מאמר זה מציג את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לזחל Ixodes scapularis לצורך מחקר קליני. הטכניקה פשוטה יחסית, נסבלת על ידי מתנדבי המחקר, וניתנת לשינוי בהתאם לצרכי הניסוי. מחקר כזה בבני אדם חייב להתבצע תחת פרוטוקולי מחקר קליני שאושרו על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל לחשיפה ניסיונית של בני אדם לקרציות זחל Ixodes scapularis
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות המועברות על ידי קרציות הן בעיה משמעותית בבריאות הציבור בארצות הברית ובעולם. קרציות מחייבות פרוקי רגליים הניזונים מדם; קרצית איקסודיד חייבת להישאר צמודה לעור הפונדקאי ולהשלים את תהליך ההזנה הרב-יומי שלה כדי לרכוש את ארוחת הדם שלה. חשיפת בעלי חיים לקרציות היא פרקטיקה נפוצה לחקר תגובות פונדקאים לעקיצות קרציות ולמחלות המועברות על ידי קרציות. פיתחנו את הנוהל, ערכנו את המחקר הראשון בבני אדם, ופרסמנו את הממצאים על חשיפת מתנדבים אנושיים לקרציות Ixodes scapularis של זחלים לא נגועים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה המשמשת לבניית הלבשת הבלימה, כיצד למרוח ולהצמיד את הקרציות לפונדקאי, כיצד לשמור על החבישה וכיצד להסיר את הקרציות מהפונדקאי. חשיפת מתנדבים לעקיצות קרציות היא הליך ניסיוני וחייבת להתבצע תחת פרוטוקול מחקר קליני המאושר על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות. שיטה זו מאפשרת מחקר תרגומי כדי להבין טוב יותר את התגובה האנושית לעקיצות קרציות ולטפח פיתוח אבחון, מניעה וטיפולים למחלות המועברות על ידי קרציות.
מבוא
קרציות קשות (Ixodidae: Acari) הן אקטופרזיטים הניזונים מדם ברחבי העולם ומסוגלות להעביר מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים וטפילים, בעלי חשיבות רפואית וטרינרית רבה. קרציות Ixodid חייבות להישאר מחוברות לפונדקאי במשך ימים כדי להשלים ארוחת דם, ויש להן את היכולת להישאר מחוברות לעור תוך הימנעות מזיהוי, מניעת קרישת דם מקומית והקלה על הזנה לטווח ארוך 1,2,3. מחקרים בבעלי חיים הוכיחו כי פונדקאים שאינם מתירנים רוכשים עמידות לעקיצות קרציות עם חשיפות חוזרות ונשנות לקרציות, מה שעלול להוביל לירידה ביכולת להעביר פתוגן, בעוד שקרציות יכולות שוב ושוב לטפיל פונדקאים מתירניים. עמידות נרכשת לקרציות תלויה באופי התגובה החיסונית של הפונדקאי 4,5,6,7.
מחלות המועברות על ידי קרציות הן איום הולך וגובר בארצות הברית (ארה"ב), כאשר מספר המקרים המדווחים יותר מהוכפל בין 2004 ל -2016 8,9. בשל שינויי האקלים, הטווחים הגיאוגרפיים של הקרציות השונות ממשיכים להתרחב10,11. המחלות המובילות המועברות על ידי קרציות בארה"ב כוללות מחלת ליים, אנאפלזמוזיס, ארליכיוזיס, קדחת מנומרת, ריקטסיוזיס, בבסיוזיס, טולרמיה ומחלת וירוס פווסאן8. מחלת ליים, הנגרמת על ידי זיהום עם Borrelia burgdorferi sensu lato, היא המחלה הנפוצה ביותר המועברת על ידי קרציות בארה"ב ובאירופה12. עם כ 476,000 אנשים מאובחנים עם מחלת ליים מדי שנה בארה"ב, יש הן נטל בריאותי וכלכלי על הפרט ועל החברה 13,14,15.
Ixodes scapularis (קרצית שחורת הרגל או קרצית הצבי) היא הווקטור העיקרי למחלת ליים, כמו גם אנאפלזמוזיס, בבסיוזיס, מחלת Borrelia miyamotoi ומחלת וירוס Powassan בארצות הברית. מיני קרציות אחרים בעלי חשיבות רפואית בארה"ב כוללים קרצית כוכב בודדת ( Amblyomma americanum ), קרצית כלב אמריקאית ( Dermacentor variabilis ), קרצית שחורת רגל מערבית ( Ixodes pacificus ), קרצית עץ הרי הרוקי ( Dermacentor andersoni ), קרצית חזיר קרקע ( Ixodes cookei ), קרצית חוף האוקיינוס השקט ( Dermacentor occidentalis ), קרצית כלב חומה ( Rhipicephalus sanguineus ) וקרצית חוף המפרץ ( Amblyomma maculatum )16.
פיתוח שיטה לחשיפת מתנדבי מחקר לעקיצות קרציות תומך במחקרים המשתמשים בווקטור הטבעי כדי לחפש ראיות לזיהום, הליך המכונה xenodiagnosis 17,18,19,20,21, וללמוד עוד על חסינות הנגרמת על ידי חשיפה לקרציות, אשר יכולה לתרום לגילוי חיסון נגד קרציות 5,6,7. ההליך המתואר כאן פותח ושימש במחקר האנושי הראשון באמצעות זחל Ixodes scapularis שגודל במעבדה עבור xenodiagnosis של זיהום B. burgdorferi לאחר טיפול אנטיביוטי (NCT01143558), שפורסם בשנת 201419. המערכת שימשה בהצלחה במחקר שלב 2 שבדק אם קסנודיאגנוזה חיובית קשורה להתמדה של תסמינים לאחר טיפול אנטיביוטי במחלת ליים (NCT02446626) ובמחקר שבדק את תגובת המארח לעקיצות קרציות (NCT05036707).
פרוטוקול הליך זה מתאר את תהליך יצירת חבישת ההכלה, הליך מיקום הקרציות והליך הסרת הקרציות, כמו גם את הטיפול באתר הדרוש לשמירה על חבישת ההכלה. הפרטים לגבי מושבת הקרציות I. scapularis נטולת הפתוגנים ונהלי החשיפה לקרציות המשמשים למחקרים שצוטטו לעיל תוארו בעבר19,22. מתודולוגיה זו מציעה כלי מחקר גמיש שניתן להתאים לחקר היבטים שונים של תגובת הפונדקאי האנושי לעקיצות קרציות, יעילותן של תרופות למניעת קרציות, כמו גם מחלת ליים ומחלות אחרות המועברות על ידי קרציות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
חשיפת מתנדבים לעקיצות קרציות היא שיטה ניסיונית וחייבת להתבצע תחת פרוטוקול מחקר קליני המאושר על ידי הרשויות הרגולטוריות הרלוונטיות. המחקרים הקליניים (NCT01143558, NCT02446626 ו-NCT05036707) אושרו על ידי ועדות הבדיקה המוסדיות המתאימות, נערכו תחת פטור ממכשירים ניסיוניים שניתן על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, ובוצעו בהתאם להנחיות Good Clinical Practice. בנוסף, מחקרים אלה נרשמו ב-ClinicalTrials.gov, והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המשתתפים.
1. הכנת תחבושת הכלה
- כדי ליצור תבנית מדידה, צלמו את הלבישה המכילה הידרוקולואידים בגודל 3 אינץ' x 3 אינץ' לאורך הצד של קווי המדידה (איור 1A וטבלת חומרים).
- גזור את התבנית המצולמת לאורך קו 1 אינץ'. לאחר מכן, חתכו לאורך קו ה-2 אינץ', וצרו עיגול בגודל 2 אינץ' עם מרכז בגודל 1 אינץ' (איור 1B).
- בעזרת תבנית זו, חתכו את רוטב הקצף הלא דביק ליצירת עיגול בגודל 2 אינץ' עם מרכז בגודל 1 אינץ' (איור 2A,B וטבלת חומרים).
- באמצעות אותה תבנית, גזרו עיגול בגודל 2 אינץ' במרכז הלבישה ההידרוקולואידית הדקה במיוחד בגודל 4 אינץ' x 4 אינץ' (איור 2C,D).
- חותכים את שכבת ההידרוקולואיד של הלבישה המכילה בגודל 3 אינץ' x 3 אינץ' בקו 1/2 אינץ'.
- משכו לאחור את ציפוי הנייר של שכבת ההידרוקולואיד של הלבישה כדי לחשוף את הדבק. הניחו את רוטב הקצף החתוך בתוך עיגול "2 של הדבק (איור 3A). זה יבטיח כי רוטב הקצף משתרע מעבר לפתח של רוטב הכלה. החליפו את תוחם הנייר על שכבת ההידרוקולואיד של החבישה (איור 3B).
הערה: מדידות אלה שימשו למחקרים שכללו עד 10 קרציות I. scapularis . במחקרים שכללו עד 30 קרציות I. scapularis , התבנית של מרכז הקצף נחתכה בין הסימונים בגודל 1 אינץ' ל-11/2 אינץ' כדי לאפשר שטח גדול יותר למיקום. ניתן להתאים את מידות הלבישה בהתאם לעיצוב המחקר.
2. מיקום קרציות
- אחסון קרציות
- לאחסן את הזחל I. scapularis קרציות במקרר ברמה רפואית עם הטמפרטורה להגדיר 9-10 ° C.
- אחסנו את הקרציות בבקבוקון מכוסה במכסה רשת כדי לאפשר זרימת אוויר נאותה. ארזו את בקבוקון הקרציות בשקית ניילון הניתנת לאטימה עם ספוג לח קלות כדי לשמור על לחות ולמנוע התייבשות.
- הנחת הקרציות
- מוציאים את הקרציות מהמקרר כדי לאפשר להן להתחמם לטמפרטורת החדר. הקרציות יכולות להיות פעילות תוך 15 דקות בלבד מחוץ למקרר.
- מקם גיליון לבן מסביב לאזור המיקום כדי לדמיין בקלות כל סימן שנפל בשוגג.
- הרטיבו פד גזה בגודל 4X4 אינץ' במים נקיים או מלוחים והשתמשו בו כדי לנקות את העור של אתר המיקום. יש לייבש את האזור בטפיחות קלות או לאפשר לו להתייבש באוויר.
הערה: בעת בחירת אתר הגוף למיקום הקרציות, יש לקחת בחשבון אזורים שאינם מגבילים את הפעילות היומיומית של המתנדב ושבהם ניתן לפקח בקלות על שלמות החבישה על ידי המשתתף. אין להניח קרציות באזורים שבהם הן עלולות להימעך עקב לחץ ישיר (למשל, הגב). להעריך את שיער הגוף של המשתתף, ואם יש צורך, בזהירות לקצץ שיער גוף עודף באמצעות מספריים באתר של דבק, הימנעות נזק לעור. הימנעו משימוש בסכין גילוח להסרת שיער, שכן הוא עלול להגביר את הסיכון לפגיעה בעור ולזיהום. - ברגע שהעור יבש, הסירו את תוחם הדבק מהצד ההידרוקולואידי של ההלבשה המוכנה והדביקו אותו היטב לעור באתר המיקום, כדי להבטיח ששכבת הרשת תישאר פתוחה.
- שברו את מקלון העץ (ראו טבלת חומרים) לשניים כדי לחשוף קצוות משוננים.
- בזהירות לפתוח את בקבוקון הקרציות.
- בעזרת הקצה המשונן של מקלון העץ, העבירו קרציות פעילות מהבקבוקון והניחו אותן על העור בתוך חבישת ההכלה (איור 4A). בקש מחבר צוות נוסף לפקח על אתר מיקום הקרציות כדי לוודא שהקרציות נשארות בתוך הלבישה המבלימה. השתמשו בסרט הדבקה כדי ללכוד קרציות שבורחות מהבקבוקון בתהליך זה.
הערה: שבירת מקלון עץ ושימוש בקצה המשונן יעילים למניפולציה והעברה של קרציות מבלי לגרום נזק לקרציות. מברשת קטנה עם זיפים רכים בצבע בהיר פועלת גם להעברת קרציות מהמיכל לאתר העור. - לאחר הנחת מספר הקרציות שצוין למחקר, הסירו את תוחם הדבק משכבת הרשת של הלבישה וסגרו אותו מעל הפתח.
- לאחר שווידאתם שהדבק מחובר היטב, מרחו את ההלבשה ההידרוקולואידית הדקה במיוחד בגודל 4 אינץ' על 4 אינץ' מעל הלבישה המכילה לאבטחה נוספת (איור 4B).
הערה: מידע נוסף לגבי מושבת הקרציות I. scapularis נטולת הפתוגנים ומשך הליכי החשיפה לקרציות ששימשו במחקרים המצוטטים ניתן למצוא בפרקי השיטות של המחקרים שפורסמו19,22.
3. טיפול באתר
- ספק כיסוי מחסום מים וסרט היפואלרגני בגודל 2 אינץ' (ראה טבלת חומרים) למשתתף המחקר.
- ספקו הוראות לטיפול באתר ההכלה של הקרציות.
- בדוק מעת לעת את החבישה ועקוב אחר הקצוות להידבקות בטוחה לעור. יש למרוח סרט נוסף לחיזוק קצוות ההלבשה לפי הצורך.
- אין לגרד את מקום החבישה ולהימנע מפתיחה או הסרה של החבישה במהלך תקופת הלימוד.
- הימנעו מרחצה או טבילה במים. כמו כן, הימנעו ממקלחות חמות והגבילו את משך המקלחת. לפני המקלחת, יש להגן על הלבישה עם כיסוי מחסום המים המסופק ולהסיר אותה לאחר סיום המקלחת. יבשו בעדינות את ההלבשה בטפיחות קלות ובדקו אותה כדי לוודא שהיא נשארת בטוחה.
- הימנעו מפעילויות שעלולות להוביל להזעה רבה ולפגוע בשלמות החבישה (למשל, פעילות אירובית, טיולים ממושכים).
4. הרחקת קרציות
- הכנת בקבוקוני איסוף
- תייגו את בקבוקוני איסוף הקרציות עם המזהים הרצויים (למשל, קוד מחקר, תאריך).
- אם יש צורך בשימור קרציות חיות, נקב חורים במכסה הבקבוקונים עם מחט 20 גרם. השתמשו בשכבה של רשת ניילון או פוליאסטר יחד עם המכסה כדי לאטום את הבקבוקון. הניחו חתיכה קטנה של ספוג לח בשקית הניתנת לאטימה עם בקבוקון הקרציות כדי לשמור על לחות.
- הסרת הקרציות
- הניחו סדינים לבנים סביב אתר התחבושת וודאו שאגן האיסוף נמצא בהישג יד.
- באמצעות מגבוני אלכוהול, בזהירות להסיר את התחבושת מן העור.
- לאחר ההסרה המלאה, הניחו את התחבושת באגן האיסוף ובדקו אותה לנוכחות קרציות מנותקות.
- הערך את אתר המיקום של קרציות מצורפות. קרציות שניזונו למילוי יתנתקו (איור 5A). עבור שאר הקרציות המצורפות, השתמשו במלקחיים עדינים להסרה (איור 5B).
- נקו את העור עם מגבוני אלכוהול או מים וסבון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המחקר הראה כי ההליך בטוח ונסבל היטב, כאשר תופעת הלוואי העיקרית היא גירוד קל במקום העקיצות, שנצפה ב -58% מההליכים. לא היו תופעות לוואי חמורות הקשורות להליך בעת שימוש בזחל נקי במעבדה I. scapularis קרציות19. ב-43 ההליכים שנערכו, אחוז ההחלמה הממוצע של קרציות מחוברות בהשוואה לקרציות שהונחו היה 45% ±-27% (SD), עם אחוז חציוני של 40% (תרשים 6).
משך הזמן המדויק להיצמד של קרציות I. scapularis לבני אדם עדיין אינו ברור, מכיוון שהזמן מ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעוד שמחקרים בבעלי חיים שכללו חשיפה לקרציות 4,5,6,7,21 היו בעלי ערך רב בהגברת ההבנה שלנו של תגובת הפונדקאי למחלות המועברות על ידי קרציות ועקיצות קרציות, למודלים אלה יש מגבלות במידת התחזית שלהם לתגובת המארח האנושי. מודל זה, המתאר את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לעקיצות קרציות באופן מבוקר, ניתן להתאמה בקלות כדי לענות על שאלות מחקר שונות ומרחיב את היכולת לבצע מחקרי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לד"ר אדריאנה מרקס יש פטנט US 8,926,989 B2; והוא יועץ מדעי ללא שכר לברית ליים העולמית ולקרן האמריקאית למחלות ליים. לסיו פינג טורק ולאלה אשמן אין קשר שעלול להוות ניגוד עניינים. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם אזכור של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים אינו מרמז על תמיכה מצד ממשלת ארה"ב.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של NIH, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. אנו מודים ללינדן ט. הו, סם ר. טלפורד השלישי, קנת דרדיק, קרלה ויליאמס, ארין צ'ונג וכריסטינה ברנדבורג על השתתפותם בפיתוח הנהלים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחט 20 גרם | כל מותג | לניקוב מכסה הבקבוקון. | |
| חבישת בלימה בגודל 3 אינץ' x 3 אינץ' | שמות Monarch Labs | LeFlap | https://www.monarchlabs.com/ordering |
| חבישה הידרוקולואידית דקה במיוחד | ConvaTec | DuoDerm | https://www.convatec.com/products/advanced-wound-care/brand-names/pc-wound-duoderm-granluflex/duoderm-extra-thin-dressing/ |
| 4 אינץ' x 4 אינץ' גזה | Monarch Labs שמות | לניקוי העור | |
| מים נקיים או מי | לניקוי העור | ||
| מחסום לחות (למשל 7 אינץ' x 7 אינץ') | AquaGuard | TIDI | למקלחת, ttps://www.tidiproducts.com/product-listing/aquaguard-shower-cover-sheets |
| חבישת קצף לא דביקה | Coloplast | Biatain https://www.coloplast.us/biatain-non-adhesive-en-us.aspx | |
| גליל של סרט היפואלרגני בגודל 2 אינץ' | Monarch Labs שמות | Durapore | לחיזוק חבישת הבלימה. |
| גליל סרט | ללכידת קרציות | ||
| בקבוקונים לאיסוף (למשל קריוביאלים) | Ependorf | ECC200 |
מקורות
- Yeh, M. T., et al. Determining the duration of Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) attachment to tick-bite victims. J Med Entomol. 32 (6), 853-858 (1995).
- Piesman, J., Mather, T. N., Sinsky, R. J., Spielman, A. Duration of tick attachment and Borrelia burgdorferi transmission. J Clin Microbiol. 25 (3), 557-558 (1987).
- Vora, A., et al. Ticks elicit variable fibrinogenolytic activities upon feeding on hosts with different immune backgrounds. Sci Rep. 7, 44593(2017).
- Narasimhan, S., et al. Immunity against Ixodes scapularis salivary proteins expressed within 24 hours of attachment thwarts tick feeding and impairs Borrelia transmission. PLoS One. 2 (5), 451(2007).
- Nazario, S., et al. Prevention of Borrelia burgdorferi transmission in guinea pigs by tick immunity. Am J Trop Med Hyg. 58 (6), 780-785 (1998).
- Krause, P. J., et al. Dermatologic changes induced by repeated Ixodes scapularis bites and implications for prevention of tick-borne infection. Vector Borne Zoonotic Dis. 9 (6), 603-610 (2009).
- Anderson, J. M., et al. Ticks, Ixodes scapularis, feed repeatedly on white-footed mice despite strong inflammatory response: an expanding paradigm for understanding tick-host interactions. Front Immunol. 8, 1784(2017).
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and Territories, 2004-2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 67 (17), 496-501 (2018).
- Paules, C. I., Marston, H. D., Bloom, M. E., Fauci, A. S. Tickborne diseases - confronting a growing threat. N Engl J Med. 379 (8), 701-703 (2018).
- Tardy, O., et al. Mechanistic movement models to predict geographic range expansions of ticks and tick-borne pathogens: Case studies with Ixodes scapularis and Amblyomma americanum in eastern North America. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102161(2023).
- Molaei, G., Eisen, L. M., Price, K. J., Eisen, R. J. Range expansion of native and invasive ticks: a looming public health threat. J Infect Dis. 226 (3), 370-373 (2022).
- Marques, A. R., Strle, F., Wormser, G. P. Comparison of Lyme disease in the United States and Europe. Emerg Infect Dis. 27 (8), 2017-2024 (2021).
- Kugeler, K. J., Schwartz, A. M., Delorey, M. J., Mead, P. S., Hinckley, A. F. Estimating the frequency of Lyme disease diagnoses, United States, 2010-2018. Emerg Infect Dis. 27 (2), 616-619 (2021).
- Schwartz, A. M., Kugeler, K. J., Nelson, C. A., Marx, G. E., Hinckley, A. F. use of commercial claims data for evaluating trends in lyme disease diagnoses, United States, 2010-2018. Emerg Infect Dis. 27 (2), 499-507 (2021).
- Hook, S. A., et al. Economic burden of reported Lyme disease in high-incidence areas, United States. Emerg Infect Dis. 28 (6), 1170-1179 (2022).
- Eisen, L. Tick species infesting humans in the United States. Ticks Tick Borne Dis. 13 (6), 102025(2022).
- Embers, M. E., et al. Variable manifestations, diverse seroreactivity and post-treatment persistence in non-human primates exposed to Borrelia burgdorferi by tick feeding. PLoS One. 12 (12), 0189071(2017).
- Hodzic, E., Imai, D., Feng, S., Barthold, S. W. Resurgence of persisting non-cultivable Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. PLoS One. 9 (1), 86907(2014).
- Marques, A., et al. Xenodiagnosis to detect Borrelia burgdorferi infection: a first-in-human study. Clin Infect Dis. 58 (7), 937-945 (2014).
- Hodzic, E., Imai, D. M., Escobar, E. Generality of post-antimicrobial treatment persistence of Borrelia burgdorferi strains N40 and B31 in genetically susceptible and resistant mouse strains. Infect Immun. 87 (10), e00442(2019).
- Bockenstedt, L. K., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S. W., Fish, D. Detection of attenuated, noninfectious spirochetes in Borrelia burgdorferi-infected mice after antibiotic treatment. J Infect Dis. 186 (10), 1430-1437 (2002).
- Turk, S., Williams, C., Marques, A. in Borrelia burgdorferi: Methods in Molecular Biology. Pal, U., Buyuktanir, O. , Springer. New York. 337-346 (2018).
- Hodzic, E., Feng, S., Holden, K., Freet, K. J., Barthold, S. W. Persistence of Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. Antimicrob Agents Chemother. 52 (5), 1728-1736 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
