Method Article

זיהוי בזמן אמת של זיקה דינמית בין ביומולקולות באמצעות טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח (SPR)

DOI:

10.3791/65946

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי נועד להבהיר את העיקרון והמתודולוגיה של טכנולוגיית תהודת פלזמון פני השטח (SPR), המוצאת יישומים מגוונים בתחומים מרובים. מאמר זה מתאר את טכנולוגיית SPR, פשטותה התפעולית ויעילותה יוצאת הדופן, במטרה לטפח מודעות רחבה יותר ואימוץ טכנולוגיה זו בקרב הקוראים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח (SPR) היא שיטה מדויקת ורגישה לאיתור וירוסים, חלבונים מולקולריים פתוגניים וקולטנים, קביעת סוגי דם וזיהוי זיוף מזון, בין גילויים ביומולקולריים אחרים. טכנולוגיה זו מאפשרת זיהוי מהיר של קשירה פוטנציאלית בין ביומולקולות, ומאפשרת סריקה מהירה וידידותית למשתמש ולא פולשנית של מדדים שונים ללא צורך בתיוג. בנוסף, טכנולוגיית SPR מאפשרת זיהוי בזמן אמת לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה. בתוכנית זו מוצגים בקצרה תחום היישום והעקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית SPR. תהליך הפעולה מתואר בפירוט, החל מכיול המכשיר ותפעול המערכת הבסיסי, ולאחר מכן לכידת ליגנד וניתוח רב-מחזורי של האנליט. העקומה בזמן אמת ותוצאות הניסוי של קשירת קוורצטין וקליקוזין לחלבון KCNJ2 פורטו. בסך הכל, טכנולוגיית SPR מספקת שיטה ספציפית, פשוטה, רגישה ומהירה לסינון תרופות, זיהוי בזמן אמת של פרמקוקינטיקה קשורה, זיהוי וירוסים וזיהוי סביבתי ובטיחות מזון.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח (SPR) היא טכניקת זיהוי אופטית המבטלת את הצורך בתיוג האנליט. הוא מאפשר ניטור בזמן אמת ודינמי של זיקה כמותית, קינטיקה ותרמודינמיקה. קיבולת תפוקה גבוהה זו רגישה מאוד וניתנת לשחזור, ומאפשרת מדידה של שיעורי פתיחה שונים, שיעורי יציאה וזיקה שונים. בנוסף, כמות הדגימה הקטנה הנדרשת משפרת עוד יותר את התועלת של שיטה זו 1,2. שיטת הזיהוי הביו-מולקולרית המהירה3, המנטרת את קשירת הזיקה בין ביומולקולות, התגלתה כתחום מחקר בולט.

לטכנולוגיית SPR יש יישומים שונים בתחום המחקר והפיתוח של תרופות<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עקומת החישה הניסיונית המלאה מצביעה על כך שניתן לסווג את תהליך הניסוי לשמונה שלבים נפרדים.

1. הכנת מדגם וחוצץ

  1. הכן שבבי חיישנים לפני הניסוי.
    1. טפלו בשבבים בתמיסת פיראנה (30% H2O2: H2SO4=1:3; v/v) למשך 2 דקות. לאחר מכן, נקו את השבב היטב בכמות גדולה של מים נטולי יונים ולאחר מכן השרו אותו באתנול נטול מים, מה שאפשר לו להתייבש באופן טבעי.
    2. לאחר מכן, יש להשרות את השבב למשך הלילה בתמיסה של 11-mercapto-l-undecanol (MUOH) בריכוז של 50 M. לאחר מכן, הניחו את השבב בתמיסת אפיכלורוהידרין ואפשרו לו להגיב בטמפרטורה של 25 מעלות צל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבוע אם החלבון מקובע על פני השבב, נעשה שימוש בקואורדינטה (אות תגובה) של מפת חיישן SPR (איור 1), בעוד שמתקבלת התזוזה הזוויתית של עקומת ה-SPR. איור 2 ואיור 3 מתארים את עקומת ה-SPR של האינטראקציה בין קוורצטין וקליקוזין עם חלבון רקומביננטי KCNJ2 על פני השטח המשותקים של חלבון רקומביננטי KCNJ2 לאחר הפחתת בקרה בריכוזים הנעים בין 3.9 מיקרומטר ל-250 מיקרומטר. כדי למזער אי דיוקים הנובעים מהשפעות הובלת מסה, מולקולות החלבון הרקומביננטי KCN.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור ניתוח ה- SPR מחולק לארבעה שלבים. השלב הראשון, קו הבסיס, כולל הזרקת המאגר. לאחר מכן מגיע השלב השני, לכידת ליגנד. שבב החיישן COOH מופעל עם EDC/NHS (1:1) בקצב זרימה של 20 μL/min. לאחר מכן השבב מנוטרל באמצעות 1 M אתנולאמין הידרוכלוריד-NaOH בקצב זרימה של 20 מיקרוליטר לדקה. נעבור לשלב השלישי, שיטת האנליט הרב-מחזורי. האנליט מוזרק לתעלה בקצב זרימה של 20 מיקרוליטר לדקה לשלב אסוציאציה של 240 שניות, ואחריו תקופת דיסוציאציה של 360 שניות. גם תהליכי האסוציאציה וגם הדיסוציאציה מתנהלים במאגר הרץ. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המו"פ הגדול של מחוז סצ'ואן (2022YFS043), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012) ופרויקט קידום המחקר של Xinglin Scholar של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (XKTD2022013).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-אתיל-3-(3-דימתילאמינפרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC)ריאגנט נאן ג'ינג, נאנג'ינג, סיןC08296594
אתנול נטול מיםMerck Chemical Technologies Ltd., שנחאי, סין459836
BIAnormalizing solutionMerck Chemical Technologies Ltd., שנחאי, סין49781
פתרון חסימתBosheng Biotechnology Co., Ltd., שנגחאי, סין110050
חומצה ברומואצטיתMerck Chemical Technologies Ltd., שנחאי, סין17000
CalycosinPush Bio-technology Co., Ltd., צ'נגדו, סיןPU0124-0025
DextranCanspec Scientific Instruments Co., Ltd., שנחאי, סיןPM10036
EpichlorohydrinMerck Chemical Technologies Ltd., שנחאי, סין
אתנולמין הידרוכלורידYuanye Biotech ושות', בע"מ, שנחאי, סיןS44235
Glycine-HClMerck Chemical Technologies Ltd., שנחאי, סיןG2879
H2O2Merck Chemical Technologies Ltd., שנחאי, סין3587191
H2SO4אזור פיתוח תעשייתי היי-טק של ננטונג, סין2020001150C
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., שאנדונג, סיןS3872
KCNJ2 (אנושי) חלבון רקומביננטיAbnova, West Meijie Technology Co., Ltd., בייג'ינג, סיןH00003759-Q01
MUOHJizhi Biochemical Technology Co., Ltd., שנחאי, סיןM40590
NaOHMerck Chemical Technologies Ltd., שנגחאי, סיןSX0603
N-Hydroxysuccinimide (NHS)Yuanye Biotech Co., Ltd., שנחאי, סיןS13005
OpenSPRTMNicoya
QuercetinPush Bio-technology Co., Ltd., צ'נגדו, סיןPU0041-0025
שבב חיישן COOHניקויה
נתרן אצטטMerck Chemical Technologies Ltd., שנגחאי, סין229873
492515

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jebelli, A., Oroojalian, F., Fathi, F., Mokhtarzadeh, A., Guardia, M. Recent advances in surface plasmon resonance biosensors for microRNAs detection. Biosens Bioelectron. 169, 112599(2020).
  2. Sun, B., Xu, J., Liu, S., Li, Q. X. Characterization of small mo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Surface Plasmon ResonanceSPR TechnologyReal Time DetectionBiomolecular InteractionDrug ScreeningLigand CaptureMulti Cycle AnalysisVirus DetectionProtein BindingFood Safety
Video Coming Soon

Related Articles