכל נקודה. ספור ורשום את מספר הפלאק במקום ואת הדילול בו נעשה שימוש.
    8. חשב pfu/g של דגימה על ידי חלוקת מספר הפלאק בנפח המצופה בכל נקודה כדי לתת pfu/μL. הכפל זאת בגורם הדילול ובנפח מאגר SM שנוסף לכל דגימה כדי לתת pfu/sample. לבסוף, חלק במשקל המדגם כדי לתת pfu/g30.
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
  2. דגימת רקמות בנקודות קצה ניסיוניות
    1. בכל נקודת זמן שנבחרה, יש להרדים עכברים בהתאם לפרוטוקול האתי המוסדי המאושר של בעלי חיים ולאסוף תכולת צק"ל, תכולת מעיים קטנה וגדולה, וכל רקמות מעניינות לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים, במשקל 2 מ"ל בעלי תחתית עגולה.
    2. רשום את המשקלים הסופיים של כל צינור כדי לחשב את משקל הדגימה. יש לאחסן רקמות ותכולת צקל על קרח עד לציפוי באותו יום.
    3. הוסף מאגר SM סטרילי לכל צינור ורשום את אמצעי האחסון שנוספו.
    4. עבור תכולת צק"ל ומעיים, דגימות מערבולת יסודיות (>1 דקות) לפי שלב 3.1.3.
    5. לדגימות רקמה, הוסיפו חרוז מתכת סטרילי אחד לכל צינור. הומוגניזציה של רקמות באמצעות לייזר רקמות (ראה טבלת חומרים) ב 20 הרץ למשך 5 דקות או עד שהרקמות מנותקות והתרחיף הומוגני.
      הערה: אם הדגימות אינן הומוגניות היטב, שקול להגדיל את נפח מאגר SM שנוסף, להגדיל את זמן ההומוגניזציה או להגדיל את תדירות ההומוגניזציה ל- 30 הרץ. ניתן להשתמש בהומוגנייזר רקמות גם כדי לנתק רקמות תוך מתן אפשרות להתאוששות חיידקים ופאגים39,40. הומוגנייזרים מופעלים בתדרים גבוהים יותר מאשר ליזרים רקמתיים תוך שמירה על שלמות החיידקים.
    6. הכינו דילולים סדרתיים של כל דגימה בפקטורים של 10 ובצעו ציפוי נקודתי כדי לקבוע ריכוזי פאגים מסוג E. coli ו-T4 בכל דגימה, כמתואר בשלב 3.1.4-3.1.841.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לחקור את יחסי הגומלין בין פאג T4/E. coli dyad במעי המורין, פאג T4 וליזטים של כלי רכב הוכנו, נוקו וטוהרו (איור 1A). ליזטים של פאגים T4 כוסו על ידי בדיקת פלאק ונמהלו ל-2 x 10,7 pfu/mL (2 x 10,6 pfu/mouse) במאגר SM. גם ליזטים של כלי רכב עברו טיטור כדי לוודא שאין נוכחות פאגים בת קיימא ונמהלו באותו נפח של חיץ SM כמו הפאג ליזט T4. רמות האנדוטוקסין כומתו בליזטים מדוללים באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית. בפאג T4, בפאג מומת בחום ובליזטים של כלי רכב היו רמות א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חקר הפאגים במיקרוביום מהווה אתגר משמעותי בהשוואה למקביליהם החיידקיים. באופן ספציפי, פאגים אינם מכילים סמן פילוגנטי שמור המשותף לכל הפאגים בדומה לתת-היחידות הריבוזומליות 16S ו-18S המאפשרות את הקלות בריצוף ובזיהוי של מינים פרוקריוטים ואיקריוטים, בהתאמה42. עם זאת, עם ההתקדמות בגישות ריצוף הדור הבא, כולל הגדלת אורכי הקריאה, התפוקה והקטנת העלויות, מגיעה ההתרחבות המהירה של מאגרי גנום הבקטריופאג'42,43,44. עם הרב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מכירים בכך שהאדמה שעליה ביצעו את המחקר הזה היא הטריטוריה המסורתית, הקדומה והבלתי מוגבלת של אומת המוסקאם (xwməθkwəy̓əm). הארץ עליה היא ממוקמת תמיד הייתה מקום למידה עבור אנשי מוסקאם, שבמשך אלפי שנים העבירו הלאה את תרבותם, ההיסטוריה והמסורות שלהם מדור לדור באתר זה. אנו מעודדים אחרים ללמוד עוד על אדמות הילידים שבהן הם חיים ועובדים https://native-land.ca. המחברים מודים על תמיכת המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) מלגות לתואר שני - תואר שני (N.P.), פרס מייקל סמית 'מחקר בריאות BC Trainee Award (RT-2023-3174, ל- MH), מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית מענקי גילוי (RGPIN-2019-04591 ל- C.T., RGPIN-2016-04282 ל- LCO), המכון הקנדי למחקר מתקדם / בני אדם והמיקרוביום (FL-001253 Appt 3362, ל-C.T.), פרס Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, ל-C.T.), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (PJT-159458 ל-LCO) והקרן הקנדית לחדשנות (34673 ל-LCO ו-38277 ל-CT). אנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית ממרכז UBC למידול מחלות ו-ubcFLOW, הנתמך על ידי יוזמת החוסן הביולוגי UBC GREx, ולחברי מעבדות אוסבורן וטרופיני על דיונים קריטיים והערכה של כתב היד. איור 1A ואיור 2A נוצרו באמצעות Biorender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-אוקטנול (99%)ThermofisherCAAAA15977-AP
50 מ"ל PES Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליותMillipore Sigma 
אגרוז (דרגת EEO נמוכה/רב-תכליתית/ביולוגיה מולקולרית)פישר ביו-ריאגנטים BP160-500
Amicon® מכשיר מסנן צנטריפוגלי 100kDa Ultra-15, Ultracel-100Millipore SigmaUFC910008
BD Microtainer® צינורות, SSTBD Medical365967
כלובים אטומים להדרה ביולוגית (כלובי ISO) טצ'יפלסט1245ISOCAGE
C1000 מגע וסחר; Thermal Cycler עם מודול תגובה מהירה 96 בארותBioRad1851196
סידן כלוריד דיהידראט (גבישים לבנים לאבקה)Fisher BioReagentsBP510-500
מנעולי כובע לצינור 1.5 מ"ל 100/pkAndwin Scientific 
כלורופורם (אתנול כחומר משמר/ACS מאושר)FisherC298-500
חרוזי פלדה מצופים נחושת (4.5 מ"מ)Crosman Corporation0767
DNeasy Blood & ערכת טישו (50)תרמו סיינטיפיק 69504
DreamTaq ירוק PCR מאסטר מיקס (2X)תרמו סיינטיפיק K1081
תמיסת מלח דיסודיום חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), לביולוגיה מולקולרית, 0.5 מ' ב-H2OSigma AldrichE7889
פישר ביו-ריאגנטים וסחר; אגר, אבקה / פתיתים, פישר ביו-ריאגנטים וסחר;  פישר ביו-ריאגנטיםBP1423-500
פישר ביו-ריאגנטים וסחר; מיקרוביולוגיה מדיה: LB Broth (אבקה) - Lennox פישר ביוריאגנטיםBP1427-500
GeneRuler 100 bp סולם DNAThermo Scientific SM0241
ירוק FastMix® תערובת qPCR, 1250 rxnsQuantaBio95072-012
מסנני HEPA למכסי איזוקאז', מסנני H14 הניתנים לחיטוי עבור קו ISO- מוקרן TechiplastUISOHEPAXTBOX-300
מגנזיום סולפט heptahydrateפישר BioReagentsBP213-1
MaxQ 6000 שייקר מודגרThermo Scientific 8354-30-0009
מיקרוביולוגיה מדיה: מרק LB (אבקה) - לנוקספישר ביו-ריאגנטיםBP1427-500
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה הצמד נעילה, 2 מ"לפישר14-666-315
סרט איטום פרפילםBemisPM-996
מלאי פאג'יםCarolina Biological Supply לא ישים PicoLab
® דיאטת עכבר 20 EXTLabDiet5R58
פירס וסחר; ערכת אנדוטוקסין כרומוגנית ThermoScientific 
RNase A (17,500 U)Qiagen19101
סט DNase נטול RNaseQiagen 79254
נתרן ביקרבונט (אבקה לבנה עדינה)פישר כימיקלBP328-500
נתרן כלורי (גבישי/מוסמך ACS)פישר כימיקלS271
סוניקטור (דגם בדיקה CL-18; מקור כוח דגם FB50)פישר ריחני n/a
מבודד סרט גמיש סטרילי מחלקה נקייה ביולוגית לא SYBR&TRADE
; כתם ג'ל DNA בטוחInvitrogenS33102
T100 מחזור תרמי BioRad1861096
פריימר פאג'ים T4, קדימה (CCACACATAGCGCGAGTATAA)IDTn/a
פריימר פאג'ים T4, קדימה (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)IDTn/a
TissueLyser II קיאגן 85300
Tris-HCl, תמיסה 1M, pH 8.0, דרגת ביולוגיה מולקולרית, UltrapureThermo Scientific 
AAJ22638AE מים, (ללא DNASE, RNASE)פישר ביו-ריאגנטיםBP2484100
SCGP0052516812612A39552S

מקורות

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287(2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083(2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324(2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607(2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261(2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387(2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27(2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536(2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323(2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699(2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222(2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656(2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490(2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292(2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402(2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דינמיקת מאח-פאג'מיקרוביום המעיהכנת ליזט פאגיםבדיקת פלאקיםמודל עכבר גנוטוביוטידילול סדרתיספירת פאגים
אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.