בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

Summary

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

Abstract

תמלול מאפשר לקבל תובנות מקיפות על תוכניות סלולריות ותגובותיהן להפרעות. למרות ירידה משמעותית בעלויות הייצור והריצוף של ספריות בעשור האחרון, יישום טכנולוגיות אלה בהיקף הדרוש לסינון תרופות נותר יקר מאוד, וחוסם את הפוטנציאל העצום של שיטות אלה. המחקר שלנו מציג מערכת חסכונית לבדיקת תרופות מבוססת תמלול, המשלבת תרביות הפרעה ממוזערות עם מיני-תמלול בתפזורת. פרוטוקול המיני-צובר הממוטב מספק אותות ביולוגיים אינפורמטיביים בעומק ריצוף חסכוני, ומאפשר סינון נרחב של תרופות ידועות ומולקולות חדשות. בהתאם לזמן הטיפול והדגירה שנבחר, פרוטוקול זה יביא לספריות רצף תוך כיומיים. בשל מספר נקודות עצירה בפרוטוקול זה, הכנת הספרייה, כמו גם הרצף, יכולים להתבצע ללא תלות בזמן. עיבוד בו זמנית מספר גבוה של דגימות אפשרי; מדידה של עד 384 דגימות נבדקה ללא אובדן איכות הנתונים. כמו כן, לא ידועות מגבלות על מספר המצבים ו/או התרופות, למרות שלוקחים בחשבון את השונות בזמני הדגירה האופטימליים של התרופה.

Introduction

פיתוח תרופות חדשות הוא תהליך מורכב וגוזל זמן הכולל זיהוי תרופות פוטנציאליות ומטרותיהן, אופטימיזציה וסינתזה של תרופות מועמדות ובדיקת יעילותן ובטיחותן בניסויים פרה-קליניים וקליניים¹. שיטות מסורתיות לסינון תרופות, כלומר, הערכה שיטתית של ספריות של תרכובות מועמדות למטרות טיפוליות, כוללות שימוש במודלים של בעלי חיים או בדיקות מבוססות תאים כדי לבחון את ההשפעות על מטרות או מסלולים ספציפיים. בעוד ששיטות אלה הצליחו לזהות מועמדים לתרופה, לעתים קרובות הן לא סיפקו תובנות מספקות לגבי המנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס יעילות התרופה וגם רעילות ומנגנונים של תופעות לוואי אפשריות.

הערכת מצבי שעתוק כלל גנומיים מציגה גישה רבת עוצמה להתגברות על המגבלות הנוכחיות בבדיקת תרופות, שכן היא מאפשרת הערכה מקיפה של ביטוי גנים בתגובה לטיפולים תרופתיים². על ידי מדידת תעתיקי RNA באופן כלל גנומי המתבטא בזמן נתון, שעתוק שואפת לספק מבט הוליסטי על שינויי השעתוק המתרחשים בתגובה לתרופות, כולל שינויים בדפוסי ביטוי גנים, שחבור חלופי וביטוי RNA לא מקודד³. ניתן להשתמש במידע זה כדי לקבוע מטרות לתרופות, לחזות יעילות ורעילות של תרופות ולמטב את מינון התרופות ואת משטרי הטיפול.

אחד היתרונות המרכזיים של שילוב תמלול עם סינון סמים בלתי משוחד הוא הפוטנציאל לזהות מטרות סמים חדשות שלא נלקחו בחשבון בעבר. גישות קונבנציונליות לסינון תרופות מתמקדות לעתים קרובות במולקולות מטרה או מסלולים מבוססים, מעכבים את זיהוי המטרות החדשות ועלולים לגרום לתרופות עם תופעות לוואי בלתי צפויות ויעילות מוגבלת. Transcriptomics יכול להתגבר על מגבלות אלה על ידי מתן תובנות לגבי השינויים המולקולריים המתרחשים בתגובה לטיפול תרופתי, חשיפת מטרות פוטנציאליות או מסלולים שאולי לא נחשבו בעבר².

בנוסף לזיהוי מטרות תרופות חדשות, ניתן להשתמש בתמלול גם כדי לחזות יעילות ורעילות של תרופות. על ידי ניתוח דפוסי ביטוי הגנים הקשורים לתגובות לתרופות, ניתן לפתח סמנים ביולוגיים שניתן להשתמש בהם כדי לחזות את תגובת המטופל לתרופה מסוימת או למשטר טיפול מסוים. זה יכול גם לעזור לייעל את מינון התרופה ולהפחית את הסיכון לתופעות לוואי שליליות⁴.

למרות היתרונות הפוטנציאליים שלה, עלות התמלול נותרה מחסום משמעותי ליישומה הנרחב בסינון תרופות. ניתוח תמלול דורש ציוד מיוחד, מומחיות טכנית וניתוח נתונים, מה שיכול להקשות על צוותי מחקר קטנים יותר או ארגונים עם מימון מוגבל להשתמש בתמלול בסינון תרופות. עם זאת, עלות התמלול יורדת בהתמדה, מה שהופך אותה לנגישה יותר לקהילות המחקר. בנוסף, התקדמות הטכנולוגיה ושיטות ניתוח הנתונים הפכו את התמלול ליעיל וחסכוני יותר, והגדילו עוד יותר את נגישותו².

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת רב-ממדית וחקרנית לבדיקת תרופות מבוססת תמלול, המשלבת תרביות הפרעה ממוזערות עם ניתוח תמלול בתפזורת^{קטנה 5,6}. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להפחית את העלות לדגימה ל -1/^{6 מהעלות} הנוכחית של פתרונות מסחריים לריצוף mRNA באורך מלא. הפרוטוקול דורש רק ציוד מעבדה סטנדרטי, כאשר היוצא מן הכלל היחיד הוא השימוש בטכנולוגיות ריצוף בקריאה קצרה, שניתן לבצע במיקור חוץ אם מכשירי ריצוף אינם זמינים בתוך החברה. פרוטוקול המיני-צובר הממוטב מספק אותות ביולוגיים עשירים במידע בעומק ריצוף חסכוני, ומאפשר סריקה נרחבת של תרופות ידועות ומולקולות חדשות.

מטרת הניסוי היא לסנן פעילות תרופתית על PBMCs בהקשרים ביולוגיים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל שאלה ביולוגית שבה מספר תרופות צריכות להיבדק עם קריאה תמלולית, נותן מבט רחב על התעתיק של ההשפעה התאית של הטיפול.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות ועדות האתיקה המקומיות של אוניברסיטת בון.

1. הכנת חוצצים, פתרונות וציוד

1. הכן את הפתרונות ואסוף את החומרים המתוארים בטבלת החומרים.
2. חממו את אמבט המים ל-37°C וחממו את מדיום הגידול המלא (RPMI-1640 + 10% סרום עגל עוברי (FCS) + 1% פניצילין/סטרפטומיצין).
3. לקצירת תאים, השתמשו במי מלח חוצצי פוספט קר כקרח (PBS).
   הערה: שמור על סביבה נקייה בעת עבודה עם תאים כדי לשמור על סטריליות.

2. טיפול בתאים

הערה: פרוטוקול מפורט לשימור בהקפאה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) מדם אנושי ניתן למצוא^ב-7.

1. הפשרת תאים וספירה
   1. הסר את cryovials מחנקן נוזלי והפשיר אותם באמבט מים ב 37 ° C במשך 2 - 3 דקות תוך היפוך עדין.
   2. מעבירים את התאים המופשרים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
   3. לשטוף את cryovial עם 1 מ"ל חם להשלים מדיום הצמיחה ולהוסיף פתרון זה טיפה לתאים בצינור (1 שלב דילול^רחוב ).
   4. חזור על הדילול ביחס של 1:1 עד לקבלת נפח של 32 מ"ל (סה"כ 5 דילולים עם 1, 2, 4, 8 ו-16 מ"ל בהתאמה של מדיום גידול מלא חם). הוסף את טיפת המדיום כדי להפחית את הפרעות התא תוך כדי התסיסה קלה של הצינור החרוטי.
   5. צנטריפוגו את מתלה התא למשך 5 דקות (300 x גרם, 20°C) והוציאו את הסופרנאטנט על ידי הטייה עדינה של הצינור החרוטי בתנועה שוטפת אחת.
   6. להשהות מחדש את התאים ב 3 מ"ל של מדיום צמיחה מלא חם ולהמשיך עם ספירת תאים.
   7. לצורך ספירה, ערבבו 10 μL של תרחיף תאים עם Trypan Blue (דילול 1:2 עד 1:10 בהתאם לצפיפות תרחיף התא) כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים בזמן הספירה. תאים מתים או פגומים ייראו כחולים עקב ספיגת הצבע, בעוד תאים חיוניים אינם מוכתמים.
      הערה: Trypan Blue הוא מעט ציטוטוקסי, תאים מוכתמים לא צריך להיות מאוחסן במשך יותר מ 5 דקות.
   8. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או תא ספירה באמצעות 10 μL של תמיסת תאים מוכתמים.
      1. בעת שימוש בתא התא המשופר על ידי נויבאואר, ספור את כל התאים בתוך ארבעת הריבועים הגדולים הממוקמים בפינות והשתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את ריכוז תרחיף התא.
         
   9. לדלל את התאים לריכוז סופי של 1 x 10⁶ תאים / מ"ל עם מצע צמיחה מלא חם. צנטריפוגה רק אם הנפח הנדרש נמוך מ -3 מ"ל ולהשעות מחדש את גלולת התא לנפח הנכון.
2. זריעת תאים וטיפול בהם
   1. זרע 100 μL של תרחיף תאים לכל באר בצלחת תרבית תאים 96 באר (1 x 10⁵ תאים / באר).
      הערה: מספר התא לזריעה עבר אופטימיזציה לתרביות PBMC. בעוד שריכוזי תאים נמוכים לא יניבו כמות מספקת של RNA לריצוף, מספר מוגזם של תאים יגדיל את הסיכון לליזה תת-אופטימלית של התא ולעיכוב תגובת השעתוק ההפוך.
   2. הכינו דילול תרופות בריכוז גדול פי שניים מזה המשמש לטיפול (פי 2). בחר את הממס על פי מסיסות של התרכובת, רצוי מדיום צמיחה מלא.
      הערה: PBS או dimethyl sulfoxide (DMSO) ניתן להשתמש אם לא ניתן להגיע למסיסות מספקת אחרת. הריכוז המרבי של DMSO בנפח הדגירה המתקבל לא יעלה על 0.5% כדי למנוע ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי הממס.
   3. מוסיפים 100 μL של דילול התרופה 2x (ריכוז סופי בבאר 1X) ודגרים ב 37 ° C למשך הזמן שהוגדר.
      הערה: יש לבצע חקירות משלימות על מנת לקבוע את זמן הדגירה האופטימלי של התרופה ולשלול מנגנונים פוטנציאליים של ציטוטוקסיות.
3. קצירת תאים וליזיס
   1. צנטריפוגה את צלחת תרבית התא במשך 10 דקות (300 x גרם, 20 ° C). הסירו בעדינות את הסופרנאטנט בעזרת משאבת ואקום תוך שמירה על הצלחת בזווית (30°-45°) תוך כיוון הקצה לפינה הנמוכה של הבאר כדי להסיר כמה שפחות תאים.
   2. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של PBS קר כקרח לכל באר וצנטריפוגו את הצלחת למשך 5 דקות (300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס). הסר את supernatant עם משאבת ואקום, שוב, שמירה על הצלחת בזווית חדה כדי להסיר PBS ככל האפשר.
   3. הכן את מאגר הליזיס כמתואר בטבלה 1 עבור מספר התגובות (rxn) הדרושות, תוך הוספת עודף של 10%.
   4. הוסף 15 μL של חיץ ליזיס לכל באר ואטם את הצלחת עם סרט איטום דבק כדי להגן על הדגימות מפני זיהום. מערבבים את הצלחת לפני הצנטריפוגה למשך דקה אחת (1000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס) ודגרים במשך 5 דקות על קרח.
   5. לאסוף 6 μL של תמיסת תאים lysed בצלחת PCR ולהקפיא את התא lysate ב -80 ° C כדי להבטיח ליזה התא אופטימלי. הקפידו להימנע ממחזורי הקפאה מרובים של הצלחות.
      הערה: נקודת עצירה: אם ייצור cDNA אינו מתבצע לאחר מכן, התא ליזט יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C עד מספר חודשים ללא ירידה ניכרת באיכות RNA.

3. הכנת הספרייה לרצף

1. תגובת שעתוק לאחור (RT)
   הערה: בעת עבודה עם RNA, הניחו את כל הדגימות על קרח והקפידו להשתמש בציוד ללא נוקלאז (כלי פלסטיק סטריליים חד פעמיים) ובמים.
   1. הכינו את תמהיל תגובות RT כמתואר בטבלה 2 למספר התגובות הדרושות, והוסיפו 10% עודף. מערבלים לרגע את התערובת ותוך זמן קצר מסובבים אותה. שומרים את התערובת על קרח עד לשימוש.
   2. הפשירו את הליזט התא בטמפרטורת החדר (RT) וסובבו אותו לזמן קצר כלפי מטה כדי לאסוף את כל הליזט התא בתחתית הצלחת.
   3. בצע דנטורציה mRNA על thermocycler לפי טבלה 3.
   4. הוציאו את הצלחת מהתרמוסייקלר וסובבו אותה תוך זמן קצר כדי לאסוף עיבוי פוטנציאלי. הוסיפו 6 μL של תערובת תגובת RT לכל באר לקבלת נפח סופי של 12 μL. אטמו את הצלחת כדי להגן על הצלחת ולמנוע אידוי, מערבולות וסובבו אותה.
   5. הניחו את הצלחת על התרמוסייקלר והתחילו את תוכנית תגובת RT לפי טבלה 3.
2. טרום הגברה
   1. הפשירו את ה-DNA פולימראז באיכות גבוהה ואת פריימר ה-PCR (ISPCR) באתרו בטמפרטורת החדר.
   2. הכינו את תמהיל ההגברה מראש לפי טבלה 4 למספר התגובות הדרושות, והוסיפו 10% עודף. מערבלים לרגע את התערובת ומסובבים אותה.
      הערה: תערובת האנזימים יציבה בטמפרטורת החדר למשך שעות.
   3. סובבו את צלחת ה-PCR, הוסיפו 15 מיקרוליטר של תערובת קדם-הגברה לכל באר ואטמו את הצלחת.
   4. הניחו אותו על התרמוסייקלר והתחילו את תגובת קדם-ההגברה לפי טבלה 5.
      1. התאם את מספר המחזורים עקב תכולת RNA. התחל עם מספר נמוך יותר והגדל אם תפוקת cDNA אינה מספקת.
         הערה: מניסיוננו, יש לקבוע מספר אופטימלי של מחזורים לכל סוג תא, מצב הניסוי והטיפול לא ישפיעו על מספר המחזורים האופטימלי. לכן, אנו ממליצים לקבוע את מספר המחזורים האופטימלי באופן ניסיוני בעת קביעת פרוטוקול זה עבור סוג תא חדש. באופן כללי, תאים ראשוניים ידרשו מספר רב יותר של מחזורים בהשוואה לשורות תאים. נקודת עצירה: ניתן לאחסן את מוצר ההגברה מראש ב- 20 מעלות צלזיוס.
3. ניקוי ובקרת איכות cDNA (QC)
   הערה: ניקוי הדגימה יכול להתבצע ברצף עבור כל צלחת מכיוון שהדגימות יציבות למדי בשלב זה. הגדלת מספר הדגימות תוביל למשך זמן ארוך יותר של הפרוטוקול אך לא תגביל את מספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית.
   1. לפני שמתחילים, הביאו את חרוזי הטיהור המגנטי לטמפרטורת החדר ומערבלים במהירות גבוהה למשך דקה אחת כדי להשהות מחדש את החרוזים במלואם.
   2. הוסיפו חרוזי טיהור מגנטיים 0.8x v/v (20 μL) לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   3. הניחו את לוחית ה-PCR על מדף מגנטי למשך 5 דקות עד להפרדה מלאה בין החרוזים. הסר את supernatant בזהירות.
   4. שומרים את הצלחת על המדף המגנטי, מוסיפים בעדינות 100 μL של 80% אתנול טרי שהוכן כדי לשטוף את החרוזים ולדגור במשך 30 שניות. השתמש פיפטה נפח קטן כדי להסיר את supernatant. חזרו על הפעולה לשלב שטיפה נוסף. הקפד להסיר אתנול רב ככל האפשר.
   5. יבשו באוויר את החרוזים על המדף המגנטי בטמפרטורת החדר למשך עד 5 דקות עד שהאתנול יתאדה במלואו והחרוזים כבר לא ייראו מבריקים.
   6. הסר את הצלחת מהמדף המגנטי, השהה מחדש את החרוזים ב -20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ודגור למשך 2 דקות.
   7. הניחו את הצלחת שוב על המדף המגנטי עד להפרדת החרוזים.
   8. לשחזר את eluate בצלחת PCR חדשה עבור cDNA QC ותיוג.
   9. בצע בדיקת TapeStation או FragmentAnalyser כדי להעריך את התפלגות הגודל והריכוז של ספריית cDNA (מומלץ: בדיקת TapeStation D5000). לקבלת פרטים, עיין בהוראות היצרן. יש לצפות ליבול טיפוסי של 20 ננוגרם.
4. תיוג עם ערכה
   הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקולי תיוג אחרים אם כבר הוקמו.
   1. לדלל את cDNA לריכוז סופי של 150 - 300 pg/μL באמצעות מים נטולי נוקלאז.
   2. תכנת מראש את התרמוסייקלר לפי טבלה 6 כדי להבטיח התחלה מיידית של תגובת התיוג לאחר הוספת cDNA לתערובת האנזימים.
   3. הכינו את תמהיל התיוג לפי טבלה 7 למספר התגובות הדרושות, והוסיפו 10% חריגה.
   4. יש להוציא 3 μL של תערובת התיוג לכל תגובה על צלחת PCR חדשה ולהוסיף 1 μL של cDNA לכל תגובה.
   5. התחל את תגובת התיוג מיד לאחר הוספת cDNA.
   6. נטרל את התגובה על ידי הוספת 1 μL של מאגר תג נטרול (NT; לחלופין, ניתן להשתמש ב- 0.2% נתרן דודציל סולפט (SDS).
5. PCR העשרה
   1. הכינו את תמהיל ה-PCR להעשרה טבלה 7 למספר התגובות, והוסיפו 10% עודף. (מומלץ: ערכת Nextera UDI למניעת דילוג אינדקס על תאי זרימה בתבנית (למשל, Illumina NovaSeq 6000)).
   2. הוסף 9 μL של תערובת PCR העשרה לכל תגובה עבור נפח כולל של 14 μL.
   3. הפעל את תוכנית ה-PCR להעשרה לפי טבלה 8.
      הערה: עבור PCR העשרה, 16 מחזורים הם סטנדרטיים. אם איכות cDNA ירודה, ניתן להוסיף מחזורים נוספים.
6. ניקוי ובקרת איכות
   1. לפני שמתחילים, הביאו חרוזי טיהור מגנטיים לטמפרטורת החדר וערברו במהירות גבוהה למשך דקה אחת כדי להשהות מחדש את החרוזים במלואם.
   2. מוסיפים 1.0x v/v (14 μL) חרוזי טיהור מגנטיים ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   3. הניחו את הצלחת על מדף מגנטי והמתינו 5 דקות עד שהחרוזים מופרדים לחלוטין. הסר את supernatant בזהירות.
   4. שומרים את הצלחת על המדף המגנטי, מוסיפים בעדינות 100 μL של 80% אתנול טרי שהוכן כדי לשטוף את החרוזים ולדגור במשך 30 שניות. השתמש פיפטה נפח קטן כדי להסיר את supernatant. חזרו על הפעולה לשלב שטיפה נוסף. הקפד להסיר אתנול רב ככל האפשר.
   5. יבשו את החרוזים באוויר בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות או עד שהם כבר לא נראים מבריקים.
   6. הסר את הצלחת מהמדף המגנטי, השהה מחדש את החרוזים ב -20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ודגור למשך 2 דקות.
   7. הניחו את הצלחת שוב על המדף המגנטי עד שהחרוזים ייפרדו ושחזרו את הפליט בצלחת PCR חדשה עבור בקרת איכות בספרייה.
   8. בצע בדיקת TapeStation או Fragment Analyzer כדי להעריך את התפלגות הגודל והריכוז של ספריית cDNA (מומלץ: בדיקת רגישות גבוהה TapeStation D1000). לקבלת פרטים, עיין בהוראות היצרן. בממוצע, יש לצפות ליבול של 10 ננוגרם.
      הערה: נקודת עצירה: ניתן לאחסן את מוצר ה- PCR ב- 20 °C.

4. רצף ועיבוד מראש של נתונים

1. רצף
   הערה: ההנחיה הבאה תחול על כל מכשירי Illumina לריצוף בקריאה קצרה. אם המכשור אינו זמין, ניתן לבצע את הריצוף על ידי מתקן ריצוף חיצוני. ניתן להשתמש גם בגישות ריצוף אחרות. לשם הפשטות, בחרנו לדווח על טכנולוגיית הריצוף הנפוצה ביותר בלבד.
   הערה: השלבים הבאים הקשורים לשימוש בתוכנה מתארים את ההליך ברצף Illumina NovaSeq6000.
   1. מאגר ספריות אינדקס ייחודיות ביחס שווה משקל בהתאם לתוצאות שהתקבלו בשלב 3.6.8.
   2. מדוד את ריכוז המאגר הסופי עם בדיקת רגישות גבוהה כדי לחשב את טוחנות הדגימה באופן הבא:
      
   3. טען את תא הזרימה בהתאם למפרט המכשיר ולאופטימיזציה ניסיונית. דוגמאות לריכוזי העמסה של מכשירים נפוצים מוצגות בטבלה 9.
   4. על ידי נגיעה במסך בחר רצף כדי להתחיל את הגדרת ההפעלה.
   5. בצע את ההוראות שעל המסך וטען תא זרימה, מחסנית רצף אחר סינתזה, מחסנית אשכולות, מחסנית מאגר וודא שמיכלי הפסולת ריקים.
   6. לאחר שכל הריאגנטים זוהו על ידי המכשיר, לחץ על הפעל התקנה. הגדר כאן את שם ההפעלה ואת תיקיית הפלט לאחסון הנתונים.
   7. הגדר את פרטי הרצף כזוג עם שתי קריאות של 51 bp. שתי קריאות אינדקס מסודרות גם הן ברצף של 8 bp כל אחת.
   8. לחץ על סקירה ולאחר בדיקה אם כל פרטי הרצף נכונים לחץ על התחל הפעלה.
      הערה: עומק הרצף המומלץ הוא 5 x 10⁶ קריאות לדגימה, עם מינימום 1 x 10⁶ קריאות לדגימה.
2. עיבוד מקדים של נתונים
   1. המר נתוני רצף גולמיים לפורמט FASTQ ו- demultiplex בהתאם לאינדקסים לדוגמה באמצעות הכלי Bcl2Fastq2. בצע demultiplexing עם הגדרות ברירת המחדל. לקבלת הוראות מפורטות על Bcl2Fastq2, עיין במדריך העיון.
      הערה: המרת FASTQ וריבוי מבוצעים בדרך כלל על ידי מתקן הריצוף אם הרצף אינו מבוצע בתוך הבית. מתקני ריצוף יספקו בדרך כלל FASTQ מרובה לעיבוד נוסף.
   2. קיימות מספר אפשרויות ליישור נתונים וכימות שפע של קריאות רצף (מומלץ: צינור RNA-seq של ליבת nf (https://nf-co.re/rnaseq)). הצינור מספק מספר אפשרויות, השתמש בהגדרת ברירת המחדל עם STAR⁸ מיושר וסלמון⁹ כדי לכמת את שפע התמלול.
   3. הערה: לניתוח ביואינפורמטיקה נוסף, קיימות מספר שיטות. זה לא במסגרת פרוטוקול זה לכסות את כל (מומלץ: צינור DEseq2¹⁰). סקריפט סטנדרטי המבוסס על זרימת העבודה DEseq2 שפותחה על ידינו ניתן למצוא ב- GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Results

בעקבות הפרוטוקול המדווח, PBMCs אנושיים נזרעו, טופלו בתרופות אימונומודולטוריות שונות, ולאחר זמני דגירה שונים, נקטפו לצורך ניתוח שעתוק בתפזורת באמצעות פרוטוקול הריצוף (איור 1).

יש לזהות ריכוזי תרופות אידיאליים וזמני דגירה של תרכובות בדיקה במעלה הזרם פרוטוקול זה בעזרת אסטרטגיות ניסוי משלימות ובהתבסס על השאלה המדעית הספציפית. ברוב המקרים, דגירה של 2 - 4 שעות ו -24 שעות צריכה לספק ייצוג של תגובות שעתוק מוקדמות ומאוחרות לטיפול.

התוצאות החשובות ביותר להערכת הביצוע הנכון של הפרוטוקול הן cDNA ו-QC של ספריות (איור 2 ואיור 3). פרופיל cDNA צריך להיות בעל התפלגות רחבה עם גודל ממוצע של > 1000 bp (איור 2), גודל ממוצע נמוך יותר או הצטברות של מולקולות במשקל מולקולרי נמוך (איור 4) עשויים להצביע על קלט RNA נמוך או התפרקות RNA.

הכנת ספריית רצף טובה היא גם צעד חשוב בפרוטוקול; לספריות שלאחר התיוג צריכה להיות התפלגות צרה למדי של כ-250 bp (איור 3); מקטעים ארוכים יותר ישיגו ביצועים גרועים במהלך הריצוף (איור 5).

לאחר הריצוף, קובצי FASTQ גולמיים מיושרים כנגד גנום הייחוס המתאים (למשל, אדם או עכבר) ושפע התעתיק מכומת עבור כל דגימה (ראה צינור RNA-seq של ליבת nf (https://nf-co.re/rnaseq)). ניתוח נתונים גישוש יבוצע כעת כדי לבדוק את האיכות הכוללת של הנתונים. נתונים מיושרים אמורים ללכוד מספר גבוה של גנים המקודדים חלבונים, מאחר שרק רנ"א רב-אדניל יילכד באמצעות פרוטוקול זה (איור 6A). בדגימות אנושיות אנו מצפים ללכוד בין 15000 ל -20000 תעתיקים (ערך זה מבוסס על GENCODE 27 reference human genome annotation¹¹). ניתוח נתונים גישוש נוסף עשוי לכלול ניתוח רכיבים עיקריים (PCA). כאן, המבנה הבסיסי של הנתונים ניתן להמחיש מגרש דו מימדי. באיור 6B אנו מראים תרשים PCA לדוגמה; הנקודות כאן צבועות על ידי טיפול, ומראות שלושה אשכולות שונים של תנאי ניסוי המובילים לפרופילים שעתוק דומים. ניתן גם לראות כאן כי שכפולים ביולוגיים (נקודות באותו צבע) דומים בתעתוק, מה שמראה עמידות טובה של הפרוטוקול. התוצאות המוצגות באיור זה נוצרו עם pipeline זמין ב- GitHub בהתבסס על זרימת העבודה של DESeq2 (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

איור 1: הערכות זמן וזרימת עבודה. (A) הערכות זמן של פרוטוקול זה עבור ריצה עם 96 דגימות. (B) דיאגרמה של כל שלב בפרוטוקול מהפשרת התאים ועד לעיבוד מקדים של הנתונים. יש לקרוא את התרשים מלמעלה למטה בעקבות החצים. חצים מעוגלים מתארים חזרה על הצעד. נקודות אדומות מייצגות נקודות עצירה המתוארות בהמשך הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות לדוגמה עבור ספריות cDNA. תוצאות אלקטרופורזה ממוזערת המראות את התפלגות הגודל של ספריית cDNA מופתית. אותות עליונים ותחתונים מייצגים סמנים המשמשים ליישור הדגימה. קווים כחולים מציינים את גודל השברים הממוצע (סוגריים כחולים). פרופיל cDNA מראה התפלגות רחבה בגודל ממוצע של > 1000 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים 3: תוצאות לדוגמה עבור ספריות ריצוף. תוצאות אלקטרופורזה ממוזערת המראות את התפלגות הגודל של ספריות ריצוף שהוכנו בהצלחה עם התפלגות צרה וגודל ממוצע של כ -250 bp. אותות עליונים ותחתונים מייצגים סמנים המשמשים ליישור הדגימה. קווים כחולים מציינים את גודל השברים הממוצע (סוגריים כחולים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תוצאות תת-אופטימליות לדוגמה עבור ספריות cDNA. תוצאות אלקטרופורזה ממוזערת המראות את התפלגות הגודל של ספריית cDNA תת-אופטימלית בגודל ממוצע של < 200 bp. אותות עליונים ותחתונים מייצגים סמנים המשמשים ליישור הדגימה. קווים כחולים מציינים את גודל השברים הממוצע (סוגריים כחולים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תוצאות מופתיות תת-אופטימליות עבור ספריות ריצוף. תוצאות אלקטרופורזה ממוזערת המראות את התפלגות הגודל של ספריית ריצוף תת-אופטימלית המכילה מקטעים ארוכים יותר של 200 - 1000 bp. אותות עליונים ותחתונים מייצגים סמנים המשמשים ליישור הדגימה. קווים כחולים מציינים את גודל השברים הממוצע (סוגריים כחולים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניתוח נתונים גישוש. תוצאות מייצגות של ניתוח נתונים גישוש המראות את ההשפעה של תרופות אימונומודולטוריות נבחרות על PBMCs. (A) גרף עמודות של מספר הגנים שזוהו (צירי Y) המופרדים לפי סוג הגן (צירי X). (B) PCA של כל הגנים במערך הנתונים שנצבע על ידי הטיפולים התרופתיים השונים. נקודות עם אותו צבע הן העתקים ביולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מגיב	ריכוז	נפח [μL] /rxn
גואנידין הידרוכלוריד	80 מ"מ	7.50
דאוקסינוקלאוטיד טריפוספטים (dNTPs)	10 מ"מ כל אחד	6.52
פריימר SMART dT30VN	100 מיקרומטר	0.33
מים ללא Nuclease		0.65
עוצמת קול כוללת		15.00

טבלה 1: חיץ ליזיס.

מגיב	נפח [μL] /rxn
מאגר SSRT II (5x)	2.00
DTT (100 מילימול)	0.50
בטאין (5 מטר)	2.00
MgCl2 (1 מטר)	0.14
SSRT II (200 U/μL)	0.25
מעכב RNAse (40 U/μL)	0.25
TSO-LNA (100 מיקרומטר)	0.20
מים ללא Nuclease	0.66
עוצמת קול כוללת	6.00

טבלה 2: תערובת תגובות שעתוק לאחור (RT).

דנטורציה של mRNA
צעד	טמפרטורה	משך
דנטורציה של mRNA	95 °C	2 דקות
	על הקרח	2 דקות
תמלול הפוך
צעד	טמפרטורה	משך
תמלול הפוך	42°C	90 דק'
השבתת אנזימים	70°C	15 דק'
	4 °C	אחז

טבלה 3: תוכנית Thermocycler עבור דנטורציה mRNA ושעתוק לאחור (RT).

מגיב	נפח [μL] /rxn
DNA פולימראז באיכות גבוהה	12.50
פריימר ISPCR (10 מיקרומטר)	0.15
מים ללא Nuclease	2.35
עוצמת קול כוללת	15.00

טבלה 4: תמהיל טרום הגברה.

שלבים	טמפרטורה	משך
דנטורציה ראשונית	98 °C	3 דקות
דנטורציה	98 °C	20 שניות	16 – 18 מחזורים
חישול	67°C	20 שניות
סיומת	72 °C	6 דק'
	4 °C	אחז

טבלה 5: תוכנית תרמוסייקלר טרום הגברה.

שלבים	טמפרטורה	משך
תיוג	55 °C	8 דק'
	4 °C	אחז

טבלה 6: תוכנית תיוג thermocycler.

תערובת תיוג
מגיב	נפח [μL] /rxn
Amplicon Tagment Mix (כספומט)	1.0
מאגר DNA של תגמנט (TD)	2.0
עוצמת קול כוללת	3.0
תמהיל PCR העשרה
מגיב	נפח [μL] /rxn
DNA פולימראז באיכות גבוהה	7.0
פריימר ליצירת אינדקס תואם Nextera	2.0
עוצמת קול כוללת	9.0

טבלה 7: תמהיל תיוג ומיקס PCR העשרה.

שלבים	טמפרטורה	משך
התחלה חמה	72 °C	5 דקות
דנטורציה ראשונית	98 °C	30 שניות
דנטורציה	98 °C	10 שניות	16 מחזורים
חישול	60°C	30 שניות
סיומת	72 °C	1 דקות
הארכה סופית	72 °C	5 דקות
	4 °C	אחז

טבלה 8: תוכנית העשרה PCR thermocycler.

כלי	ריכוז העמסה
MiSeq v2	22:00
הבאSeq 500/550	1.4 אחה"צ
NovaSeq 6000	1250 עמ'

טבלה 9: דוגמאות להעמסת ריכוזי מכשירי ריצוף נפוצים.

Discussion

גילוי תרופות ופיתוח תרופות יכולים להפיק תועלת רבה מהראייה ההוליסטית של תהליכים תאיים שתעתיק בתפזורת יכול לספק. עם זאת, גישה זו מוגבלת לעתים קרובות על ידי העלות הגבוהה של הניסוי עם פרוטוקול RNA-seq סטנדרטי בתפזורת, האוסר על יישומו במסגרות אקדמיות, כמו גם הפוטנציאל שלו למדרגיות תעשייתית.

השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם הפשרת תאים והשלבים הראשונים של הכנת הספרייה. הבטחת כדאיות גבוהה של התאים לאחר הפשרה היא קריטית לטיפולים מוצלחים וניתוח שעתוק (transcriptomic analysis). השלבים הראשונים של קצירת תאים והכנת הספרייה עד סינתזת cDNA הם קריטיים לשמירה על שלמות הרנ"א. זה חיוני בשלב זה לשמור על התא lysate על קרח בכל עת ולעבד את הדגימות מהר ככל האפשר. אם נצפתה התפרקות מוגזמת של RNA, יש לנקות את משטחי המעבדה והציוד עם מוצרים ספציפיים כדי לעכב כל פעילות RNase.

הפרוטוקול המתואר כאן מותאם כיום לטיפול תרופתי ב-PBMCs מתורמים בריאים למשך 24 שעות לכל היותר. כדי לבצע את הניסוי עם סוג תא אחר או למשך זמן דגירה ארוך יותר, ייתכן שיהיה צורך למטב את מספרי התאים לתנאי זריעה ותרבית בהתאם.

באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים זרימת עבודה לניתוח תמלול על טיפול תרופתי ב- PBMCs באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וללא צורך בערכות מסחריות. עם גישה זו והימנעות משלב טיהור הרנ"א, הפחתנו את העלויות באופן משמעותי ואפשרנו ניתוח מקבילי של מספר גבוה של תרכובות.

מכיוון שפרוטוקול זה מבוסס על בדיקת מבחנה, המגבלה העיקרית שלו היא שהוא אינו יכול להעריך עיבוד מטבולי כלשהו של התרופות שיכול להוביל לפעילות ביולוגית שונה. בנוסף, מספר התעתיקים שנלכדו ועומק הרצף יהיו נמוכים יותר מאשר בשיטות תמלול סטנדרטיות באורך מלא בתפזורת, מה שימנע שימוש בנתונים אלה עבור יישומים הדורשים תוכן מידע גבוה יותר, כגון שחבור דיפרנציאלי או כימות של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 מ"ל צינור חרוטי	פישר 10203001
מדעי דבק PCR צלחת אטמים	תרמו פישר מדעי	AB0558
Amplicon Tagment Mix (כספומט)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library ערכת הכנה (96 דגימות)
AMPure XP חרוזים	בקמן קולטר	A 63881
בטאין	Sigma-Aldrich	61962
צלחות תרבית תאים בדרגת 96 בארות	Thermo Fisher Scientific	260860
משאבת ואקום תרבית תאים (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
דאוקסינוקלאוטיד טריפוספטים (dNTPs) תערובת 10 מ"מ כל אחד	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 מ"מ)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	לתאים דבקים
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	51976
סרום בקר עוברי	תרמו פישר 26140079
טיפים לסנן (10 ומיקרו; L)	Gilson
טיפים לסינון (100 ומיקרו; L)	Gilson
טיפים לסינון (20 ומיקרו; L)	Gilson
טיפים לסינון (200 ומיקרו; L)	Gilson
גואנידין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	G3272
פריימר ISPCR (10 ומיקרו; M)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
מגנזיום כלוריד (MgCl2)	מעמד מגנטי Sigma-Aldrich	M8266
96	אמביון	AM10027
לנטרל תג (NT) מאגר	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 דגימות), לחלופין 0.2% SDS
תואם Nextera פריימר אינדקס	Illumina
Nuclease-free	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96 בארות צלחות	Thermo Fisher Scientific	AB0600
אוטם צלחות PCR	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
פניצילין / סטרפטומיצין	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 פלואורומטר	Invitrogen	15723679
מעכב RNase רקומביננטי (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 מדיום תרבית תאים	Gibco	61870036	אם אינך עובד עם PBMCs, התאם לסוג התא
פריימר SMART dT30VN	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
ציוד מעבדה סטנדרטי			שונים כגון צנטריפוגה, מכונת קרח, דלי קרח, מים מזוקקים, אמבט מים
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) מאגר (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 דגימות)
מערכת TapeStation 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' ביוטין AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
מערבולת-ג'יני 2 מיקסר	סיגמא-אולדריץ'	Z258415