אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

סיכום

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

תקציר

בקטריופאג'ים (פאג'ים) הם וירוסים שמדביקים חיידקים ברמת המינים והזנים, והם הישויות הביולוגיות הנפוצות ביותר בכל המערכות האקולוגיות הידועות. בתוך קהילות חיידקים, כמו אלה שנמצאות במיקרוביוטה של המעיים, פאגים מעורבים בוויסות הדינמיקה של אוכלוסיית המיקרוביוטה ובהנעת אבולוציה חיידקית. בעשור האחרון התעורר עניין מחודש במחקר פאגים, בין השאר הודות ליכולות ההרג הספציפיות לפונדקאי של פאגים ליטיים, המציעים כלי מבטיח נגד האיום הגובר של חיידקים עמידים מיקרוביאלית. יתר על כן, מחקרים אחרונים המוכיחים כי פאגים נצמדים לליחה במעי מצביעים על כך שייתכן שיש להם תפקיד מגן במניעת פלישת חיידקים לאפיתל הבסיסי. חשוב לציין, שבדומה למיקרוביום חיידקי, פגיאומים משובשים נקשרו להחמרה בתוצאות במחלות כמו מחלות מעי דלקתיות. מחקרים קודמים הראו כי פאגים יכולים לווסת את המיקרוביום של בעלי חיים ובני אדם באמצעות השתלות תסנין צואה, מה שיועיל לבריאות הפונדקאי. עם גל המחקר האחרון מגיע הצורך לבסס ולתקנן פרוטוקולים לחקר פאגים בהקשר של מיקרוביום המעי. פרוטוקול זה מספק סדרה של נהלים לחקר פאגים מבודדים מסוג T4 והפונדקאי החיידקי שלהם, Escherichia coli, בהקשר של מערכת העיכול של מורין. השיטות המתוארות כאן מתארות כיצד להתחיל מליזט פאגים, לתת אותו לעכברים ולהעריך את ההשפעות על רמות החיידקים המארח והפאגים. פרוטוקול זה יכול להשתנות ולהיות מיושם על זוגות פאג'ים-חיידקים אחרים, והוא מספק נקודת מוצא לחקר הדינמיקה של פונדקאי-פאג'ים in vivo.

מבוא

בקטריופאג'ים, או פאגים, הם וירוסים שמדביקים והורגים חיידקים עם מינים וספציפיות ברמת הזן¹. פאגים ממלאים תפקידים חשובים בקהילות חיידקים מורכבות כמו מיקרוביוטת המעיים, שם הם היו מעורבים בוויסות דינמיקת האוכלוסייה ובהנעת כושר חיידקי². במהלך העשור האחרון, התעורר עניין מחודש במחקר פאגים עקב עלייתם של פתוגנים עמידים אנטי-מיקרוביאליים³, והפוטנציאל לטיפול בפאגים כאסטרטגיית טיפול אלטרנטיבית. בשנים האחרונות נעשה שימוש בקוקטיילים של פאגים ליטיים דרך הווריד בהצלחה מסוימת בזיהומים ספטיים חיידקיים חמורים ועמידים לאנטיביוטיקה בבני אדם ^3,4. טיפול בפאגים דרך הפה הוצע גם כחלופה פוטנציאלית לאנטיביוטיקה לטיפול בדלקות מעיים ודלקות. יתר על כן, פאגים היו מעורבים בהצלחה של השתלות תסנין צואה (FFT), שהם תכשירי מיקרוביוטה צואתיים שסוננו לסילוק חיידקים, בטיפול בזיהום חוזר של Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, הפרעות מעי דלקתיות (IBD)^7,8 ודלקת מעיים נמקית בפגים⁹. בהתחשב בתוצאות אלה, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציות הן בין פאגים ומיקרוביוטת המעיים, והן בין פאגים לבין פונדקאי היונקים, שכן להוספת פאגים חדשים לקהילה קיימת עשויות להיות השפעות עקיפות על הקהילה כולה, ולא רק על חיידקי המטרה שלה ^2,10.

המחקר של אינטראקציות פאגים עם חיידקי המטרה שלהם במבחנה הוכח כיעיל להבנת המנגנונים וההשפעות של אינטראקציות פאגים וחיידקים במעיים. במסגרת זו, הוכח כי פאגים T4 ספציפיים ל- Escherichia coli מסדר Caudovirales דורשים תחומים דמויי אימונוגלובולין (Ig) הממוקמים בתוך חלבוני קפסיד חיצוני אנטיגני מאוד (Hoc) על פני השטח של הנגיפים כדי להיצמד לליחה במעי¹¹. בנוסף, מבחני טרנסוול הראו כי פאגים מסוג T4 מסוגלים לקיים אינטראקציה עם תרביות תאי אפיתל ולבצע טרנסלוקציה דרך שכבות התא על ידי מקרופינוציטוזה^12,13. תוצאות אלה תומכות בהשערה שפאגים יכולים לתקשר עם הפונדקאי המטזואני שלהם, אף על פי שהם אינם מסוגלים להדביק תאים איקריוטים. מודלים אלה, למרות שהם שימושיים, חסרים את כל טווח האינטראקציות המורכבות המתרחשות במערכת האקולוגית של המעיים הדרושות לחקירה מקיפה של האינטראקציה המשולשת בין פאגים, חיידקים והפונדקאי המטזואני.

מודלים של עכברים הם כלי חשוב לחקר פאגים בסביבות מורכבות. יישום רצוי של מתן פאגים הוא כאסטרטגיה חלופית לטיפול בזיהומים עמידים מיקרוביאליים או פתוביונטים הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות, כולל IBD. עם זאת, ספרות חדשה מציעה כי התנהגות פאגים במבחנה אינה מייצגת באופן מלא פונקציות in vivo. Buttimer et ^al.14 הראו כי קוקטייל פאגים היה מסוגל לרוקן את חיידקי המטרה בקונסורציום מיקרוביוטה אנושית פשוטה במבחנה, אך לא ניתן היה לשכפל אותו in vivo בעכברים גנוטוביוטיים שהתיישבו באותו קונסורציום חיידקים-פאגים. יתר על כן, במיקרוביום עכבר קונבנציונלי, פאג T7 הוביל לדלדול סלקטיבי של חיידקי המעיים שלו, אם כי נצפתה התאוששות הדרגתית לאורך זמן, המעידה על עמידות מפותחת¹⁵. מחקרים אחרים הוכיחו דו-קיום של פאגים הניתנים דרך הפה וזני חיידקי המטרה שלהם in vivo ^2,16. ואכן, מעבר לדו-קיום של פאגים/חיידקים, מתן פאגים הוביל לשינויים נרחבים בהרכב ובתפקוד הכולל של קהילת המיקרוביוטה ^2,16. זה רלוונטי במצבי מחלה, שכן מספר מחקרים מצאו קשרים בין שפע יחסי מוגבר של Caudovirales ו- IBD ^7,8,17 שהיו בלתי תלויים בשינויים בשפע חיידקים⁷. עדיין לא ידוע אם זהו מניע או תוצאה של פתוגנזה של המחלה.

המוקד ההיסטורי של חקר הפאגים היה סביב הקשר בין פאג לבין חיידק המטרה שלו. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון אינטראקציות אפשריות בין פאגים לבין הרירית, האפיתל ומערכת החיסון של הפונדקאי המטזואני. כל האינטראקציות האלה ממלאות תפקיד חשוב בתגובה הכוללת לזיהום פאגים במעי. כדי להדגים זאת, פאגים נחקרו באמצעות עכברים נטולי חיידקים (GF) כדי להבהיר את השפעתם על מערכת החיסון ללא הפרעה של המיקרוביוטה⁸. במערכת זו, חומצות גרעין פאגים זוהו על ידי קולטנים דמויי טול (TLR) הממוקמים בתוך אנדוזומים של תאי חיסון פגוציטיים (מקרופאגים ותאים דנדריטיים). זה הפעיל איתות במורד הזרם ועורר ייצור תלוי תאי T של אינטרפרון (IFN)-γ⁸ או סוג I IFNs¹⁸. יתר על כן, Fluckiger et ^al.19 עירבו תאי זיכרון CD8⁺ T בזיהוי אנטיגנים מקודדי פאגים (פרופאג'ים), מה שהביא לתגובתיות צולבת של תאי T עם אנטיגנים סרטניים, וכתוצאה מכך נטל הגידול מופחת. לבסוף, ייצור נוגדנים ספציפיים לפאגים תועד במחקרי עכברים שבהם פאגים הועברו למודלים של בעלי חיים באופן מתמשך באמצעות מי שתייה ^8,20, או על ידי גאגים פומיים חוזרים ונשנים במשך מספר חודשים²⁰, מה שמדגים את יכולתם של חלבוני פאגים לקדם תגובות חיסוניות הומורליות. אף על פי ששיטות אלה של חיסון פאגים מאפשרות הכנה אופטימלית ומתמשכת של מערכת החיסון, ייתכן שהן אינן מייצגות את האינטראקציות הטבעיות בין פאגים לסביבת המעי, וגם לא את הקינטיקה של טיפול בפאגים המיושמים דרך הפה. עד כה, מספר מצומצם של מחקרים בחנו את יחסי הגומלין של פאגים עם מין חיידק יחיד במודלים של עכברים חד-מושבתיים²¹. עם זאת, עכברים חד-מושבתיים הוכיחו את עצמם כקריטיים בפענוח השפעות ספציפיות של חיידקים של מינים בודדים על מערכת העיכול (GI) ועל התפתחות מערכת החיסון 22,23,24, והם עדיין עשויים להיות שימושיים בהבנת אינטראקציות משולשות בין פאגים, חיידקי המטרה שלהם והפונדקאי המטזואני.

באופן מלהיב, יש עדיין הרבה מה ללמוד על יחסי הגומלין בין פאגים במעיים לבין חיידקי מעיים, כמו גם על יחסי הגומלין המתרחשים בין המאכסן המטזואני לבין הפאגים השוכנים בתוכו. פרוטוקול זה מספק סדרה של הליכים לחקר פאג T4 מבודד ומקבילו החיידקי, E. coli (K-12, BW25113), באמצעות מודל עכבר גנוטוביוטי. נהלים סטנדרטיים אלה מספקים גם בסיס לאופטימיזציה של דיאדות פאגים/חיידקים אחרות על ידי התאמת פרמטרי הגידול לזוגות המעניינים. השיטות המתוארות כאן מתארות: (1) הכנת פאגים מסוג T4 וליזאטים של כלי רכב לגידול אוראלי של עכברים; (2) מתן פומי של פאג T4 לעכברים גנוטוביוטיים חד-מושבתיים מסוג E. coli ; (3) ניטור רמות הפאגים מסוג T4 בצואת עכברים וברקמות לאורך זמן.

עבור התוצאות המייצגות שהוצגו כאן, ליזטים מטוהרים של פאגים מסוג T4 הופצו ממניות בנק פאגים שהוחזקו על ידי מעבדת רוהוור. שיטת פאג-און-ברז להפצת פאג T4 הותאמה²⁵, כפי שמוזכר בפרוטוקול זה. השיטה מניבה מלאי פאגים גבוה ואנדוטוקסין נמוך תוך שלושה ימים. באמצעות גישה זו, 10 מ"ל של ≥ 10¹⁰ יחידות יוצרות פלאק (pfu)/מ"ל של פאג T4 עם < 0.5 יחידות אנדוטוקסין (EU)/מ"ל נאספו באופן שגרתי. רמות האנדוטוקסין המומלצות למתן פומי או תוך ורידי בעכברים הן ≤ 20 EU/מ"ל ו-≤ 5 EU/kg/h (או 0.1 EU מנוהל מעל שעה אחת עבור עכבר במשקל 20 גרם), בהתאמה, מה שהופך זאת לשיטה מתאימה להכנת פאגים לחיסון in vivo . כל מלאי הפאגים אוחסן בטמפרטורה של 4°C במאגר פאגים של מגנזיום מלוחים (SM) (מתכון סופק בשלב 1.1.5.1). E. coli טופח במדיה LB. עבור זוגות שונים של חיידקי פאג'ים, ניתן להתאים מצעי תרבית ותנאי גדילה מגוונים מפרוטוקול זה. פאגים יכולים גם להיות מופקים מהסביבה, כגון שפכים, מים ימיים, קרקע ותכולת מעיים, וניתן לבודד ולטהר אותם לפי סמברוק וראסל²⁶ לפני ההכנה תוך שימוש בתנאי הגידול והריבוי המתאימים לכל זוג פאגים-פונדקאים²⁵ . לחלופין, ניתן לקבל פאגים ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) או מבנקי פאגים.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של UBC והפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית (A23-0113, B19-0038). עכברים שוכנו באוניברסיטת קולומביה הבריטית בתנאים נטולי פתוגנים במרכז למידול מחלות. עכברי C57BL/6 גודלו בתוך המתקן במבודד סרט גמיש סטרילי, שסופק עם תזונת עכברים סטרילית, מים, מצעים וחומר קינון. העכברים הוחזקו במחזור יום / לילה של 12 שעות. עכברי ניסוי, הן זכר והן נקבה, היו תואמי גיל בכל ניסוי, בטווח של 6 עד 12 שבועות ובמשקל של 15-30 גרם עבור כל הניסויים.

1. הכנת פאגים וליזאטים לרכב לפליטה אוראלית לעכברים

1. טיהור פאגים ויצירת מלאי
   הערה: במחקר זה, פאגים מסוג T4 גדלים ומעובדים על ידי ציפוי על מדשאה של חיידקים בשיטת שכבת אגר יחידה, המתוארת להלן. שיטת שכבת האגר הכפולה תוארה בעבר^25,27וניתן להשתמש בו גם ביעילות דומה. שיטת שכבת אגר יחידה נבחרה עבור פרוטוקול זה מכיוון שהיא מספקת נראות פלאק משופרת²⁸.
   1. לגדל E. coli ב 5 מ"ל של מדיה LB סטרילית פוליסטירן סטרילי או צינורות תרבית זכוכית (עם כובעים). דוגרים על צינורות ב-37°C עם רעידות ב-200 סל"ד למשך הלילה, עד שמגיעים לשלב נייח.
   2. הכינו אגר רך בבקבוק מדיה מזכוכית על ידי כריתה אוטומטית של LB עם אגר 0.5% וקירור לטמפרטורה של 50°C ומטה (תוך השארת נוזל) לפני התוסף. הכינו מספיק אגר רך עבור 15 מ"ל לצלחת.
   3. יש להוסיף אגר רך עם MgSO₄ ו-CaCl₂ לריכוז סופי של 1 מ"מ לכל אחד. הוסף 100 μL של תרבית E. coli לילה עבור כל 3 מ"ל של אגר רך. ערבבו בעדינות בעזרת מוט ערבוב מגנטי כדי ליצור הומוגניות בין התוספים והתרבית באגר הרך.
      הערה: עקביות בנפח ובצפיפות של E. coli המתווסף להכנת אגר רך היא קריטית (מתואר בסעיף התוצאות המייצגות).
   4. מוסיפים 15 מ"ל אגר רך + אי קולי לכל צלחת פטרי (קוטר 15 ס"מ) באמצעות פיפטה סרולוגית. הניחו לצלחות להתייצב בטמפרטורת החדר לשימוש באותו יום.
      הערה: הצלחות ישקעו תוך כ-20 דקות עם מכסים פתוחים. האגר יישאר רך אך לא יזוז כאשר הצלחות הפוכות.
   5. הכינו 8-10 דילולים סדרתיים של פאג המקור T4 בפקטורים של 10 על ידי דילול במאגר SM. נקודה 5 μL של כל דילול על לוחות. אפשרו לכתמים להתייבש, להפוך ולדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
      1. להכנת חיץ פאגים של מגנזיום מלח (SM), ב-1 ליטר של H₂O שעבר דה-יוניזציה, יש להמיס 100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄·7H₂O ו-50 mM Tris-HCl (pH 7.4). Autoclave ולאחסן בטמפרטורת החדר.
         הערה: למחרת, E. coli היה צריך לגדול לתוך דשא ברחבי LB אגר רך. פלאקים, או אזורי צמיחה מנוקים הנראים במדשאה של E. coli , יופיעו במקום שבו הרג פאגים של פונדקאים נגועים של E. coli . כל לוח מייצג יחידה ליצירת לוח (pfu).
   6. בחרו לוח בודד מצלחת האגר הרכה על ידי דחיפת קצה פיפטה סטרילי למרכז הלוח, ויצרו תקע אגר בקצה הקצה. השהה מחדש את תקע הפלאק לתוך 1 מ"ל של חיץ SM בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל. מערבבים את הצינור במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי לערבב.
   7. צנטריפוגה את הצינור ב 4000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כל לכלוך מן הליזט. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
   8. כדי להפיץ את הפאג המבודד, חזור על שלבים 1.1.1-1.1.3. הוסף 100 μL של הפאג המבודד לאליקוט 15 מ"ל של אגר רך המכיל E. coli בצינור חרוט. הופכים את הצינור שלוש פעמים כדי לערבב ולשפוך את האגר לתוך צלחת פטרי.
   9. הניחו לצלחות להתייבש לפני היפוך ודגירת לילה ב-37°C. הכינו פלטת בקרת דשא ללא פאגים כדי לאשר את כדאיות האי-קולי .
      הערה: לאחר דגירה של לילה, לוחית הבקרה צריכה להיות בעלת מדשאה של E.coli ואילו הצלחת המכילה פאגים צריכה להיות מונחת לחלוטין.
   10. כדי לחלץ את הפאג' מהצלחת, הוסיפו 5 מ"ל של חיץ SM לפני השטח של הצלחת שסולקה בפאגים ונערו במהירות 70 סל"ד על נדנדה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   11. אספו את החיץ מהצלחת לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את כל הפסולת מצלחת האגר.
   12. אספו את מלאי הפאגים T4 ליזט לתוך צינור חדש ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד לטיטרציה והתפשטות.
       הערה: פאגים מסוג T4 יציבים מעל 10 שנים²⁵; עם זאת, היציבות תהיה תלויה בסוג הפאגים ובתנאי האחסון. טיטר פאגים ישתנה גם הוא עם זמן האחסון. פאגים רגישים לקיפאון. לכן, מומלץ לשמור בהקפאה בחנקן נוזלי ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מכיוון שהדבר עלול לפגוע בפאגים, מה שמפחית את טיטר הפאגים²⁵.
   13. Titer the T4 phaage stock lysate כדי לקבוע את הריכוז ב-pfu/mL, כפי שתואר קודם לכן 25,29,30. מלאי פאגים T4 עם טיטר גבוה יכיל 10⁸ pfu/mL או יותר.
2. הכנת ליזטים ניסיוניים של פאגים
   1. תרבית E. coli ב 5 מ"ל של מדיה LB פוליסטירן סטרילי או צינורות תרבית זכוכית (עם כובעים). דוגרים על צינורות לילה ב-37°C עם רעידות ב-200 סל"ד, עד שמגיעים לשלב נייח.
   2. תת-תרבית את תרבית הלילה E. coli 1:50 ב 100 מ"ל LB מדיה בבקבוק חרוטי זכוכית. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם רעידות ב-200 סל"ד עד שהחיידקים מגיעים לשלב מעריכי מוקדם עד אמצע (כ-1.5 שעות).
      הערה: ניתן לבצע עקומת גדילה ראשונית כדי לקבוע את הצפיפות האופטית בטווח של 600 ננומטר (OD₆₀₀) שבו תרבית החיידקים נמצאת בפאזה מעריכית. תרבית בצינור חרוטי זכוכית מוצעת מכיוון שראיות עדכניות מצאו כי פאגים מסוגלים להיצמד לפלסטיק כגון פוליפרופילן³¹.
   3. הוסיפו 100 μL של מלאי הפאגים T4 בעל הטיטר הגבוה משלב 1.1 לתת-תרבית E . coli ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם טלטול במשך 3 שעות, או עד שהליזט החדש כבר לא יהיה מעונן. אספו את הפאג' ליזט T4 לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל והמשיכו ישירות לשלבי הניקוי או, במידת הצורך, אחסנו בטמפרטורה של 4°C עד למחרת.
      הערה: גודל התפרצות פאגים גדול יותר (המציין מספר ממוצע גבוה יותר של נגיפים המשתחררים בכל מחזור שכפול) מחייב תקופת דגירה ארוכה יותר עבור תת-תרבית החיידקים בשלב 1.2.2. זה מספק צפיפות חיידקים מוגברת לפני זינוק עם מלאי פאגים.
   4. צנטריפוגה ליזט ב 4000 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את כל החיידקים שנותרו פסולת תאית. מסננים ומעקרים את הסופרנאטנט המתקבל באמצעות מסנן ניילון 0.22 מיקרומטר ומעבירים את התסנין לצינורות צנטריפוגות חרוטיות חדשים של 50 מ"ל.
   5. הוסף 0.1 נפחים של כלורופורם לכל נפח של ליזה פאג T4 מסונן כדי להרוג את כל החיידקים שנותרו ולמנוע צמיחת חיידקים. מערבבים לזמן קצר כדי לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
      הערה: פאגים עטופים בשומנים רגישים לכלורופורם, מה שעשוי להפחית את טיטר^{הפאגים 25}. דלג על שלב זה במידת הצורך.
      אזהרה: כלורופורם הוא ממס אורגני רעיל המסוכן בשאיפה, בליעה או ספיגה דרך העור. יש להשתמש במכסה אדים ובציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת עבודה עם כלורופורם. השתמש זכוכית במקום פיפטות סרולוגיות פוליסטירן בעת עבודה עם כלורופורם, כפי שהוא אינו תואם את רוב הפלסטיק. כלורופורם יכול להיות ממוקם בצינורות צנטריפוגות חרוטיות פוליפרופילן עבור שלבים 1.2.5-1.2.6 אבל לא צריך להיות מאוחסן לטווח ארוך בצינורות פלסטיק.
   6. צנטריפוגה את הליזט ב 4000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את הכלורופורם מן הליזט. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר בזהירות את שכבת הליזט העליונה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל מבלי להפריע לשכבת הכלורופורם שמתחת. יש להשליך את פסולת הכלורופורם למיכל הפסולת הנוזלית המסוכנת המתאים. יש לאחסן את הליזטים בטמפרטורה של 4°C עד לריכוז ולהחלפת החיץ למחרת.
   7. רכז פאגים ליזטים במכשיר מסנן צנטריפוגלי של 100 kDa (ראה טבלת חומרים) על ידי הוספת 13 מ"ל של פאג ליזט למאגר העליון של המכשיר וצנטריפוגה במהירות של 4000 x גרם למשך 5 דקות, או עד שרוב הליזט עבר דרך המסנן לתוך המאגר התחתון.
      הערה: יש לשאוף לקבל בערך 2 מ"ל של ליזט בסוף זמן הסחיטה. ככל שריכוז הפאגים עולה במסנן בתוספת ליזט, זמני הספין צפויים לגדול. להתקני מסנן צנטריפוגלי יש עצירה פיזית מתה כדי למנוע מהם להסתובב יבש³². אין לתת לקרום המסנן להתייבש אם הכוונה להמשך השימוש (כלומר, על ידי הוצאת כל הנוזלים מהמאגר העליון). זמני הסחיטה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הפאג' והטיטר.
   8. באמצעות פיפטה P200 או P1000, פיפטה עדינה את ~ 2 מ"ל הנותרים של ליזט למעלה ולמטה בתוך המאגר העליון כדי לפתוח את סתימת קרום המסנן לאחר כל סיבוב. השליכו את התסנין מהמאגר התחתון למיכל פסולת, והשאירו את הפאגים המרוכזים במאגר העליון.
   9. חזור על שלבים 1.2.7-1.2.8 עד שכל נפח הפאג ליזט יעבור דרך התקן המסנן, כאשר ~2 מ"ל של פאגים מרוכזים נשמרים במאגר העליון לאחר כל סיבוב.
   10. פתח את קרום המסנן לאחר הסחרור האחרון על ידי פיפטציה של הליזט הנותר (~ 2 מ"ל) במאגר העליון למעלה ולמטה. שטפו את הפאג' (חילופי חיץ) על ידי הוספת 12 מ"ל של חיץ SM למאגר העליון ולצנטריפוגה במהירות 4000 x גרם למשך 10 דקות, או עד שרוב החיץ עבר דרך המסנן.
   11. השליכו את התסנין וחזרו על שלב השטיפה (שלב 1.2.10). השהה מחדש את 2 מ"ל הליזט הנותרים במאגר SM לנפח סופי של 10 מ"ל (או פחות), לאחסון לטווח ארוך. מעבירים את הליזט לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להסרת אנדוטוקסין.
       הערה: אופציונלי לקשור את הפאגים בשלב זה כדי להבטיח שהפאג ליזט היה מרוכז (> 10⁸ pfu/mL), ולקבוע אובדן פאגים במהלך תהליך הסרת האנדוטוקסין.
   12. הסר אנדוטוקסינים מזהמים מהפאג ליזט T4 על-ידי הוספת 0.4 נפחים של 1-אוקטאנול (ראה טבלת חומרים) לנפח הכולל של ליזט.
       הערה: אנדוטוקסינים מוסרים מכיוון שהם מעוררים מאוד את מערכת החיסון, ולכן נוכחותם עלולה להוביל להשראת תגובה חיסונית מולדת בלתי תלויה בפאגים²⁵.
       זהירות: 1-אוקטאנול הוא תרכובת ארומטית, אורגנית, דליקה עם ריח חזק ומהווה גירוי לעיניים. יש ללבוש PPE מתאים בעת עבודה עם 1-אוקטאנול. בצע את כל העבודה במכסה אדים כדי למנוע שאיפת אדים. השתמש בסרט איטום כדי למנוע דליפה של צינורות בעת עבודה מחוץ למכסה האדים.
   13. אטמו את מכסה צינור הצנטריפוגה החרוטי בסרט איטום למניעת דליפה. יש לנער ב-120 סל"ד על פלטפורמה או לנדנד שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לדגור ב-4°C במשך שעה וחצי, ללא רעידות.
   14. צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 10 דקות כדי להפריד את הליזט מנוקה אנדוטוקסין מן 1-אוקטאנול. שכבת האוקטאנול 1 תצוף על גבי הליזט. השתמש פיפטה P1000 כדי להסיר בזהירות 1-אוקטאנול ככל האפשר ולהשליך לתוך מיכל פסולת נוזלית מסוכנת/דליקה המתאים.
   15. השתמש במחט 18 G ומזרק 10 מ"ל כדי לאסוף את הפאג ליזט מתחת לשכבת 1-אוקטאנול הנותרת, תוך הקפדה לא לאסוף את שכבת 1-אוקטאנול. יש לאחסן את הליזט בטמפרטורה של 4°C עד לשאיבת אבק מהירה.
   16. העבר 1 מ"ל aliquots של T4 פאג lysate לתוך סטרילי 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. יש לשאוב במהירות עם מכסים פתוחים ב-4000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאדות שאריות 1-אוקטאנול מהליזט. יש לשאוב במהירות למשך 3 שעות או עד שנפח הפאג' ליזט יופחת ב-30%²⁵. יש לאחסן ב-4°C עד לטיטרציה.
   17. Titer את הפאג lysate כדי לקבוע את הריכוז pfu/mL. לדלל את T4 פאג ליזט שנוצר ב SM חיץ לריכוז הרצוי re-titer כדי לאשר.
   18. כמת אנדוטוקסינים הנמצאים בפאג ליזט T4 באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). השוו את רמות האנדוטוקסין בפאג ליזט הסופי עם דגימה לפני הסרת אנדוטוקסין, בקרות רכב, חיץ ומי שתייה של עכברים.
       הערה: ערכת כימות האנדוטוקסין הכרומוגנית מושבתת על-ידי 1-אוקטאנול²⁵. בצע שלבי ואקום מהירים כדי להסיר 1-אוקטאנול (שלב 1.2.16) לפני כימות אנדוטוקסינים. תכולת האנדוטוקסין במים מזוקקים מוערכת ב -20 האיחוד האירופי / מ"ל²⁵; עם זאת, תכולת האנדוטוקסין במי השתייה של עכברים עשויה להשתנות בין מתקנים. אם רמות האנדוטוקסין בפאג ליזט עולות על הכמות הקיימת במי השתייה, שקול לחזור על שלבים לסילוק אנדוטוקסין (1.2.12-1.2.16).
   19. אחסנו ליזטים מרוכזים של T4 שעברו ניקוי אנדוטוקסין במאגר SM בטמפרטורה של 4°C.
3. הכנת ליזט חיידקי נטול פאגים לבקרות רכב
   הערה: ניתן להכין ליזט חיידקי נטול פאגים ככלי לבקרה על כל השפעה הנובעת ממזהמים חיידקיים (למשל, אנדוטוקסין) הנוצרים בייצור פאג ליזט בשלב 1.2, אשר יכול להשפיע על תוצאות הניסוי כאשר מחוסנים בעכברים.
   1. מתרבית לילה של E. coli, תת-תרבית של E. coli 1:50 לתוך 100 מ"ל של מדיה LB. מבלי להוסיף פאגים, המשיכו לגדל את החיידקים תוך כדי רעידות בטמפרטורה של 37°C במשך 3 שעות, או התאמת זמן הדגירה של הפאג ליזט המיוצר בשלב 1.2.
   2. העבירו את תרבית E. coli לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ולתאי ליז באמצעות בדיקה סוניקטורית (ראו טבלת חומרים) על קרח במהירות של 30 קילוהרץ למשך 30 פולסים של שניות (3x) כדי לבצע ליזה ידנית של תאי חיידקים.
   3. בצע את שאר הפרוטוקול לפי שלב 1.2, החל משלב 1.2.4, כולל כל שלבי הניקוי, השטיפה והסרת האנדוטוקסין.
      הערה: במהלך הריכוז באמצעות התקן הסינון הצנטריפוגלי, הליזט של הרכב יזרום דרך המסנן מהר יותר מאשר הפאג ליזט, בשל היעדר פאגים. לכן, קצרו את זמני הצנטריפוגה מ-5 דקות ל-2-5 דקות כדי להבטיח שקרום האולטרה-פילטר לא יתייבש במהלך צנטריפוגה ממושכת.
   4. כווצו את הליזט של הרכב כדי לוודא שהוא אינו מכיל פאגים.
   5. השתמש בערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד את רמות האנדוטוקסין בליזט הרכב. דללו את הליזט של הרכב במאגר SM כדי להתאים לרמות האנדוטוקסין בפאג ליזט.
4. בקרות ניסיוניות חלופיות: הכנת פאג ליזט מומת בחום
   הערה: חלופה לליזט חיידקי נטול פאגים היא פאג' ליזט מומת בחום. נטרול חום מנתק נגיפים של פאגים, בעוד שאנדוטוקסינים שיוריים כגון ליפופוליסכרידים (LPS) יציבים בחום ^8,33. Gogokhia et ^al.8 השתמשו בשיטה זו כדי לקבוע אם נגיפי פאגים שלמים וברי קיימא דרושים להפעלה חיסונית. החוקרים מוזמנים לבחון את שתי השיטות (ללא פאגים לעומת מומתים בחום) ולקבוע איזו בקרה מתאימה ביותר לצרכי הניסוי שלהם. לא משנה מה נבחר, חשוב להכיר בכך שבקרת חיץ אינה צפויה להיות מתאימה בשל המניפולציה המשמעותית הנדרשת כדי לרכז ולנקות מלאי פאגים.
   1. העבר את הנפח הדרוש של פאג ליזט T4 מנוקה, מטוהר ומדולל משלב 1.2 (100 מיקרוליטר לעכבר) לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים המצוידים במנעולי מכסה.
   2. מחממים ליזטים על בלוק חום ב 95 ° C במשך 15 דקות¹⁶.
   3. אופציונלי: אם נדרשת הסרה של פאגים/חומצות גרעין חיידקיות, בצע טיפול DNase I ו-RNase A לפי Jakočiūnė ו-Moodley³⁴. על רגל אחת:
      1. הוסף 50 μL DNase I 10x buffer, 1μL DNase I (1 U/μL) ו- 1 μL RNase A (10 mg/mL) (ראה טבלת חומרים) ל- 450 μL של פאג ליזט מומת בחום.
      2. לדגור על ליזטים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה וחצי בבלוק חום, ללא רעידות.
      3. נטרל את DNase I ו- RNase A על ידי הוספת 20 μL 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)³⁴.
   4. החזיקו ליזטים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להתקרר ושלבו ליזטים אם משתמשים במספר צינורות. יש לאחסן ב-4°C עד לטיטרציה.
   5. בצעו טיטר פאגים כדי לוודא שאין פאג T4 בר קיימא בליזט. יש לאחסן ליזטים מומתים בחום בטמפרטורה של 4°C.
   6. השתמש בערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד את רמות האנדוטוקסין בליזט המומת בחום. דללו את הליזט המומת בחום במאגר SM בהתאם לרמות האנדוטוקסין הקיימות בפאג ליזט התואם.

2. מתן וניטור של פאג T4 בעכברי E. coli חד-מושבתיים

1. מונוקולוניזציה של עכברים עם E. coli
   1. הכינו את E. coli למתן בעכברי GF⁸ על ידי גידול E. coli שנקטף ממושבה אחת במדיה LB במשך הלילה.
   2. בתנאים מחמירים וסטריליים³⁵, יש לתת 200 מיקרוליטר של תרבית E. coli לעכברי GF השוכנים במבודדי ויניל סטריליים או בכלובים אטומים להרחקה ביולוגית על ידי גבאג' אוראלי. אם משתמשים בחיידקים אירוסובלניים, עכברים עשויים גם להיות מאוכלסים על ידי יישום של 200 μL של תרבית חיידקים על גבו של כל עכבר.
      הערה: מנת החיסון תהיה תלויה בזן, מכיוון שחיידקים שונים מפגינים יכולת הישרדות pH שונה^36,37. Zucoloto et ^al.35 ממליצים על חיסון עם 1 x 10⁸ cfu לכל חיה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן נוצרו מעכברים שחוסנו בתרבית לילה (cfu לא נקבע). ניתן לבצע ניסויי פיילוט כדי לקבוע מינון שמביא להתיישבות אמינה של זן העכבר המעניין. נפח החיידקים שיש לתת על ידי gavage אוראלי עשוי להיות מושפע על ידי גיל ומשקל של העכברים. יש להיוועץ בפרוטוקול אתיקה פרטני של בעלי חיים במעבדה או במוסד לקבלת המינונים המרביים המותרים. הנפח המוצע כאן מבוסס על קצבת gavage של 10% ממשקל גוף העכבר (למשל, 200 μL לכל היותר עבור עכבר 20 גרם). חלק מזני החיידקים לא יסבלו את חומציות הקיבה ולא יצליחו ליישב את המעיים. שקלו תחילה לנטרל 100 מיקרוליטר של 1 M NaHCO₃ כדי לנטרל חומצות קיבה². אם משתמשים באנאירוב קפדני כדי להתיישב, יהיה צורך לגדל את החיידק בתנאים אנאירוביים ולהעביר אותו למתקן החיות הגנוטוביוטיות במיכלים אטומים לאוויר שהוכנו בנפרד (1 לכל עכבר). בצעו כל בדיקה במהירות ברגע שהמיכל נפתח כדי להגביל את אובדן הכדאיות המיקרוביאלית עקב חשיפה לחמצן.
   3. עקוב אחר עכברים לאיתור השפעות בריאותיות שליליות.
      הערה: במקרה של השפעות בריאותיות שליליות, עיין בתקנים שנקבעו על-ידי המתקן הרלוונטי לטיפול בבעלי חיים. השפעות בריאותיות שליליות אפשריות כוללות, אך אינן מוגבלות ל: (1) שאיפת נוזל gavage: הסימפטומים כוללים גירוש של בועות דרך האף, "פה פתוח" נשימה / התנשמות. (2) ניקוב הוושט: הסימפטומים כוללים בריאות חולה במהירות, כיפוף, עייפות, המוביל למוות של בעל החיים בתוך 24 שעות. (3) דלקת בוושט עקב gavages חוזרים: הסימפטומים כוללים קושי להחדיר את מחט gavage. (4) שלשול עקב שינויים במיקרוביום.
   4. לאשר התיישבות חיידקים בכדוריות צואה על ידי תרבית לפחות פעם בשבוע ו / או על ידי ריצוף rRNA 16S³⁵.
      הערה: אם מגדלים מאכלסים בתוך איזולטור גנוטוביוטי לייצור עכברי ניסוי, תכננו לפחות 9 שבועות מראש ליצירת דור ראשון של צאצאים בני 6 שבועות (F1) עכברי ניסוי. לחלופין, עכברים בוגרים GF יכולים להיות monocolonized. בגישה זו, מומלץ להמתין 7 שבועות לאחר הנשאות לפני חיסון הפאגים, שכן זהו הזמן הדרוש לרירית המעי להתייצב לאחר החדרת מיקרוביוטה מורכבת לעכברי GF³⁸.
2. חיסון אוראלי של פאג T4 לעכברי E. coli monocolonized
   1. דילול ליזטים של פאגים T4 ובקרות רכב לריכוז קבוע מראש במאגר SM. לפי Hsu et ^al.2, לדלל פאג lysates כדי לאפשר מתן של 2 x 10⁶ pfu לכל עכבר².
      הערה: ניתן להשתמש בריכוז גבוה או נמוך יותר של פאגים בהתאם ליציבות הפאג in vivo. מינונים של 2 x 10², 2 x 10⁴ ו- 2 x 10⁶ pfu של פאג T4 לכל עכבר הביאו להתיישבות יציבה וארוכת טווח במעיים שלא נראתה תלויה במינון (מוצג בסעיף התוצאות המייצגות). לכן יש לבצע פיילוט של קינטיקה של חיידקי פאגים in vivo לפני ניסויים בקנה מידה גדול.
   2. בתנאים סטריליים וגנוטוביוטיים, יש לערבב כל עכבר ב-100 μL של 1 M NaHCO₃ אוטוקלאבד כדי לנטרל את חומצות הקיבה. המתינו 10 דקות, ולאחר מכן השתו עם 100 מיקרוליטר של ליזט פאג T4 או בקרת רכב.
   3. עקוב אחר עכברים לאיתור השפעות בריאותיות שליליות.

3. ניטור רמות הפאגים T4 in vivo

הערה: לאחר חיסון עכברים בפאגים, ניתן למדוד את ריכוז הפאגים וחיידקי המטרה בדגימות צואה או רקמות. זה מספק מידע על הקינטיקה של זיהום הפאגים ודינמיקת ההתיישבות של שני האורגניזמים.

1. ציפוי נקודתי של פאג T4 לקביעת ריכוז בכדורי צואה
   1. אספו כדורי צואה מכל עכבר לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים, שנשקלו מראש, כדי למדוד את רמות הפאגים T4 והאי-קולי . אחסנו את הצינורות על קרח עד לציפויים.
      הערה: הניחו דגימות על קרח בתקופת הביניים שבין האיסוף לציפוי כדי להאט את צמיחת החיידקים האווירו-סובלניים. במשך מספר שעות, עדיין עשויה להיות צמיחה של חיידקים אירוביים, או מוות כלשהו של חיידקים אנאירוביים עקב חשיפה לחמצן אשר יכול להוביל ספירת חיידקים מוטה. לכן, חיידקים וציפוי פאגים צריך להתבצע בהקדם האפשרי לאחר איסוף הדגימה. חיידקים אנאירוביים מחייבים לא יסבלו חשיפה לחמצן. כדי לשמר את הדגימה, יש לאסוף דגימות לצינורות אטומים ולהעביר את הצינורות לתא אנאירובי בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. אם לא זוהה גידול בדגימות צואה, שקול חלופות כגון 16S rRNA qPCR לכימות חיידקי.
   2. רשום את המשקלים הסופיים של כל צינור וחשב את משקל הדגימה על ידי הפחתת משקל הצינור הראשוני. זה ישמש לנרמול ריכוז T4 פאג ואי קולי למשקל הדגימה (pfu/g או cfu/g, בהתאמה).
   3. הוסף 1 מ"ל של חיץ SM סטרילי לכל צינור ומערבול ביסודיות במהירות מרבית (>1 דקות) כדי ליצור הומוגניות של כדורי צואה. אם הדגימה קטנה מ-15 מ"ג, ניתן להוסיף נפח קטן יותר של מאגר SM. רשום את עוצמת הקול של מאגר SM שנוסף לכל דגימה לצורך חישובים של cfu/g או pfu/g של הדגימה.
   4. הכינו סדרה של 8 (או יותר, תלוי בריכוז הפאגים הצפוי) דילולים סדרתיים של 20 μL מכל דגימה במאגר SM של 180 μL, בפקטורים של 10. מערבלים כל דגימה הומוגנית לערבוב קצר לפני הוספה לצינור/באר הראשונה. פיפטה לערבב בין כל תוספת ולשנות טיפים בין כל דילול כדי למנוע ניפוח של ספירת פאגים או חיידקים באמצעות נשיאת דגימה.
      הערה: אם סיבים ופסולת הנמצאים בדגימה מפריעים לפיפטציה, הוסף חיץ נוסף לתרחיף הצואה כדי לדלל עוד יותר את דגימת המלאי.
   5. כתם 5 μL מכל דילול על לוחות אגר רכים LB המכילים E. coli (עבור בדיקות פלאק פאגים) או לוחות אגר LB (1.5% אגר, עבור בדיקות מושבת חיידקים) כדי לקבוע T4 פאג וריכוז E. coli בכל דגימה. לקבלת דיוק, אתר כל דגימה בשלשה.
      הערה: בעת הכנת דילולים סדרתיים בצלחת של 96 בארות, ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית P20 בעלת 8 ערוצים כדי לקלף כל עמודה של דגימה בדילול סדרתי על צלחות. החליפו קצוות בין כל דילול, גם אם עוברים מרוב הדלילות למרוכזות ביותר, שכן הפאגים עשויים להיצמד לדפנות קצה הפיפטה ולשנות את כמות הפאגים שמתווספת לכל באר חדשה³¹.
   6. מניחים לכל נקודה להתייבש לפני שהופכים את הצלחת ומניחים אותה באינקובטור. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F).
   7. עבור כל דגימה, בחר את הדילול שבו יש 3-30 לוחות ספירה לכל נקודה. ספור ורשום את מספר הפלאק במקום ואת הדילול בו נעשה שימוש.
   8. חשב pfu/g של דגימה על ידי חלוקת מספר הפלאק בנפח המצופה בכל נקודה כדי לתת pfu/μL. הכפל זאת בגורם הדילול ובנפח מאגר SM שנוסף לכל דגימה כדי לתת pfu/sample. לבסוף, חלק במשקל המדגם כדי לתת pfu/g³⁰.
      
      
2. דגימת רקמות בנקודות קצה ניסיוניות
   1. בכל נקודת זמן שנבחרה, יש להרדים עכברים בהתאם לפרוטוקול האתי המוסדי המאושר של בעלי חיים ולאסוף תכולת צק"ל, תכולת מעיים קטנה וגדולה, וכל רקמות מעניינות לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים, במשקל 2 מ"ל בעלי תחתית עגולה.
   2. רשום את המשקלים הסופיים של כל צינור כדי לחשב את משקל הדגימה. יש לאחסן רקמות ותכולת צקל על קרח עד לציפוי באותו יום.
   3. הוסף מאגר SM סטרילי לכל צינור ורשום את אמצעי האחסון שנוספו.
   4. עבור תכולת צק"ל ומעיים, דגימות מערבולת יסודיות (>1 דקות) לפי שלב 3.1.3.
   5. לדגימות רקמה, הוסיפו חרוז מתכת סטרילי אחד לכל צינור. הומוגניזציה של רקמות באמצעות לייזר רקמות (ראה טבלת חומרים) ב 20 הרץ למשך 5 דקות או עד שהרקמות מנותקות והתרחיף הומוגני.
      הערה: אם הדגימות אינן הומוגניות היטב, שקול להגדיל את נפח מאגר SM שנוסף, להגדיל את זמן ההומוגניזציה או להגדיל את תדירות ההומוגניזציה ל- 30 הרץ. ניתן להשתמש בהומוגנייזר רקמות גם כדי לנתק רקמות תוך מתן אפשרות להתאוששות חיידקים ופאגים^39,40. הומוגנייזרים מופעלים בתדרים גבוהים יותר מאשר ליזרים רקמתיים תוך שמירה על שלמות החיידקים.
   6. הכינו דילולים סדרתיים של כל דגימה בפקטורים של 10 ובצעו ציפוי נקודתי כדי לקבוע ריכוזי פאגים מסוג E. coli ו-T4 בכל דגימה, כמתואר בשלב 3.1.4-3.1.8⁴¹.

תוצאות

כדי לחקור את יחסי הגומלין בין פאג T4/E. coli dyad במעי המורין, פאג T4 וליזטים של כלי רכב הוכנו, נוקו וטוהרו (איור 1A). ליזטים של פאגים T4 כוסו על ידי בדיקת פלאק ונמהלו ל-2 x 10,⁷ pfu/mL (2 x 10,⁶ pfu/mouse) במאגר SM. גם ליזטים של כלי רכב עברו טיטור כדי לוודא שאין נוכחות פאגים בת קיימא ונמהלו באותו נפח של חיץ SM כמו הפאג ליזט T4. רמות האנדוטוקסין כומתו בליזטים מדוללים באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית. בפאג T4, בפאג מומת בחום ובליזטים של כלי רכב היו רמות אנדוטוקסין נמוכות מהרמות המקובלות למי שתייה (<20 EU/mL)²⁵ (איור 1B). מכיוון שליזט הרכב הכיל כמות דומה של אנדוטוקסין כמו הפאג ליזט T4, הוא נחשב לאמצעי בקרה מתאים. הפאג' ליזט המומת בחום (2 x 10,⁷ pfu/mL לפני הטיפול בחום) הכיל פחות אנדוטוקסין מאשר ברכב ובפאג ליזט T4. בהתאם להוראות הערכה, דגימות שטופלו באוקטאנול 1 נבדקו לעיכוב בדיקה על ידי הוספת תקן אנדוטוקסין לליזט הרכב (רכב ספייק), כדי לתת ריכוז סופי של 0.5 EU/mL. רמות האנדוטוקסין הגבוהות ברכב פחות רמות האנדוטוקסין ברכב נמדדו ב-0.5 EU/מ"ל ±25%, בהתאם להמלצות היצרן (איור 1B). זה הוכיח כי 1-אוקטאנול הוסר בהצלחה וכי לא היה עיכוב הבדיקה שנגרם על ידי lysates שיכול להפריע לתוצאות של הבדיקה.

אי קולי עכברי K-12 (BW25113) מונוקולוניזציה C57BL/6 גודלו בתוך איזולטור ויניל סטרילי גמיש בתנאים גנוטוביוטיים (איור 2A). עכברים מדור F0 יושבו עם E. coli באמצעות הוספתו לסביבה ולדיור המשותף שלהם. רק הצאצאים (דור F1 ו-F2) שהתיישבו באי-קולי מלידה באמצעות שידור אנכי ודיור משותף שימשו לניסויים. אסטרטגיה זו שלטה בשינויים במערכת החיסון, בייצור הריר ובהתפתחות מערכת העיכול המתרחשת בתגובה לחיסון חיידקי^22,37, ולכן אפשרה למדוד שינויים המתרחשים רק בגלל החדרת פאגים. לאחר שהתבגרו, עכברי ניסוי הועברו לאיזוקאז'ים סטריליים, שם כל אחד מהם קיבל 2 x 10⁶ pfu של פאג T4 או נפח שווה של ליזט רכב על ידי gavage אוראלי בגיל 6-8 שבועות. שפע הפאגים T4 וה-E. coli נוטר במשך ארבעה שבועות על ידי איסוף כדורי צואה ומבחני ציפוי נקודתי על אגר 0.5% (רך) או 1.5% אגר, בהתאמה. במהלך הניסוי הזה, פאגים מסוג T4 ואי קולי הצליחו להתקיים יחד מבלי שאף אחת מהאוכלוסיות תתרוקן (איור 2B, C). מתן פומי של פאג T4 במינונים נמוכים יותר של 2 x 10² ו-2 x 10⁴ pfu/עכבר לא הפחית את היכולת של פאג T4 ליישב את המעי בהשוואה ל-2 x 10⁶ pfu (איור 2D). באופן דומה, לא נצפתה השפעה תלוית מינון של חיסון T4 על רמות E. coli (איור 2E).

חשוב לציין כי עקביות בציפוי בין הדגימות נמצאה כחיונית לספירת הפלאק. לדוגמה, כאשר הוסיפו חיידקים לאגר הרך, נקבע כי צפיפות החיידקים השפיעה מאוד על תוצאת הבדיקה. תוספת של E. coli שהיה בתת-תרבית במשך שעה, 1.5 שעות או שעתיים, הביאה לספירת פלאק נמוכה יותר מאשר עם תוספת של E. coli בתת-תרבית במשך 2.8 שעות או יותר. יתר על כן, כימות הפלאק התייצב על ~1 x 10⁹ pfu/mL כאשר E. coli היה בתת-תרבית במשך 2.8 שעות עד 16 שעות (לילה), שהיה גידול של בערך פי 5 בהשוואה לערך שחושב מתת-תרבית של שעה אחת (~2 x 10⁸ pfu/ml) (איור 3A). במקום תת-תרבית, ניתן לחסן חיידקי מטרה לאגר רך מתרביות לילה. כאן, הנפח של תרבית E. coli בת 16 שעות (לילה) שחוסנה לתוך האגר הרך השפיע על ספירת הפלאק (איור 3B). תוצאות אלה מצביעות על כך שצפיפות E. coli בתוך האגר יכולה להשפיע על ספירת בדיקת פלאק. בשתי הגישות, תוצאות כימות הפאגים הגיעו לאותו ערך (10⁹ pfu/ml), מה שמרמז על כך שחיידקי המטרה חייבים להיות בעלי צפיפות גבוהה מספיק באגר הרך כדי להבטיח דיוק בספירת הפלאק.

יחד, תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח הבנה של קינטיקה של חיידקי פאגים באמצעות ניסויי פיילוט in vitro ו-in vivo לפני ביצוע מניפולציות ניסיוניות.

איור 1: הכנת ליזטים של פאגים. (A) תהליך עבודה להתחלת ליזט פאגים ממלאי פאגים עם טיטר גבוה. ליזטים הופצו, נוקו, התרכזו ואנדוטוקסינים הוסרו. זיהום 1-אוקטאנול הוסר על ידי ואקום מהיר. (B) אנדוטוקסינים כומתו בפאגים ובליזטים של כלי רכב באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית. קווים כחולים מקווקווים מציינים את הגבולות העליונים והתחתונים כדי להפריך עיכוב מוצר בבקרת עיכוב המוצר (0.5 EU/mL ± 25%). כל נקודה מייצגת אחד משני העתקים טכניים. גובה העמודות מייצג את הממוצע בין עותקים משוכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: יצירת עכברים חד-מושבתיים וניטור רמות הפאגים והחיידקים בכדוריות צואה. (A) תהליך עבודה ליישוב עכברים נטולי חיידקים עם זן חיידקים יחיד ודור של עכברים חד-מושבתיים מסוג F1 ו-F2. (ב-ה) רמות של פאג T4 ואי קולי התגלו בכדוריות צואה של עכברי C57BL/6 שנולדו חד-מושבתיים עם E. coli וחוסנו בפאג T4 בגיל 6-8 שבועות. ביום 0 (טרום קולוניזציה) ובימים שצוינו לאחר הקולוניזציה, רמות הפאגים T4 נמדדו על ידי ציפוי נקודתי ומבחני פלאק בשיטת שכבת אגר יחידה. רמות E. coli נמדדו על ידי ציפוי נקודתי על 1.5% LB אגר. (ב, ג) קינטיקה של (B) רמות פאג T4 ו- (C) E. coli בכדוריות צואה שהחלימו לאחר חיסון עם 2 x 10⁶ pfu של פאג T4 או ליזט רכב (מנורמל עבור רמות נפח ואנדוטוקסין). (ד, ה) (D) רמות T4 פאג' ו-(E) E. coli בכדוריות צואה שהחלימו לאחר חיסון עם 2 x 10² pfu, 2 x 10⁴ pfu או 2 x 10⁶ pfu של פאג T4. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ושגיאת תקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דיוק בפתרון בעיות במבחני פלאק. (A) טיטר ליזט פאג' T4 המשתמש בתרביות לילה או תת-תרביות של E. coli להכנת אגר רך (0.5% אגר, LB). תת-תרביות נעשו באמצעות דילול 1:50 של תרבית E. coli בן לילה לתוך LB טרי. 5 מ"ל של תכשירי אגר רך חוסנו עם 100 μL של E. coli ו 20 μL של T4 פאג. CaCl₂ ו- MgSO₄ לא נוספו לאגר רך עבור בדיקות אלה, אך ניתן להוסיף אותם במידת הצורך. תת-תרבית E. coli פעמים מתחת ל-2.8 שעות גרמו לירידה בכמות הפאגים הנראית לעין. (B) טיטר T4 פאג ליזט באמצעות צפיפויות E. coli שונות בהכנת אגר רך. הוספת נפחים שונים של E. coli מתרבית לילה (לא תת-תרבית, כמו ב-A) לתוך האגר הרך הביאה לרמות שונות של פאגים לכאורה. קווי שגיאה מייצגים אי-ודאות מחושבת של טיטר פאגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

חקר הפאגים במיקרוביום מהווה אתגר משמעותי בהשוואה למקביליהם החיידקיים. באופן ספציפי, פאגים אינם מכילים סמן פילוגנטי שמור המשותף לכל הפאגים בדומה לתת-היחידות הריבוזומליות 16S ו-18S המאפשרות את הקלות בריצוף ובזיהוי של מינים פרוקריוטים ואיקריוטים, בהתאמה⁴². עם זאת, עם ההתקדמות בגישות ריצוף הדור הבא, כולל הגדלת אורכי הקריאה, התפוקה והקטנת העלויות, מגיעה ההתרחבות המהירה של מאגרי גנום הבקטריופאג^'42,43,44. עם הרבה יסודות בגילוי פאגים בעיצומה, מחקר הפאגים נגיש כעת יותר מאי פעם. כחברים מרכזיים במיקרוביום המעי, ובאורגניזמים המגוונים ביותר מבחינה גנטית על פני כדור הארץ, פאגים מהווים זווית מרגשת למחקר חדש החוקר את מורכבות המיקרוביום. הפרוטוקולים המתוארים כאן מתמקדים בחקירת מיני פאגים ידועים בעכברים שהתיישבו עם חיידקי המטרה שלהם. יש לציין כי פרוטוקולים אלה מספקים קו מנחה לחקר פאגים in vivo וניתן להרחיב אותם עם צמיחת התחום.

מחקר הבקטריופאג'ים לטיפול בזיהומים חיידקיים יצא במידה רבה מהאופנה עם הופעת האנטיביוטיקה בשנות הארבעים. עם זאת, מרשם יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה האיצו את הופעתם של פתוגנים עמידים לתרופות מרובות כדאגה מרכזית לבריאות הציבור³. פאגים מהווים חלופה פוטנציאלית אטרקטיבית לאנטיביוטיקה, בשל רמת הספציפיות הגבוהה של המאכסן³. חשוב לציין, מאחר שפאגים תופסים מקום באופן טבעי כחברים במיקרוביום המעי האנושי, יש צורך להבין תחילה את התפקידים שפאגים ממלאים בסביבות מורכבות אלה. בעוד שמחקרים רבים חקרו את הקשר בין פאג' לבין חיידקי המטרה שלו במבחנה, חשוב לשקול כיצד היחסים האלה עשויים להחזיק מעמד בנוף של מערכת העיכול. כמו במחקרי גישוש שחקרו את המרכיבים החיידקיים של המיקרוביוטה, מודלים פשוטים של עכברים כמו GF ועכברים חד-מושבתיים מאפשרים לנו לבודד את ההשפעות של פאגים על מיני היעד שלהם, וכיצד הקשר הזה תורם לתגובה החיסונית. זהו צעד חשוב לקראת טיפול בפאגים, שכן ייתכן שחלק מהפאגים לא יועילו כאשר הם מוצגים למעיים. לדוגמה, הפאג Pseudomonas aeruginosa Pf4 מחמיר את המחלה הנגרמת על ידי המארח שלו, על ידי עיכוב הן תגובות חיסוניות אנטי-בקטריאליות והן נדידת קרטינוציטים, וכתוצאה מכך ריפוי פצעים לקוי^18,45. ההליכים המתוארים כאן נועדו לתקנן טכניקות לחקר פאגים כחברים במיקרוביוטה של מורין. בהמשך למחקרים חלוציים שחקרו את השפעת המיקרוביוטה על הפונדקאי המטזואני, המשך המחקר בפאגים בהקשר של המיקרוביוטה עשוי להיות מרגש ומשמעותי בהבנה הרחבה יותר של המולטיביום⁴⁶.

מגבלות
הפרוטוקולים המתוארים כאן עברו אופטימיזציה לחקר התחרות בין פאג T4 לבין חיידקי המטרה שלו, E. coli, כאשר פאג T4 ניתן על ידי gavage אוראלי לעכברי E. coli monocolonized. בדומה לחיידקים, מיני פאגים שונים מתנהגים באופן שונה זה מזה, ויש להם זמני שכפול שונים, גדלי התפרצויות וטווחים שונים של מטרות חיידקים⁴⁷. לכן, כאשר חוקרים זוגות פאגים-חיידקים אחרים במודלים דומים של בעלי חיים, יש להקפיד למטב את הפרוטוקולים האלה בכל השלבים. לדוגמה, פאגים עם זמן שכפול ארוך יותר ו/או גודל פרץ קטן יותר עשויים לדרוש דגירה ארוכה יותר עם המטרה החיידקית שלהם לייצור טיטר ליזט גבוה. באופן דומה, ייתכן שיהיה צורך להאריך את זמני הדגירה של הצלחת עבור בדיקות פלאק. יתר על כן, פאגים עם זמן שכפול קצר ו / או גודל פרץ גבוה עשויים לדרוש דגירות צלחת קצרות יותר, כמו דגירה לילה עלול לגרום לצמיחת יתר של פלאק. אם תנאי ההתפשטות אינם ידועים עבור פאג' מסוים של עניין, יש לבסס את היסודות לקביעת תנאי הגידול לפני תחילת עבודת in vivo ⁴⁸.

תחומים דמויי Ig הנמצאים בתוך חלבוני Hoc capsid של פאג T4 מאפשרים היצמדות לריר המעי¹¹. בהתאם ליכולת קשירת הריר של הפאגים הנבחרים, הקינטיקה של רמות חיידקי הפאגים בדגימות צואה עשויה להיות שונה מהתוצאות שמוצגות באיור 2B-E. לדוגמה, במערכות מעיים-על-שבב הוכח כי פאגים המכילים חלבוני Hoc שלמים הגדילו את יכולת ההרג של E. coli בהשוואה לפאג'¹¹ חסר Hoc. בעוד שקיים חשד כי פאגים מסוג T4 נשמרים באמצעות קשירת ריר in vivo 11,12,13, לא ניתן לשלול את ההשפעה של חיסון מחדש באמצעות התנהגות קופרופגית של עכברים. השפעות אלה יכולות להיות מופחתות על ידי שימוש בתחתיות כלוב תיל, או על ידי החלפת כלובים לעתים קרובות. מאחר שדומיינים דמויי Ig לא זוהו בפאגים⁴⁹ של ssDNA או RNA, יהיה מעניין להפריד בין האסטרטגיות האחרות שבהן משתמשים הפאגים כדי לשמור על מגורים בתוך רירית המעי.

לבסוף, מחקרי גישוש אלה בחנו אינטראקציות פאג'-חיידק-מארח בהומאוסטזיס בלבד. במודלים של מחלות בבעלי חיים לא ידוע כיצד שינויים בשלמות מחסום המעי, כמו למשל במחלת מעי דלקתית, עשויים להשפיע על אינטראקציות אלה. מחקרים אחרונים הראו כי Caudovirales פאגים הגבירו את העושר והמגוון בחולים עם IBD ^7,8. במודלים של עכברים, הוכח כי טיפול מתמשך בפאגים החמיר את הקוליטיס הניסיוני⁸ המושרה על ידי דקסטרן נתרן סולפט (DSS). עדיין לא ברור כיצד אינטראקציות פאג'-חיידק-מארח פועלות בסביבות דלקתיות, ואם שלמות מחסום לקויה מאפשרת דלקת הנגרמת על ידי פאגים.

פתרון בעיות ושיטות חלופיות

דגמי עכבר
מודלים של עכברים חד-מושבתיים מאפשרים חקירה של מין יחיד של חיידקים על הפיזיולוגיה של המאכסן¹⁶. מחקר שכלל עכברים חד-מושבתיים מילא תפקיד מכריע בהבהרת האופן שבו המיקרוביוטה משפיעה על מערכת החיסון²². כמערכת מודל, עכברים חד-מושבתיים אינם משחזרים את הפיזיולוגיה של עמיתיהם המיקרוביוטים הקונבנציונליים. בדומה יותר לעכברי GF, עכברי E. coli monocolonized יש ייצור ריר מופחת (בדומה לעכברי GF⁵⁰), ומערכת חיסון לא בוגרת²³. עם זאת, עכברים חד-מושבתיים היו יקרי ערך לפענוח ההשפעות הספציפיות של חיידקים של מינים בודדים על מערכת העיכול ועל התפתחות מערכת החיסון. דוגמה קלאסית היא התגלית כי חיידקים נימיים מפולחים (SFB) הם גורמים חזקים של CD4⁺ T עוזר 17 תאים בעכברים²⁴. בהתייחס לליחה, ישנן השפעות ספציפיות לחיידקים על שעתוק גנים של ריר⁵¹ועובי ריר⁵⁰. למרות שהם מוגבלים, עכברים חד-מושבתיים מספקים הזדמנויות לחקור את ההשפעה של זוג חיידקי פאגים אחד על הפונדקאי של היונקים במודל מבוקר. חשוב לציין שפאגים יכולים וצריכים להיחקר בהקשר של מיקרוביוטה מורכבת. בזמן כתיבת שורות אלה, מחקרים מעטים התייחסו להשפעות של טריפה של פאגים של מיני חיידקים קומנסליים בתוך מיקרוביום קונבנציונלי. זהו יישום עתידי של הפרוטוקולים המוצגים במאמר זה, אשר יכול להיות מותאם כדי להקל על מחקרים אלה.

שימוש בבקרות רכב מתאימות
בקרות מתאימות חיוניות בכל ניסוי. כאן הוגדר כלי מתאים למתן אוראלי לעכברים השולט בניקוי וטיהור רב-שלבי של גליזטים פאגים מסוג T4. דרישה חשובה היא שבקרת הרכב מכילה רמה שווה של אנדוטוקסינים חיידקיים כמו הפאג ליזט, כדי לשלוט בכל תגובה חיסונית בתיווך אנדוטוקסין. כלורופורם ו-1-אוקטאנול מתווספים לליזט כחלק מתהליך הטיהור ולאחר מכן מוסרים. כדי לשלוט בתגובות חיסוניות פוטנציאליות שעשויות להיווצר כדי לעקוב אחר רמות עקבות של כימיקלים אלה, ניתן לייצר ליזט חיידקי נטול פאגים כבקרת רכב. פאג T4 וליזטים של כלי רכב הכילו ריכוז נמוך מאוד של אנדוטוקסינים חיידקיים, הרבה מתחת לרמות המותרות במי שתייה²⁵ (איור 1B). ניתן להשתמש בבקרות חלופיות וניתן לשנות אותן כך שיתאימו לשאלת המחקר המיועדת. בפשטות, ניתן להשתמש במאגר פאגים המכיל כמות שווה ערך של אנדוטוקסין, אם כי זה לא לוקח בחשבון את תהליכי הניקוי והטיהור הרב-שלביים. Gogokhia et ^al.8דיווחו על שימוש בפאגים מומתים בחום כבקרה אם חלבון פאגים ללא דנ"א מספיק כדי לעורר תגובה חיסונית. בידיים שלנו, בפאגים מומתים בחום היו רמות נמוכות יותר של אנדוטוקסין מאשר בפאג' ליזט T4 (איור 1B), ולכן לא השתמשו בו כדי לשלוט ברמות האנדוטוקסין במחקר הזה. עם זאת, אנו מעודדים את הבדיקה של שני הפרוטוקולים כדי לקבוע איזו שיטה מתאימה ביותר למטרות ניסוי בודדות. אם הרכב וליזטים של פאג T4 שונים באופן משמעותי בכמות האנדוטוקסין הקיימת, ניתן להשלים את הליזט המכיל את הרמות הנמוכות יותר עם אנדוטוקסין מטוהר. 1-אוקטאנול מתווסף לליזטים במהלך תהליך הטיהור אך משבית את בדיקת ערכת הכימות של אנדוטוקסין כרומוגני. חשוב לבדוק את עיכוב המוצר על ידי חומרים שעלולים להפריע בדגימה כדי להבטיח שמדידות האנדוטוקסין מדויקות. אם יש חשד לעיכוב המוצר, ייתכן שהדגימה לא נשאבה במהירות מספיק זמן. אם הבעיות נמשכות, ניתן להשתמש בדיאליזה כדי להסיר את שאריות 1-אוקטאנול²⁵.

מסלול מתן ומינון
בשל יכולת קשירת הריר של פאג T4, מודלים של עכברים חוסנו במנה אחת של גבאג' פומי. מטרת זה הייתה לעקוב אחר משך החיים המשותפים של פאגים ואי קולי במערכת העיכול; עם זאת, דווח על גישות אחרות לחקר מודלים של פאגים in vivo. לדוגמה, מי שתייה מועשרים בפאגים שימשו כדי לספק אספקה רציפה של פאגים לעכברים ^8,20. היתרון של שיטת מתן זו הוא כי פאגים מתחדשים ללא הרף, אפילו בהיעדר מארח חיידקי, כפי שהודגם על ידי Gogokhia et al.⁸. תכנון ניסויי זה איפשר להעריך את התגובה החיסונית לפאגים בהיעדר חיידקים וסיפק גירוי חיסוני מתמשך במהלך הניסוי. מבחינה פיזיולוגית, שיטה זו אינה מייצגת מהלך טבעי של זיהום פאגים או התיישבות פאגים בסביבת מעיים, אך היא מספקת תובנות חשובות לגבי האופן שבו חשיפה חוזרת לפאגים עשויה להשפיע על מערכת החיסון. יש לכך משמעות בהקשר של פיתוח טיפול בפאגים, שכן קוקטיילים של פאגים עשויים להיות מועברים כטיפול לטיפול בזיהומים חיידקיים במעיים, בדומה למשטרי אנטיביוטיקה. בהקשר של זוג הפאגים-E קולי T4, נקבע כי הפחתת המינון של פאג T4 המופעל דרך הפה על עכברים חד-מושבתיים לא שינתה את רמות הפאגים או החיידקים בצואה (איור 2D, E). לכן, במקרה זה, מנת החיסון של פאג T4 אינה חיונית לשמירה על התיישבות יציבה של T4 פאג-E. קולי במעיים של עכברים דו-מושבתיים. יצוין כי המינון הנמוך ביותר שניתן היה 200 pfu / עכבר, והמינון הגבוה ביותר היה 2 x 10⁶ pfu / עכבר (לפי Hsu et al.) ². לכן, נתונים התומכים בפאג-E. קינטיקה של T4 coli מחוץ לטווח זה אינם זמינים במחקר זה.

טיטרים נקודתיים ושלמים של פאגים
לצורך מדידת רמות פאגים מסוג T4 בצואה וברקמות, הפרוטוקולים המתוארים כאן מסתמכים על טכניקות ציפוי נקודתיות ולא על בדיקות של לוחות שלמים, מה שעשוי לתרום לשונות ברמות הפאגים בין עכברים (איור 2B). בטכניקות של לוחות שלמים, לוחות נספרים על פני שטח גדול יותר, מה שמאפשר כימות מדויק יותר. עם זאת, דילול מתאים של כל דגימה חייב בדרך כלל להיקבע מראש על ידי ציפוי נקודתי. מכיוון שהדגימות נבדקו ביום איסוף הדגימות, ציפוי נקודתי נחשב לשיטה המתאימה ביותר לגישה בעלת תפוקה גבוהה יותר. לכן, הרזולוציה של נתונים אלה מיוצגת בצורה המדויקת ביותר על ידי סדר הגודל של פאגים בכל מדגם. עבור מדידות פאגים מדויקות, ישנם שיקולים נוספים עבור כל פאג. ניתן לקבל מדידות מדויקות יותר על ידי בדיקות לוחות שלמים, או על ידי שימוש בטווחי דילול טוריים קטנים יותר עבור כל דגימה. אם שיטות אלה עדיין גורמות לפאגים משתנים או לספירות חיידקי מטרה, יהיה זה נבון להעריך אם אינטראקציות ייחודיות בין הפאגים והחיידקים יכולות להסביר הבדלים בין עכברים בודדים באמצעות ריצוף מטאגנומי או שיטות אחרות להערכה ניסויית של אבולוציה משותפת ועמידות. לפי Bonilla et ^al.25, בעת הכנת אגר רך לבדיקות פלאק, חשוב להיות עקביים עם כמות הפונדקאי החיידקי שנוסף²⁵. כפי שניתן לראות באיור 3, אפילו שינויים קטנים יחסית בזמני תרבית החיידקים (איור 3A) ובצפיפות (איור 3B) יכולים להשפיע על הדיוק של בדיקות פלאק. ממצאים אלה עשויים להיות שונים עבור זוגות אחרים של חיידקי פאגים, וניסויים דומים מומלצים כאשר מתחילים עם אורגניזמים חדשים. בנוסף, עבור זוגות חדשים של חיידקי פאג'ים, יש לבצע ניסויי גישוש כדי לקבוע את מאפייני הצמיחה של כל אחד מהם. לדוגמה, ניתן לבצע עקומות גדילה כדי לקבוע את הפיגור, השלבים המעריכיים והנייחים, וקצב הצמיחה של החיידקים. ניסוי הגדילה החד-שלבי יכול לשמש לקביעת התקופה הסמויה (הזמן לליזה) וגודל הפרץ (מספר הפאגים המשתחררים על חיידק ליזה) של פאגים^52,53.

מדידת פאגים T4 חלופית על ידי qPCR
כימות פאגים יכול להתבצע באמצעות בדיקות פלאק, כפי שתואר לעיל, או באמצעות תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR). לשתי הגישות האלה יש הבחנה חשובה: מבחני פלאק קובעים את מספר הפאגים בני קיימא המסוגלים להדביק ולהרוג את המארחים החיידקיים שלהם, בעוד ש-qPCR מכמת חומר גנטי ספציפי לפאגים (כייצוג של מספר הפאגים הנוכחים), אך אינו מספק מידע על הכדאיות וההדבקה של הפאגים. qPCR בוצעו כדי להשוות את הכימות של עותקי גנים של פאגים עם פלאקים שנוצרו במבחני פלאק באמצעות פריימרים שתוארו על-ידי Hsu et ^al.2 (איור 4). דנ"א של פאג T4 הופק והוגבר מתכולת הצקאל של עכברים דו-מושבתיים מסוג T4 פאג'/E. coli . ברוב העכברים, בדיקות qPCR ופלאק זיהו רמות דומות של פאג T4 בתוכן הצקאלי (איור 4A, B). בעוד שהגברה מסוימת זוהתה בתכולת צק"ל מחוסנת ברכב, עותקי הגן המחושבים היו מתחת לגבול הזיהוי (LOD) (איור 4A). היעדר פאגים הניתנים לכימות בדגימות אלה אושר על ידי אלקטרופורזה בג'ל. תוצרי גנים של פאגים מסוג T4 (96 bp) הודגמו בקלות בדנ"א שבודד מתכולת הצקאל של עכברים מחוסנים ב-T4, אך נעדרו מבקרות הרכב (איור 4C).

בבדיקות האלה, עותקי גנים של פאגים מסוג T4 התגלו בתוכן הצקלי של עכבר אחד שהתיישב בפאגים T4 על-ידי qPCR (איור 4A, חץ), למרות חוסר היכולת לזהות T4 במבחני פלאק מאותה דגימה (איור 4B, חץ). תוצאות אלה מצביעות על כך שחלקיקים נגיפיים שאינם יוצרים פלאקים עשויים להופיע in vivo, בין אם כתוצאה מייצור של חלקיקים נגיפיים פגומים או אבולוציה משותפת של פאגים ו/או חיידקים. ניתן להשתמש בטכניקות ציפוי חיידקים על אגר קשה כדי לקבוע רגישות של חיידקים צואתיים לפאג'¹⁴. אנו מציעים כי זיהוי בתיווך qPCR עשוי להיות תוספת רבת ערך לתהליכי עבודה של פאגים in vivo מכיוון שהוא עשוי להיות עמיד יותר לאבולוציית פאגים בסביבת המעי בהתחשב בכך שהוא מכוון לרצפי גנים קצרים ושמורים. גישות לא מוטות כגון מטגנומיקה הן בעלות ערך לבחינת אבולוציה משותפת של פאג'ים-חיידקים ושפע יחסי, אך בסופו של דבר עשויות להיות יקרות יותר.

איור 4: זיהוי פאג T 4 על-ידי qPCR. (A,B) עומסי פאגים מסוג T4 נמדדו באמצעות (A) בדיקת qPCR מוחלט או (B) פלאק בתכולת הצקאל של עכברי E. coli C57BL/6 ביום ה-29 לאחר החיסון בפאג T4 או ברכב. החץ מציין תוצאות של עכבר בודד שהיו לו עותקי גנום T4 הניתנים לזיהוי, אך לא וירוס סביר בתוכן צקלי. (C) אלקטרופורזה בג'ל של מוצרי PCR המראה נוכחות של רצועת 96 bp בדגימות צקאל מחוסנות בפאגים T4, אך לא בדגימות מחוסנות לרכב. נעשה שימוש בסולם DNA של 100 bp. LOD = מגבלת זיהוי. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ו- SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

יישומים
בקטריופאג'ים מייצגים למעלה מ-90% מהחלקיקים דמויי הנגיף הנמצאים במיקרוביום⁴⁴; עם זאת, ההשפעה של פאגים על מיקרוביום המעי אינה מובנת היטב. מחקרים ראשוניים שחקרו את המרכיב החיידקי במיקרוביום עשו זאת על ידי בידוד זנים מסוימים, ובחינת השפעתם על הבשלת מערכת החיסון^22,24. חקירות דומות של הפאגאום מציבות משימה מרתיעה אך הכרחית, ודרישה להבנה מקיפה של המולטיביום⁴⁶. בעוד שהמיקוד של פיתוח טיפול בפאגים נוטה להיות מכוון לריפוי זיהומים חיידקיים ספטיים (septic חיידקים), חשוב להבין כיצד הוספת קוקטייל פאגים למערכת העיכול עשויה לשנות את המערכת האקולוגית של המעי. יתר על כן, יש להעריך את בטיחותם של קוקטיילים טיפוליים בפאגים על ידי יצירת פרופיל חיסוני. פאגים נחקרו כטיפולים פוטנציאליים לזיהומים חיידקיים במעיים כגון C. difficile⁵ ו- Salmonella enterica serovar Typhimurium⁵⁴. מחקרים אחרונים הוכיחו גם כי FFTs יעילים באותה מידה או יותר בטיפול באנטרוקוליטיס נמקית בפגים⁹, דבר המצביע על כך שהמרכיב הנגיפי של השתלות מיקרוביוטה צואתית (FMTs) עשוי למלא תפקיד פעיל בהפחתת מחלות. מחקרים מתמשכים שחוקרים את תפקיד הפאגים במיקרוביום נחוצים כדי לקדם את הפיתוח של טיפולי פאגים נגד פתוגנים במעי, אבל גם כדי ליידע טוב יותר FMT כטיפול במחלות. על ידי סטנדרטיזציה של שיטות לחקר פאגים in vivo, השקיפות והשכפול במחקר הפאגים יוגדלו, יחד עם הדרכה לאלה המרחיבים את עבודתם למודלים של עכברים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-אוקטנול (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 מ"ל PES Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליות	Millipore Sigma
אגרוז (דרגת EEO נמוכה/רב-תכליתית/ביולוגיה מולקולרית)	פישר ביו-ריאגנטים	BP160-500
Amicon® מכשיר מסנן צנטריפוגלי 100kDa Ultra-15, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® צינורות, SST	BD Medical	365967
כלובים אטומים להדרה ביולוגית (כלובי ISO)	טצ'יפלסט	1245ISOCAGE
C1000 מגע וסחר; Thermal Cycler עם מודול תגובה מהירה 96 בארות	BioRad	1851196
סידן כלוריד דיהידראט (גבישים לבנים לאבקה)	Fisher BioReagents	BP510-500
מנעולי כובע לצינור 1.5 מ"ל 100/pk	Andwin Scientific
כלורופורם (אתנול כחומר משמר/ACS מאושר)	Fisher	C298-500
חרוזי פלדה מצופים נחושת (4.5 מ"מ)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & ערכת טישו (50)	תרמו סיינטיפיק	69504
DreamTaq ירוק PCR מאסטר מיקס (2X)	תרמו סיינטיפיק	K1081
תמיסת מלח דיסודיום חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), לביולוגיה מולקולרית, 0.5 מ' ב-H2O	Sigma Aldrich	E7889
פישר ביו-ריאגנטים וסחר; אגר, אבקה / פתיתים, פישר ביו-ריאגנטים וסחר;	פישר ביו-ריאגנטים	BP1423-500
פישר ביו-ריאגנטים וסחר; מיקרוביולוגיה מדיה: LB Broth (אבקה) - Lennox	פישר ביוריאגנטים	BP1427-500
GeneRuler 100 bp סולם DNA	Thermo Scientific	SM0241
ירוק FastMix® תערובת qPCR, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
מסנני HEPA למכסי איזוקאז', מסנני H14 הניתנים לחיטוי עבור קו ISO	- מוקרן Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
מגנזיום סולפט heptahydrate	פישר BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 שייקר מודגר	Thermo Scientific	8354-30-0009
מיקרוביולוגיה מדיה: מרק LB (אבקה) - לנוקס	פישר ביו-ריאגנטים	BP1427-500
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה הצמד נעילה, 2 מ"ל	פישר	14-666-315
סרט איטום פרפילם	Bemis	PM-996
מלאי פאג'ים	Carolina Biological Supply	לא ישים PicoLab
® דיאטת עכבר 20 EXT	LabDiet	5R58
פירס וסחר; ערכת אנדוטוקסין כרומוגנית Thermo	Scientific
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
סט DNase נטול RNase	Qiagen	79254
נתרן ביקרבונט (אבקה לבנה עדינה)	פישר כימיקל	BP328-500
נתרן כלורי (גבישי/מוסמך ACS)	פישר כימיקל	S271
סוניקטור (דגם בדיקה CL-18; מקור כוח דגם FB50)	פישר ריחני	n/a
מבודד סרט גמיש סטרילי	מחלקה נקייה ביולוגית	לא SYBR&TRADE
; כתם ג'ל DNA בטוח	Invitrogen	S33102
T100 מחזור תרמי	BioRad	1861096
פריימר פאג'ים T4, קדימה (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
פריימר פאג'ים T4, קדימה (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	קיאגן	85300
Tris-HCl, תמיסה 1M, pH 8.0, דרגת ביולוגיה מולקולרית, Ultrapure	Thermo Scientific
AAJ22638AE מים, (ללא DNASE, RNASE)	פישר ביו-ריאגנטים	BP2484100