מאמר שיטה

השתלת קנה נשימה תוך ריאתי: מודל לחקר מחלת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65953

⸱

10 בנובמבר 2023

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

מודל השתלת קנה הנשימה התוך-ריאתי (IPTT) הוא בעל ערך לחקר מחלת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות. הוא מציע תובנות לגבי התנהגות אימונולוגית ואנגיוגנית ספציפית לריאות במחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלה עם יכולת שחזור גבוהה. כאן, אנו מתארים את הליך IPTT ואת התוצאות הצפויות שלו.

תקציר

השתלת קנה נשימה תוך ריאתי (IPTT) משמשת כמודל של מחלת דרכי נשימה מוחקת (OAD) לאחר השתלת ריאות. מודל זה, שדווח לראשונה על ידי הצוות שלנו, זכה לשימוש במחקר של OAD בשל יכולת השחזור הטכנית הגבוהה שלו והתאמתו לחקר התנהגויות אימונולוגיות והתערבויות טיפוליות.

במודל IPTT, שתל קנה הנשימה של מכרסם מוכנס ישירות לריאה של המקבל דרך הצדר. מודל זה שונה ממודל השתלת קנה הנשימה ההטרוטופית (HTT), שבו השתלים מושתלים באתרים תת-עוריים או אומנטאליים, וממודל השתלת קנה הנשימה האורתוטופית (OTT) שבו קנה הנשימה התורם מחליף את קנה הנשימה של המושתל.

יישום מוצלח של מודל IPTT דורש מיומנויות הרדמה וכירורגיה מתקדמות. מיומנויות ההרדמה כוללות אינטובציה אנדוטרכאלית של המושתל, הגדרת פרמטרים מתאימים להנשמה ואקסטובציה מתוזמנת כראוי לאחר התאוששות מהרדמה. מיומנויות כירורגיות חיוניות למיקום מדויק של השתל בתוך הריאה ולהבטחת איטום יעיל של הצדר הקרבי למניעת דליפת אוויר ודימום. באופן כללי, תהליך הלמידה אורך כחודשיים.

בניגוד למודלים HTT ו-OTT, במודל IPTT, נתיב האוויר allograft מפתח מחיקה של דרכי הנשימה במיקרו-סביבה הריאה הרלוונטית. זה מאפשר לחוקרים לחקור תהליכים אימונולוגיים ואנגיוגניים ספציפיים לריאות המעורבים במחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות. יתר על כן, מודל זה ייחודי גם בכך שהוא מציג איברי לימפה שלישוניים (TLOs), אשר נראים גם allografts ריאות האדם. TLOs מורכבים מאוכלוסיות תאי T ו- B ומאופיינים בנוכחות של ורידי אנדותל גבוהים המכוונים את גיוס תאי החיסון; לכן, הם עשויים לשחק תפקיד מכריע בקבלה ודחייה של השתל. אנו מסיקים כי מודל IPTT הוא כלי שימושי לחקר מסלולים חיסוניים ופרופברוטיים תוך ריאתיים המעורבים בהתפתחות של מחיקת דרכי הנשימה באלוגרפט השתלת ריאות.

מבוא

השתלת ריאות נקבעה כטיפול יעיל לחולים עם מחלות נשימה סופניות. עם זאת, שיעור ההישרדות החציוני של מושתלי ריאות אנושיים הוא רק כ -6 שנים, עם התפתחות של ברונכיוליטיס מוחק (OB), סוג של מחלת דרכי נשימה חסימתית (OAD), להיות הגורם העיקרי למוות לאחר השנה הראשונה לאחר ההשתלה1.

מספר מודלים של בעלי חיים שימשו כדי לחקור את המנגנון העומד בבסיס OAD. מודל אחד כזה הוא מודל2 להשתלת קנה נשימה הטרוטופית (HTT). במודל זה, שתלי קנה הנשימה מושתלים ברקמה התת עורית או באומנטום של הנמען. איבוד איסכמי של תאי אפיתל שתל קנה הנשימה מתרחש, ואחריו הסננה לימפוציטים alloreactive ואפופטוזיס של תאי אפיתל תורם. פיברובלסטים ומיופיברובלסטים נודדים סביב קנה הנשימה ומייצרים מטריצה חוץ-תאית. לבסוף, מחיקה סיבית מלאה של לומן דרכי הנשימה מתרחשת. דגם HTT הוא פשוט מבחינה טכנית, מספק סביבת in vivo ומציע יכולת שחזור גבוהה.

מודל נוסף לחקר OAD הוא מודל השתלת קנה הנשימה האורתוטופית של חולדה (OTT), שבו השתלות קנה הנשימה משולבות בקנה הנשימה של המושתל כדי לשמור על אוורור פיזיולוגי3. במודל זה, דלדול תאי אפיתל מתורם כתוצאה מאיסכמיה גורם להחלפתם בתאי אפיתל מושתלים בתוך קנה הנשימה, ויוצר נתיב אוויר ללא הפרעה המלווה בפיברוזיס מתון. למרות שמודלים אלה תרמו להבנת מחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות, יש להם מגבלות במונחים של שחזור של מיקרו-סביבה פרנכימלית של הריאה.

קבוצת המחקר שלנו הציגה את מודל השתלת קנה הנשימה התוך-ריאתי של חולדה (IPTT), שבו השתלות קנה הנשימה מושתלות בריאה4 של המושתל (איור 1). מודל IPTT מציג מחיקה סיבית של לומן דרכי הנשימה המתרחשת בתוך מיקרו-סביבת הריאה. יתר על כן, הוא יושם בהצלחה על עכברים שהם מאתגרים יותר מבחינה טכנית מאשר חולדה IPTT 5,6,7,8,9,10. התאמה זו של מודל ה- IPTT של מורין אפשרה לנו להעמיק בפרטים המורכבים של הסביבה החיסונית הריאה של OAD לאחר השתלת ריאות באמצעות עכברים טרנסגניים.

מודל IPTT בעל כמה תכונות ייחודיות. האחת היא ניאואנגיוגנזה, אשר מתאפשרת על ידי מחזור הדם הריאתי וממלאת תפקיד מכריע במחיקת דרכי הנשימה 4,10. בנוסף, מודל IPTT מציג אגרגטים לימפואידים, שלחלקם יש ורידי אנדותל גבוהים המבטאים כתובת קשרית היקפית, מה שמצביע על כך שהם איברי לימפה שלישוניים (TLOs)7,8. TLOs דומים לבלוטות לימפה ומורכבים מתאי T, תאי B, ולעתים קרובות, מרכז נבט המלווה בתאים דנדריטיים פוליקולריים11,12. TLOs דווחו במחלות דלקתיות כרוניות שונות, כולל מחיקת דרכי הנשימה, מה שהופך את מודל IPTT מתאים לחקר התפקיד של TLOs בהשמדת דרכי הנשימה 7,8,11,12,13. מאמר זה מציג את המתודולוגיה של מודל ה-IPTT של מורין, במטרה להכיר לחוקרים מודל זה ולאפשר מחקרים נוספים על מחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים במדריך לטיפול ושימוש בחיות ניסוי. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו, רשת הבריאות האוניברסיטאית.

1. ניתוח תורם

הערה: עכברי BALB/c משמשים כדוגמה לתורמים לניסוי. כל ההליכים חייבים להתבצע תוך שימוש בטכניקה סטרילית.

  1. לפני ההליך, רשום את המשקל של כל עכבר.
  2. הרדימו את העכבר באמצעות תא CO2 .
  3. לאחר אישור המוות, מקם את העכבר במצב שכיבה ואבטח את הגפיים בנייר דבק.
  4. הכינו את אזור הניתוח על ידי עיקור שלו עם 70% אלכוהול איזופרופיל.
    הערה: במידת הצורך ובהתאם להמלצת ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים, יש לגזור את הפרווה מאתר החתך.
  5. בצע חתך קו אמצע על העור, החל מאמצע הבטן ומתרחב לאזור צוואר הרחם הקדמי.
  6. גישה לקנה הנשימה על ידי נסיגה זהירה של כריות השומן, הזזת שרירי הרצועה לרוחב והפרדת קנה הנשימה מרקמת החיבור שמסביב. השתמש במלקחיים כדי ליצור רווח בין קנה הנשימה לוושט.
  7. הרימו את הקסיפואיד וחתכו את הסרעפת.
  8. הרם את עצם החזה, הבטחת נתיב ברור מן החזה לאזור הצוואר על ידי החדרת hemostat. מהדקים את כלוב הצלעות משני הצדדים וחותכים דרך עצם החזה, המשתרע דרך שרירי הצוואר.
  9. הסר את בלוטת התימוס וכל שומן או שריר החוסמים את קנה הנשימה כדי לחשוף את התפצלות קנה הנשימה.
  10. חותכים את הסמפונות הראשיים ומפרידים בזהירות את דרכי הנשימה מהוושט.
  11. חותכים את הגרון ומסירים אותו.
  12. רססו את קנה הנשימה המנותח בתמיסת מלח סטרילית או בתמיסת שימור בגזה סטרילית ספוגה במי מלח סטריליים או בתמיסת שימור והניחו אותה על קרח כדי לשמר את יכולת הקיום שלה.

2. ניתוח מושתל

הערה: עכברי C57BL/6 משמשים כדוגמה למושתלים עבור הניסוי.

  1. יש לתת בופרנורפין בשחרור מושהה במינון של 1 מ"ג/ק"ג בבוקר יום הניתוח.
  2. יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלורן 5%.
  3. לאחר שהעכבר מורדם קלות, יש להזריק קוקטייל המורכב (0.1 מ"ג/גרם) מקסילזין וקטמין (0.01 מ"ג/גרם).
  4. החזר את העכבר לתא האינדוקציה עם 2-3% isoflurane נשמר.
  5. יש לגלח את הפרווה באתר הניתוח. כמו כן, יש לתת bupivacaine כגוש קו תת עורי לאורך אתר החניכה המתוכנן במינון של 7 מ"ג/ק"ג.
  6. אשר את היעדר תגובת רפלקס לצביטה בבוהן לפני אינטובציה orotracheal. יש לבצע אינטובציה לעכבר באמצעות צנתר תוך ורידי 20 G ולחבר אותו למכונת הנשמה בעלת נפח גאות של 500 מיקרוליטר, קצב נשימה של 120 פעימות לדקה, 100% חמצן ו-2% איזופלורן. השתמש מעמד עם מהדק מוחל על הלשון, מחזיק את החיה במצב אנכי עם הצוואר מורחב, כדי להקל על הליך זה.
  7. הפעילו כרית חימום ומקמו את העכבר במצב צדדי ימני על גבי הפד, כשהראש רחוק מהמנתח והזנב פונה למנתח (איור 2). אבטחו את הגפיים בעזרת נייר דבק. יש לשים משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
  8. לקרצף את אזור הניתוח עם 7.5% יוד פובידון, לעקר עם 70% אלכוהול איזופרופיל, ולקרצף מחדש עם 10% יוד פובידון. יש למרוח וילונות כירורגיים סטריליים לכיסוי אזור הניתוח.
  9. העמיסו את קנה הנשימה של התורם לתוך צנתר תוך-ורידי של 16G במהלך הזמן הזה (איור 3C,D).
  10. השתמש באזמל כדי לבצע חתך בעור הנמען ולצרוב את השריר ורקמת החיבור.
  11. פתח את החלל הבין-קוסטלי החמישי או השישי והחזק את כלוב הצלעות פתוח באמצעות שני נשלפים.
  12. לנתח את הרצועה הריאתית התחתונה באמצעות צמר גפן מספריים.
  13. הדימו את יצירת המסלול עבור קנה הנשימה של התורם (איור 3G,H).
  14. אבטח את צינור זרימת ההנשמה על ידי סגירה חלקית שלו עם סטופקוק משולש כדי להקל על ניפוח הריאה השמאלית.
  15. צור מסלול על ידי ניקוב הריאה השמאלית עם מחט 20 גרם. הקפדה על כך שעומק הנקב שווה בערך לאורך האלוגרפט של קנה הנשימה. בחרו את אתר הניקוב בקצה הריאה (כפי שמצוין באיור 3I), וודאו שהמסלול עובר במקביל למשטח העליון (כפי שמסומן בעיגול כחול באיור 3J).
    הערה: זווית החדרה כלפי מעלה תגרום לחדירה של השכבה הפלאורלית, בעוד שזווית עמוקה יותר עלולה להוביל לדימום מכלי דם עיקריים (כפי שמסומן בצלבים אדומים באיור 3J).
  16. הכנס את הצנתר התוך-ורידי 16 G לריאה השמאלית והוציא את קנה הנשימה התורם לריאה השמאלית. לאחר החדרת אלוגרפט קנה הנשימה, שחררו את הסטופקוק התלת-כיווני כדי לאפשר זרימה פקועה ללא הפרעה דרך צינור היציאה.
  17. סגור את אתר ההזרקה הפלאורלית בעזרת קליפס (איור 3K,L). מקמו את הקליפ במדויק על אתר הניקוב, כשהקצה שלו מיושר כך שיתאים לקווי המתאר של קצה הריאה (מסומן על-ידי העיגול הכחול באיור 3L).
    הערה: מיקום שגוי של אתר החיתוך עלול לגרום לאיטום לא יעיל ולדליפת אוויר, בעוד שעומק קליפס לא מספיק עלול להוביל לניתוק הקליפ לאחר הניתוח (כפי שמוצג על ידי הצלבים האדומים באיור 3L).
  18. ממלאים את חלל החזה בתמיסת מלח וסופגים את המלח בגזה.
  19. מנפחים מחדש את הריאה השמאלית וסוגרים את הצלעות בטכניקת תפר ריצה.
  20. סגור את השריר והעור עם תפרים קטועים.
  21. מתן משכך כאבים meloxicam תת עורית במינון של 5 מ"ג / ק"ג בסוף הניתוח.
  22. התבונן בעכבר הנמען עד שהוא ער. לאחר מכן, הסר את צינור קנה הנשימה והכניס את העכבר המקבל לכלוב.
    הערה: יש לשכן עכברים מקבלים בנפרד.
  23. מתן meloxicam (5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום באמצעות הזרקה תת עורית, החל 24 שעות לאחר הניתוח ולהמשיך במשך 3 ימים לאחר הניתוח.

3. איסוף דגימות מעכברים מושתלים

  1. יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלורן 5%.
  2. אשר את היעדר תגובת הרפלקס לצביטה בבוהן לפני אינטובציה orotracheal. שיטת האינטובציה והגדרת מכונת ההנשמה זהות לזו של ניתוח מושתל.
  3. מקם את העכבר במצב שכיבה ואבטח את הגפיים.
  4. הכינו את אזור הניתוח על ידי עיקור שלו עם 70% אלכוהול איזופרופיל.
  5. בצע חתך קו אמצע על העור, החל מאמצע הבטן ומתרחב לאזור צוואר הרחם הקדמי.
  6. להוציא את העכבר דרך הווריד קאווה התחתון באמצעות מזרק 1 מ"ל מחובר למחט 25 גרם, וכתוצאה מכך המתת חסד.
  7. פתח את החזה וגש לקנה הנשימה באותו אופן כמו עכבר תורם. קשרו את קנה הנשימה סביב צינור האינטובציה עם משי 7-0.
  8. הסירו את בלוטת התימוס, השומן והשרירים כדי לחשוף את הלב.
  9. חותכים את האטריום השמאלי, אטריום ימין, ואת הווריד הנבוב הנחות. לנקב את הריאות עם 3 מ"ל של מלוחים סטריליים דרך החדר הימני.
  10. לניתוח היסטולוגי, לנפח את הריאות עם 10% פורמלין באמצעות צינור אינטובציה.
  11. להוציא את צינור האוורור ולקשור את קנה הנשימה עם משי 7-0.
  12. לחלק את הגרון ואת הוושט. משוך אותם לכיוון נחות, ולאחר מכן לחלץ את בלוק הלב והריאות, הצבת אותו לתוך 10% פורמלין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בהתבסס על הניסיון שלנו, מיומנות במודל זה דורשת בדרך כלל כחודשיים של הכשרה. לאחר השגת מיומנות, הליכי התורם דורשים בדרך כלל 15 דקות, בעוד שהליכי המקבל דורשים כ -30 דקות. שיעור התמותה הצפוי למפעיל מיומן הוא 0%.

באיור 4A, אלוגרפט קנה הנשימה מציג חסימה מוחלטת עם רקמה פיברובלסטית, ותאי האפיתל נהרסים באופן גלוי. לעומת זאת, באיור 4B, איזוגרפט קנה הנשימה נשאר פטנט, ותאי האפיתל נשמרים.

איור 5

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הליך IPTT murine כולל שלבים קריטיים. לגבי הרדמה, השלב המכריע הראשון הוא אינטובציה אנדוטרכאלית. זה חיוני להחזיק את העכבר בגובה מתאים עם רגליו על השולחן כדי לדמיין את מיתרי הקול להקל על אינטובציה מיידית. בנוסף, יש צורך בנפח נשימה זהיר ובהתאמת לחץ סוף תפוגה חיובי (PEEP). בדרך כלל, נפח נשימה של 500 μL ו- PEEP של 2 cmH2O מספיקים לעכברים במשקל 25-30 גרם. עם זאת, עכברים מושתלים גדולים יותר עשויים לחוות אפיזודות "שיהוק", המעידות על מחסור בחמצן. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את נפח הנשימה, PEEP, ולהדק באופן זמני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברי כתב היד הזה אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לג'רום ואלרו על עריכת כתב היד הזה. איור 1 ואיור 3I,J,L נוצרו עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BALB/cJמעבדת ג'קסון8-10 שבועות 25-30 גרםזכר, תורם
BD 1 מ"ל מזרקבקטון דיקינסון309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD
PrecisionGlide		Becton Dickinson305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-TempertureBovieDEL1
C57BL/6Jמעבדת ג'קסון8-10 שבועות 25-30 גרםזכר, מושתל
Dumont #5/45 מלקחייםF· S· T11251-35
Ethicon Ligaclip אפליקציות מרובות קליפ-EthiconLX107
מלקחיים עדינים במיוחד F· S· T11150-10
מהדק בולדוג גלובראינטגרה320-127
המוסטטים של יתוש הלסטדF· S· T13009-12
Horizon טיטניום קשירת קליפסיםטלפלקס001201
Leica M651 מיקרוסקופ כירורגי ידני להליכים מיקרוכירורגייםLeica
Magnetix Fixator עם מנעול קפיץCD+ LABSACD-001
מספריים מיקרוכירורגייםJarit277-051
מאוורר עכבר וחולדה סביב הלידה דגם 687הרווארד55-0001
Perfadex PlusXVIVO19850
קצה מפסק קהה - 2.5 מ"מCD+ LABSACD-011
שולחן בעלי חיים קטניםCD+ LABSACD-003
Surgipro כחול 24 אינץ' CV-1 מתחדד, כפול זרועCovidienVP702X
משחת SystaneAlconn1444062
מערכת אלסטומרCD+ LABSACD-007
Terumo Surflo IV קטטר, 20 גרם x 1Medical CorporationSR-OX2025CA
VMT שולחן בנסון עליון91803300
ב-Terumo

מקורות

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation. J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).
  2. Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).
  3. Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats. Transplantation. 70 (6), 857(2000).
  4. Dutly, A. E., et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation. Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).
  5. Wagnetz, D., et al. Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs. Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).
  6. Hirayama, S., et al. Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways. Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).
  7. Watanabe, T., et al. Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Transpl Immunol. 69, 101467(2021).
  8. Matsuda, Y., et al. Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation. Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).
  9. Suzuki, Y., et al. Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).
  10. Watanabe, T., et al. A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans. Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).
  11. Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).
  12. Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin. Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).
  13. Sato, M., et al. The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).
  14. Okazaki, M., et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants. A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).
  15. Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
  16. Watanabe, T., et al. A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).
  17. Guo, Y., et al. Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels. Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים