מאמר שיטה

ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול

DOI:

10.3791/65960

⸱

26 בינואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לניקוי אופטי מהיר ובו-זמני, תיוג מוטי עגול ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות על ידי שילוב (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) טכניקת טרנספורמציה קצרה של רקמות עם הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בפרוטוקול תפוקה גבוהה באופן שגרתי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות טכניקות הניקוי הרבות שהתפתחו בעשור האחרון, עיבוד מוחות אנושיים לאחר המוות נותר משימה מאתגרת בשל ממדיו ומורכבותו, המקשים במיוחד על הדמיה ברזולוציה מיקרומטרית. מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע שחזור חלקים נפחיים של המוח האנושי על ידי עיבוד סימולטני של עשרות מקטעים עם פרוטוקול טרנספורמציית רקמות קצר (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), המאפשר ניקוי, תיוג והדמיה רציפה של הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM). SHORT מספק ניקוי רקמות מהיר ותיוג הומוגני של פרוסות עבות עם מספר סמנים עצביים, המאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות עצביות שונות הן בחומר הלבן והן בחומר האפור. לאחר הניקוי, הפרוסות מצולמות באמצעות LSFM ברזולוציה מיקרומטרית ובמספר ערוצים בו זמנית לשחזור תלת ממדי מהיר. על ידי שילוב של SHORT עם ניתוח LSFM בתוך פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה באופן שגרתי, ניתן לקבל שחזור ציטוארכיטקטורה תלת ממדי של אזורים נפחיים גדולים ברזולוציה גבוהה בזמן קצר, ובכך לאפשר אפיון מבני מקיף של המוח האנושי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח הארגון המולקולרי התלת-ממדי והציטוארכיטקטורה של נפחים גדולים של המוח האנושי דורש שקיפות אופטית של דגימות, המושגת באמצעות פרוטוקולים בעלי זמן עיבוד נרחב. טכניקות ניקוי אופטי פותחו כדי למזער את ההטרוגניות באינדקס השבירה (RI) בתוך הרקמות, ובכך להפחית את פיזור האור ולהגדיל את עומק חדירת האור עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה 1,2,3,4,5. ההתקדמות הנוכחית בשיטות ניקוי ותיוג רקמות עמוק מאפשרות הדמיה נפחית של איברי מכרסמים ועוברים שלמים על ידי שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות 6,7,8,9,10,11,12.

עם זאת, שחזור תלת-ממדי נפחי של אזורים גדולים במוח האנושי לאחר המוות עדיין מהווה משימה מאתגרת בהשוואה לאורגניזמים לדוגמה. ההרכב הביולוגי המורכב ותנאי הקיבוע והאחסון המשתנים לאחר המוות עלולים לפגוע ביעילות פינוי הרקמות, עומק חדירת הנוגדנים וזיהוי האפיטופ 13,14,15,16,17,18,19. יתר על כן, חיתוך רקמות מכני וניקוי ותיוג לאחר מכן של כל פרוסה עדיין נדרשים כדי להשיג ניקוי יעיל ותיוג אחיד של אזורי מוח אנושיים גדולים, וכתוצאה מכך זמני עיבוד ארוכים וצורך בציוד מותאם אישית מתוחכם, בהשוואה לאורגניזמים מודל 15,20,21,22.

SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) TISSUE TRANSFORMATION TECHNIQUE פותחה במיוחד כדי לנתח נפחים גדולים של המוח האנושי18,23. שיטה זו משתמשת בשימור מבני הרקמה של פרוטוקול SWITCH11 ובריכוזים גבוהים של מי חמצן כדי להפחית את האוטופלואורסצנטיות של הרקמות, בשילוב עם שחזור אפיטופים. SHORT מאפשר צביעה אחידה של פרוסות מוח אנושיות עם סמנים עבור תת-סוגים עצביים שונים, תאי גלייה, כלי דם וסיבים myelinated18,24. תוצאותיו תואמות את הניתוח של חלבונים בצפיפות נמוכה וגבוהה. רמות השקיפות הגבוהות המתקבלות והתיוג האחיד מאפשרים שחזור נפחי של פרוסות עבות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בפרט, לרכישה מהירה ניתן להשתמש במנגנון יריעות אור 18,24,25,26,27.

בעבודה זו, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בטכניקת טרנספורמציית רקמות SHORT עבור ניקוי סימולטני ותיוג רב-עגול של עשרות חלקי מוח אנושיים קבועים בפורמלין. ניתן להשתמש בארבעה סמנים פלואורסצנטיים שונים יחד, מה שמוביל לזיהוי של תת-אוכלוסיות תאיות שונות. לאחר הניקוי, ניתן לבצע הדמיה נפחית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן, השתמשנו ב- LSFM הפוך בהתאמה אישית 18,24,25,26,27, המאפשר חתך אופטי מהיר של הדגימה ורכישה מהירה של ערוצים מרובים במקביל. בעזרת פרוטוקול זה, בעל תפוקה גבוהה באופן שגרתי, ניתן לקבל אפיון תאי ומבני מקיף ברזולוציה תת-תאית של אזורים נרחבים במוח האנושי, כפי שכבר הוכח במיפוי של אזור ברוקה שלם23.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות רקמה אנושית מקובעת פורמלין סופקו על ידי המחלקה לנוירופתולוגיה בשירות הנתיחה שלאחר המוות של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (MGH) (בוסטון, ארה"ב). הסכמה בכתב התקבלה ממשתתפים בריאים לפני המוות, בהתאם לפרוטוקולי איסוף רקמות שאושרו על ידי IRB מהוועדה לבטיחות ביולוגית מוסדית של השותפים (PIBC, protocol 2003P001937). מסמכי האישור נשמרים בשירותי הנתיחה של MGH בבוסטון, מסצ'וסטס, ארצות הברית, וזמינים לפי בקשה.

1. שיבוץ אגרוז וחיתוך דגימה

  1. הכינו תמיסת אגרוז 4% w/v במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS, pH 7.4) בכד והטמיעו את גוש הרקמה בפנים. המתן עד שהוא יגיע לטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן אחסן ב 4 ° C במשך 24 שעות.
  2. כדי לקבל חתכים מדויקים, הדביקו את הדגימה לדיסק הדגימה של הוויברטום ומלאו את המגש ב-1x PBS קר (pH 7.4). התאם את פרמטרי הוויברטומה כגון תדירות, משרעת ומהירות בהתאם לסוג הרקמה שיש לחתוך (ערכים בשימוש: תדר = 5 (50 הרץ); משרעת = 0.4; מהירות = 3 (0.15 מ"מ לשנייה).
    הערה: יש להשתמש בוויברטומים שונים בהתאם לנפח הדגימה. עבור דגימות עם נפח מרבי של 70 x 40 x 15 מ"מ, ויברטומה (למשל, Leica VT1000 S) ניתן להשתמש; עבור דגימות גדולות יותר, ניתן להשתמש בדחיסה (למשל, VF-900-0Z Microtome18) או במנגנוןמותאם אישית 21. כאן, אנו מציגים פרוסות לחתוך עם עובי של או 400 מיקרומטר או 500 מיקרומטר.
  3. לאחר החיתוך, לשים את כל הפרוסות בתמיסת שימור המורכבת 1x PBS (pH 7.4) עם 0.01% w / v נתרן אזיד (NaN3) ולאחסן ב 4 ° C.
    הערה: לפני ההטבעה, המתן עד שתמיסת האגרוז תגיע ל -37 מעלות צלזיוס. טמפרטורה גבוהה יותר עלולה לפגוע בדגימה. מומלץ לא להשאיר את הדגימות ב- PFA למשך יותר מ -48 שעות מכיוון שקיבוע ממושך עלול להפריע להליך הסימון על ידי פגיעה באנטיגנים והגברת אוטופלואורסצנטיות רקמות. לאחסון ארוך טווח של רקמות אנושיות, PBS עם NaN3 משמש למניעת זיהום מיקרוביאלי. בשל הרעילות של NaN3, הכינו את תמיסת השימור מתחת למכסה מנוע כימי.

2. קיבוע רקמות

הערה: כל הפתרונות המשמשים בפרוטוקול הבא מוכנים בכמויות גדולות, מספיק כדי לעבד את כל הפרוסות של אותו בלוק רקמה ולמזער את השונות הטכנית ולהפחית את הזמן עבור צעדים בודדים.

  1. הכן את פתרון הכיבוי עם 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0.1 M חומצה הידרוכלורית (HCl), 25% v/v 0.1 M אשלגן מימן פתלאט (KHP), ו 4% v/v גלוטאראלדהיד טרי. מניחים את כל הדגימות בכלים עם מכסי בורג (70 x 23 מ"מ) ודגרים עליהם עם תמיסת כיבוי עם ניעור עדין ב 4 ° C למשך יום אחד, להגן עליהם מפני אור עם רדיד אלומיניום.
  2. הכן את פתרון ההפעלה עם 1x PBS (pH 7.4) ו-1% v/v גלוטאראלדהיד טרי. הניחו את כל הדגימות בכלים חדשים ודגרו עליהן עם תמיסת Switch-on עם ניעור עדין בטמפרטורה של 4°C למשך יום אחד, כדי להגן עליהן מפני אור עם רדיד אלומיניום.
    הערה: בשל הרעילות הגבוהה והרגישות לאור של גלוטראלדהיד, הן פתרונות כיבוי והן פתרונות הפעלה חייבים תמיד להיות מוכנים טריים ולהישמר מתחת למכסה המנוע הכימי על קרח. תמיד למלא את המנה עם 20 מ"ל של כל פתרון ולאטום אותו עם parafilm.

3. השבתה וניקוי

הערה: גלוטראלדהיד תגובתי בדגימות חייב להיות מנוטרל על ידי דגירה עם תמיסת אינאקטיבציה המורכבת מ-1x PBS pH 7.4, 4% w/v אצטמיד, 4% w/v גליצין, pH 9.0. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C עד 3 חודשים. כדי להסיר שומנים ולהפוך את הרקמה לשקופה, אנו משתמשים בתמיסת הניקוי המורכבת מ- 200 mM נתרן דודציל סולפט (SDS), 20 mM נתרן סולפיט (Na2SO3) ו- 20 mM חומצה בורית (H3BO3), pH 9.0. יש לאחסן את התמיסה ב- RT מכיוון ש- SDS שוקע ב- 4 °C. כל השלבים הבאים ייעשו בצינורות מלאים בתמיסה.

  1. העבירו את הדגימות מהכלים לצינורות ושטפו במשך 3 x 2 שעות עם 1x PBS pH 7.4 ב-RT ברעד עדין.
    הערה: עבור שלב 3.1, יש צורך לעבוד מתחת למכסה המנוע הכימי בגלל רעילות גלוטראלדהיד. אצטמיד, SDS וחומצה בורית הם גם ריאגנטים רעילים, ויש לטפל בהם תחת מכסה מנוע כימי. תמיד למלא את הצינור עם 50 מ"ל של כל פתרון.
  2. דגרו את הדגימות בתמיסת אינאקטיבציה בטמפרטורה של 37°C באמבט מים למשך הלילה (o/n).
  3. יש לשטוף במשך 3 x 2 שעות ב-1x PBS pH 7.4 ב-RT ברעד עדין.
  4. יש לדגור על הדגימות בתמיסת ניקוי בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 3-7 ימים. שנה את הפתרון כל יומיים (טבלה 1).

4. תיוג חיסוני

הערה: לפני שלב התווית, יש צורך להסיר את SDS שיורית, להפחית את autofluorescence, ולהסיר את המסכה epitopes עם פתרון אחזור אנטיגן המורכב 10 mM Tris בסיס, 1 mM EDTA, ו 0.05% v/v Tween 20, pH 9. רמת החומציות (pH 9) של הפתרון מותאמת לתהליך שליפה יעיל; בסיס Tris פועל כסוכן חציצה כדי לשמור על סביבת pH יציבה; EDTA, שהוא חומר כלאטי, משפר את נגישות האנטיגן. חומר הניקוי הלא יוני Tween 20 מסייע בשיפור חדירות הרקמה. פתרון זה ניתן לאחסן ב 4 °C. חשוב לציין כי למי חמצן בשילוב עם שלב שליפת האנטיגן יש השפעה סינרגטית בהפחתת האות האוטופלואורסצנטי, על ידי פירוק ו / או שינוי הפלואורופורים האנדוגניים האחראים על אות רקע לא ספציפי (כגון ליפופוסצין).

  1. הכינו PBS 1x עם 0.1% v/v Triton X-100 (PBST), חממו אותו מראש ל-37°C ושטפו את הדגימות 3 x 3 שעות במהלך היום ברעד עדין ב-37°C באינקובטור. השאירו את הכביסה האחרונה o/n.
    הערה: אחסן את תמיסת מלאי PBST ב- 4 ° C. חיוני להסיר SDS מהרקמה מכיוון שהוא יכול ליצור משקעים בלתי מסיסים בטמפרטורות נמוכות שעלולים להפריע לתהליכי הרכישה הבאים.
  2. ביום שאחרי, הוסיפו 10 מ"ל של 30% מי חמצן v/v (H2O2) לכל דגימה והשאירו אותה עם ניעור עדין ב-RT למשך 45 דקות.
  3. יש לשטוף 3 x 10 דקות עם 1x PBS (pH 7.4) עם ניעור עדין ב-RT.
  4. מחממים מראש את תמיסת אחזור האנטיגן ב 95 מעלות צלזיוס באמבט מים; מעבירים את הדגימות לתמיסה המחוממת ומשאירים אותן בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. הניחו לדגימות להתקרר ל-RT למשך 40 דקות ברעד עדין.
  6. יש לשטוף 3 x 5 דקות במים נטולי יונים, בניעור עדין.
  7. אזנו את הדגימות ב-PBS ב-4°C למשך 15 דקות.
  8. הכינו תמיסת נוגדנים טרייה העשויה PBST עם 0.01% w/v NaN3 (ראו הערה לשלב 1.3) והוסיפו נוגדנים ראשוניים. דגרו את הדגימות עם התמיסה בצלחות עם מכסי בורג בטמפרטורה של 37°C למשך n ימים (1-7) באינקובטור עם טלטול עדין והגנה מפני אור (טבלה 2).
    הערה: זמן הדגירה תלוי גודל ועובי (טבלה 1 וטבלה 2).
  9. לאחר n ימים, העבירו את הדגימות לצינורות ושטפו 3 x 2 שעות עם PBST שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין באינקובטור.
  10. הוסף נוגדנים משניים ב- PBST עם 0.01% w/v NaN3 ודגור על הדגימות בצלחות חדשות עם מכסי בורג ב- 37 ° C למשך n ימים (1-6) באינקובטור עם טלטול עדין ומוגן מפני אור (טבלה 1 וטבלה 2).
  11. לאחר n ימים, להעביר את הדגימות לצינורות ולשטוף 3 x 3 שעות במהלך היום עם PBST שחומם מראש ב 37 ° C באינקובטור רעד עדין. השאירו את הכביסה האחרונה o/n.
    הערה: מכיוון שטריטון X-100 וטווין 20 צמיגים, פיפטה לאט כדי לאפשר לקצה להתמלא. תמיד למלא את הצינור עם 50 מ"ל של כל פתרון. השתמש 10 מ"ל של פתרונות נוגדנים עבור כל דגימה ולאטום את המנה עם parafilm כדי למנוע אידוי של הפתרון. מכיוון שתמיסות הנוגדנים מכילות NaN3, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעשות בהן שימוש חוזר כדי לסמן דגימות חדשות תוך שבועיים.

5. התאמת אינדקס שבירה

הערה: כדי להשיג רמה גבוהה של שקיפות, יש צורך הומוגניזציה של מדד שבירת הרקמות. כאן אנו משתמשים 2,2'-thiodiethanol (TDE) מדולל ב 1x PBS. פתרונות TDE חייבים להיות מאוחסנים ב- RT.

  1. העבירו את הדגימות למנות חדשות, הוסיפו 30% v/v TDE והשאירו אותן למשך 4 שעות עם ניעור עדין ב-RT.
  2. הסר את תמיסת 30% v/v TDE, הוסף 68% v/v TDE לדגימות, והשאר אותן עם רעד עדין ב- RT.
    הערה: מכיוון ש-TDE צמיג, פיפטה לאט כדי לאפשר לקצה להתמלא. שאיפת אדי TDE או תרסיס עלולה לגרות את מערכת הנשימה. לכן, מומלץ לעבוד באזור מאוורר היטב או להשתמש במנדפים כדי למזער את החשיפה. יש לאחסן פתרונות TDE ב- RT. השתמש ב- 10 מ"ל של פתרונות TDE עבור כל דגימה.

6. הרכבה לדוגמה

הערה: כדי להקל על הרכבת הדגימה ורכישת תמונת LSFM, אנו משתמשים במחזיק דגימה אטום בהתאמה אישית (המכונה "סנדוויץ'"), המורכב משלושה חלקים: שקופית מיקרוסקופ, ספייסר וכיסוי.

  1. הניחו את ספייסר הפלדה (56 x 56 x 0.5 מ"מ3) מעל שקופית המיקרוסקופ (60 x 60 x 1 מ"מ3) והניחו את הדגימה על שקופית המיקרוסקופ.
  2. מניחים בזהירות את כיסוי הקוורץ (60 x 60 x 0.5 מ"מ3), מהדקים הכל יחד ומכינים דבק סיליקון דו-רכיבי ביחס של 1:1. השתמש בכיסוי קוורץ כדי להתאים למקדם השבירה ולהפחית את הסטייה האופטית במהלך תהליך הרכישה.
  3. באמצעות מזרק 1 מ"ל, ממלאים את החלל שבין הספייסר למכסה בדבק סיליקון דו-רכיבי ומניחים לו להתייבש במשך 10 דקות.
  4. הסר את האטבים והשתמש במחט קטנה כדי למלא לאט את הכריך כולו עם 68% v/v TDE.
  5. הכינו דבק טרי ואטמו את הכריך.
    הערה: אם ה-TDE מגיע בטעות לספייסר בשלב 6.1, הדבק לא יתרפא. ודא שלא נוצרות בועות אוויר במהלך שלב 6.2.

7. הפשטה

הערה: השימור המבני והנגישות האפיטופית המשופרת של SHORT מאפשרים תיוג רב-עגול של פרוסות על ידי הסרת הנוגדנים ושמירת הדגימות עם סמנים אחרים.

  1. פתחו את הכריך עם להב, הכניסו את הדגימות לכלים חדשים עם מכסי בורג מלאים ב-30% v/v TDE והשאירו אותם למשך 3 שעות.
  2. מעבירים את הדגימות לצינורות, שוטפים במשך 3 x 2 שעות ב-1x PBS (pH 7.4) ב-RT עם ניעור עדין, ומשאירים את הכביסה האחרונה o/n.
  3. הניחו את הדגימות בתמיסת ניקוי באמבט מים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  4. יש לכבס במשך 3 x 2 שעות ב-1x PBST (pH 7.4) ב-37°C ברעד עדין ולהשאיר את השטיפה האחרונה o/n. כעת המדגם מוכן להיות מסומן שוב החל משלב 4.8.
    הערה: מלא תמיד את הצינור ב- 50 מ"ל מכל תמיסה. השתמש 10 מ"ל של פתרון TDE עבור כל דגימה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר טיפול סימולטני במספר פרוסות, בעובי הנע בין 100 מיקרומטר ל-500 מיקרומטר, בשיטת SHORT. גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן העיבוד הכולל של ההליך כולו. בעבודה זו אנו מספקים תיאור מקיף של כל הצינור (איור 1) לעיבוד מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לאחר המוות בו זמנית, ואנו מדגימים את הפרוטוקול על 24 פרוסות בבת אחת (איור 2A). משך הזמן לניקוי ותיוג משותף נע בין 11 ל-30 יום, בהתחשב בגודל ובעובי הדגימות (טבלה 1), לא כולל הדמיה ועיבוד לאחר הדמיה. לאחר התאמת אינדקס השומנים והשבירה ב-TDE, מושגת שקיפות אופטימלית והומוגנית של כל פרוסות הרקמה גם בחומר האפור וגם בחומר הלבן (איור 2B).

ניתן לבצע את רכישת התמונה באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים מתקדמים שונים, כולל מיקרוסקופ קונפוקלי25 ומיקרוסקופ שני פוטונים14. כאן, השתמשנו ב- LSFMהפוך בהתאמה אישית 18,23 המצויד בארבעה קווי לייזר עירור: 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו- 638 ננומטר, המסוגל לרכוש ארבע תכונות ביולוגיות שונות המסומנות בנוגדנים מצומדים פלואורופורים. איור 3A מראה תמונות מייצגות של פרוסה בעובי 400 מיקרומטר מאזור ברוקה אנושי המסומן במשותף עבור NeuN, סמן פאן-עצבי, סומטוסטטין (SST) וקלטנין (CR), אשר מתייגים שתי תת-אוכלוסיות שונות של תאי עצב בין-עצביים ואת הסמן הגרעיני DAPI (איור 3A,B). בלוח בעובי 400 מיקרומטר ראינו שהפלואורסצנטיות הגלובלית לאורך Z אינה מוגבלת לפני השטח, אלא היא כמעט אחידה לאורך כל עומק הרקמה, אם כי עוצמת האות יורדת מעט באמצע (איור 3C).

כדי להשיג אפיון תאי מקיף יותר של רקמת המוח האנושית, ניתן לבצע תיוג רב-עגול של אותן דגימות על ידי הפשטת הנוגדנים ותיוג מחדש של הדגימה כפי שהודגם במאמר המקורי SHORT. איור 4 (מעובד מ-Pesce et al.18) מדגים את היישום הפוטנציאלי של שבעה נוגדנים שונים על פרוסת רקמה בעובי 500 מיקרומטר שעובדה עם SHORT בשלושה סבבים רצופים של צביעת חיסון. הנוגדנים המשמשים כוללים NeuN, SST, CR, Parvalbumin (PV) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP) כסמנים עצביים מעכבים, חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) עבור תאי גלייה, ווימנטין (VIM) עבור כלי דם (טבלה 2). התוצאות מציגות את היכולת יוצאת הדופן של SHORT לשמר מידע רקמות במהלך הליכי הפשטה שונים, להפחית ביעילות אותות אוטופלואורסצנטיים ולהשיג ניקוי דגימות יעיל.

figure-results-1
איור 1: ציר הזמן של SHORT. סכימה המייצגת את השלבים הדרושים לעיבוד הדגימות באמצעות פרוטוקול SHORT. בכל שלב, עשרות לוחות רקמת מוח אנושית מעובדים יחד. לאחר הטבעה באגרוז וחיתוך, הדגימות ממוקמות בפתרונות Switch-on ו- Switch-off למשך יום אחד כל אחד; שלבי ההשבתה מבוצעים בן לילה ואילו הסרת השומנים באמצעות אינקובציה בתמיסת סליקה אורכת 3-7 ימים. לאחר מכן, הדגימות מודגרות עם פתרונות נוגדנים ראשוניים ומשניים למשך מקסימום של 7 ו -6 ימים, בהתאמה. לאחר התאמת אינדקס השבירה, הדגימות מותקנות במחזיק הדגימה (סנדוויץ') לצורך הדמיה ואחסון LSFM. בכל עת לאחר הרכבת הכריך, ניתן להסיר דגימות ולתייג אותן מחדש לזיהוי סמנים שונים. קיצורים: TDE = 2,2'-thiodiethanol; קצר = SWITCH - H2O2 - אנטיגן Retrieval -TDE; o/n = לילה; RI = מדד שבירה; LSFM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פרוסות מוח אנושיות מגוש של אזור ברוקה מעובדות בו זמנית. (A) עשרים וארבע פרוסות רצופות מאזור ברוקה בגודל 4 x 4 x 0.04 ס"מ3 ב-PBS לפני עיבוד בשיטת SHORT. (B) אותן דגימות ב-A המוצגות לאחר עיבוד SHORT. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. קיצורים: TDE = 2,2'-thiodiethanol; קצר = SWITCH - H2O2 - אנטיגן Retrieval -TDE; PBS = מלח חוצץ פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3. תמונות LSFM מייצגות של פרוסה מובהרת המסומנת בארבעה סמנים שונים. (A) תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (רזולוציה של 3.3 x 3.3 x 3.3 מיקרומטר3) המציגות שחזור מזוסקופי של פרוסה מעובדת קצרה של אזור ברוקה המסומנת עבור NeuN, Somatostatin, Calretinin והסמן הגרעיני DAPI. מימין, התמונה הממוזגת (NeuN-SST-CR-DAPI) מוצגת. סרגל קנה מידה = 0.5 ס"מ. (B) הוספה מוגדלת של התמונה הממוזגת ב - A. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) רזולוציה גבוהה (0.55 x 0.55 x 3.3 מיקרומטר) yz תמונות מ (B). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: TDE = 2,2'-thiodiethanol; קצר = SWITCH - H2O2 - אנטיגן Retrieval -TDE; LSFM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור; NeuN = אנטיגן גרעיני עצבי; SST = סומטוסטטין; CR = calretinin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תמונות LSFM מייצגות של צביעה רב-עגולה בפרוסות בעיבוד קצר. (A) תמונות של חיתוך מוח אנושי לפני ניקוי (ב-PBS) ולאחר התיוג הרב-עגול עם התאמת אינדקס השבירה (68% TDE). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (B) מיזוג הערוצים השונים שנרכשו במהלך שלושה סבבים עוקבים. התמונה מציגה חומר לבן ואפור המסומן בפפטיד מעיים Vasoactive, Somatostatin, Parvalbumin, Calretinin, Neuronal Nuclear antigen, Glial Fibrillary Acidic Protein ו-Vimentin. תמונות חד-ערוציות ברזולוציה גבוהה (רזולוציה של 0.55 x 0.55 x 3.3 מיקרומטר), מוצגות מימין ומתחת לתמונה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר לכל התמונות, למעט GFAP (סרגל קנה מידה 10 = μm). (C) תמונות הקרנה בעוצמה מרבית של פרוסה בעובי 500 מיקרומטר, המראות את האות משבעה נוגדנים שונים המשמשים בשלושה סבבים עוקבים של צביעת חיסון. סיבוב 1: PV-SST-VIP; סיבוב 2: CR-SST-NeuN; סיבוב 3: VIM-SST-GFAP. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. נתון זה שונה מ Pesce et al.18. קיצורים: TDE = 2,2'-thiodiethanol; קצר = SWITCH - H2O2 - אנטיגן Retrieval -TDE; LSFM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור; NeuN = אנטיגן גרעיני עצבי; SST = סומטוסטטין; CR = calretinin; PV = parvalbumin; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי; VIM = וימנטין; VIP = פפטיד מעיים vasoactive. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: אורך זמן מייצג של SHORT עבור דגימות עם מגוון אזורים ועובי. דגימות עם אזורים ועוביים שונים דורשות זמן דגירה משתנה בתמיסות סליקה ונוגדנים, וכתוצאה מכך אורכי זמן ברורים לכל צינור SHORT. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: נוגדנים תואמים ל-SHORT. הטבלה מפרטת את כל הנוגדנים שנבדקו בפרוטוקול SHORT והראו צביעה ספציפית בדגימות מוח אנושיות בעובי 400-500 מיקרומטר. עמודת P/M מציינת נוגדנים רב-שבטיים וחד-שבטיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת-ממדי של אזורי מוח אנושיים גדולים דורשים חתך רקמות מכני ואחריו ניקוי אופטי ותיוג חיסוני של פרוסות בודדות. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטת טרנספורמציית רקמות SHORT לעיבוד מהיר ובו-זמני של מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לשחזור מוח תלת-ממדי ברזולוציה תת-תאית עם LSFM.

בניגוד לגישות אחרות, בשיטת SHORT שלבי הסליקה וריבוי התיוגים אינם דורשים ציוד מותאם אישית מתוחכם. ניתן לעבד חלק גדול מהדגימות לחלוטין, מה שמקצר את זמן העיבוד של בלוקים גדולים של רקמת מוח אנושית וממזער את השונות הטכנית.

טיפולי דה-קולוריזציה וחשיפת אפיטופים הם חיוניים כאשר עובדים עם רקמות אנושיות מבוגרות וקבועות בפורמלין. ניתן להשתמש במי חמצן ובפתרונות אחזור האנטיגן אלקליין בשילוב עם שיטות ניקוי אחרות כגון iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH ו- SHIELD24.

כדי להבטיח שימור מידע אפיטופלי ולהשיג ניקוי אחיד של החומר האפור והלבן, יש צורך להפוך את הדגימה להכלאה של ג'ל/רקמה העמידה בפני חום וריאגנטים כימיים. גלוטראלדהיד נבחר בשל יכולת הקרוסלינקינג המצוינת שלו ויכולתו לחדור את לוח הרקמה ב-pH נמוך (pH=3). ריכוז גלוטראלדהיד הוא גורם קריטי בקביעת חוזק ובהירות הרקמה. ריכוז גבוה יותר מוביל לשימור טוב יותר של מבנה הרקמה, אך גם מאריך את הזמן הדרוש לניקוי. בחירה זו מאפשרת את התוצאות הרצויות מבחינת שימור אפיטופים וניקוי הומוגני. במקרה של פתרון הכיבוי (שלב פרוטוקול 2.1), ריכוז הגלוטראלדהיד נבחר בקפידה ועבר אופטימיזציה כדי לאזן בין קרוסלינקינג יעיל לסליקה מהירה18,25. SHORT מותאם במיוחד לעבודה עם פרוסות מוח אנושיות קבועות פורמלין מאזור ברוקה, ההיפוקמפוס וקליפת המוח 18,23,25. עם זאת, כאשר עובדים עם מודלים ביולוגיים אחרים או אזורי מוח שונים, שינויים מסוימים עשויים להיות נחוצים עקב וריאציות בהרכב של חומר אפור ולבן.

אחת המשימות הקריטיות של פרוטוקול זה היא גם אופטימיזציה של זמן הדגירה בסליקה (שלב פרוטוקול 3.4) ותמיסות נוגדנים (שלבי פרוטוקול 4.8 ו-4.10), הקשורים בעיקר לגודל הדגימה ולהרכב הביולוגי של הרקמה. הערכנו כי 500 מיקרומטר מייצגים את גבול עובי הרקמה כדי להשיג שקיפות אופטימלית הן בחומר הלבן והן בחומר האפור ותיוג אחיד לאורך עומק הרקמה עבור צביעת נוגדנים מספר (טבלה 2). תיאור מפורט של תהליכים אלה ניתן למצוא ב Pesce et al.18 ו Scardigli et al.24. אזורים שונים במוח עשויים להיות בעלי הרכב שונה בשומנים ובחלבונים, ומוחות מזדקנים מפתחים תכולה גבוהה של פיגמנטים מסוג ליפופוסצין ונוירומלנין המייצרים אות אוטופלואורסצנטי חזק ומשנים את דיפוזיית הבדיקה בכל הרקמה. לדוגמה, פרוסה בעובי 400 מיקרומטר של 16 ס"מ2 מאזור ברוקה אנושי זקוקה לטיפול של 7 ימים עם תמיסת הניקוי כדי להגיע לרמה גבוהה של הסרת שומנים. כדי להבטיח הכתמה אחידה בכל עומק הרקמה, נדרשת דגירה עם תמיסות נוגדנים ראשוניות ומשניות במשך 7 ו-6 ימים, בהתאמה (איור 3). לפיכך, נדרש מיטוב עדין לשלבי הסליקה וההתוויה לפני היישום של פרוטוקול התפוקה הגבוהה המתואר כאן.

SHORT מאפשר אחסון דגימות במחזיק הדמיה מותאם אישית מכיוון שהוכח כי האות הפלואורסצנטי נשמר למשך שנה לפחות. לכן החוקרים יכולים להכין את כל הכריכים מראש ולאחסן אותם לשלב ההדמיה שניתן לעשות לאחר מכן. יש לציין כי ניתן להתאים אישית את שקופית המיקרוסקופ, הספייסר וזכוכית הכיסוי המשמשים להכנת הכריכים בהתאם לגודל הדגימה.

הדגימות שעובדו בפרוטוקול SHORT המתואר כאן נותחו באמצעות LSFM הפוךבהתאמה אישית 18,23. מערך זה כולל שתי זרועות המצוידות ב-12x מטרות בהתאמה אישית עם צווארון תיקון אינדקס שבירה (RI). כל מטרה פועלת כזרוע הארה וגילוי בו זמנית, ומאפשרת רכישה בו זמנית של שני ערוצים במהירות נפחית של 0.16 ס"מ3/שעה. מכיוון שמחזיק הדגימה יכול להכיל שני כריכים בכל פעם, אנו יכולים לדמיין ברציפות ארבעה ערוצים בשתי פרוסות תוך 10 שעות. בגלל הרעילות הקלה של אדי TDE למערכת הנשימה, כדי למנוע סטייה כדורית, מחזיק הדגימה מלא בתמיסת גליצרול/מים של 91% v/v התואמת את RI (1.46) הן של כיסוי הקוורץ והן של תמיסת TDE. יש להחליף את תמיסת הגליצרול/מים 91% v/v כל 3 ימים כדי למנוע זיהום אבק. לכן, LSFM שלנו מאפשר רכישה מהירה של דגימות עם הלבנה נמוכה ברזולוציה איזוטרופית של 3.6 מיקרומטר לאחר עיבוד 18,23,29. כמות הנתונים הגדולה שהופקה עובדה באמצעות צינור מוגדר לחיתוך ותפירה מחדש של ערימות התמונות באמצעות תוכנה שפותחה בעצמה, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.

למרות שהשתמשנו ב- SHORT בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור, ניתן להשתמש בסוגים שונים של טכניקות הדמיה פלואורסצנטית לרכישה בהתאם לזמינות המעבדה והיישומים הספציפיים. לדוגמה, ניתן להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי25 או במיקרוסקופ שני פוטונים14 כדי לנתח דגימות שסולקו. סוג זה של ניתוח מומלץ עבור דגימות עם נפחים קטנים יחסית שכן הם מערכות מבוססות סריקה ואת זמן הרכישה עבור אזורי רקמות גדולים הואארוך מאוד 30. על ידי השגת הדמיה מהירה יותר וניתוק רזולוציה צידית וצירית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור הוא השיטה המועדפת להדמיית כמויות גדולות של דגימות מנוקות 3,4,18,31,32,33.

לסיכום, תיארנו פרוטוקול מהיר בתפוקה גבוהה לניקוי סימולטני, תיוג משותף הומוגני ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות. על ידי שילוב SHORT עם דימות LSFM וניתוח חישובי, ניתן לקבל נתונים תלת מימדיים עבור מפקד תאים מקיף וניתוח פרוטאומי של המוח האנושי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לברוס פישל, בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, מרכז א.א. מרטינוס לדימות ביו-רפואי, המחלקה לרדיולוגיה, על אספקת דגימות המוח האנושי שנותחו במחקר זה. פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית מסגרת המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם מענק מס '654148 (Laserlab-Europe), מתוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי למחקר וחדשנות במסגרת הסכם המענק הספציפי מס '785907 (פרויקט המוח האנושי SGA2) ומס '945539 (פרויקט המוח האנושי SGA3), ממרכז תאגיד בית החולים הכללי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר U01 MH117023, וממשרד החינוך האיטלקי במסגרת Euro-Bioimaging Italian Node (תשתית מחקר ESFRI). לבסוף, מחקר זה בוצע בתרומת "Fondazione CR Firenze". התוכן של עבודה זו הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,2'-תיודיתאנולMerck Life Science S.R.L.
אצטמיד >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
חומצה בוריתMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/מותאם אישית
Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום מלח דיהידראטMerck Life Science S.R.L.E5134
גלוטראלדהידMerck Life Science S.R.L.G7651
גליציןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC_29096
מי חמצן 30%Merck Life Science S.R.L.
חממה ISS-4075מלווה מעבדה /
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור (LSFM)//
Loctite AttakHenkel Italia srl/
מיקרוסקופ בהתאמהLaborchimica/טבלית מלח מותאמת אישית
Phospate BufferMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002מחוץ לייצור
אשלגן מימן PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
נתרן אזידMerck Life Science S.R.L.S2002
נתרן דודציל סולפטMerck Life Science S.R.L.L3771
נתרן גופרתיMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlמיכלי כיח מותאמים אישית
(כלים עם מכסי בורג)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ריאגנטים של ITW)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.צינורות T8787
Sarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
ויברטום VT1000SLeica Biosystem/
אמבט מים MemmertWNB 7-45
<נוגדנים חזקים> וצבעים
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215דילול בשימוש, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180דילול בשימוש, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215דילול בשימוש, 1:200
נוגדן Anti-NeuNMerck Life Science S.R.L.ABN91בשימוש, 1:100
נוגדן אנטי-פרוואלבומין (PV)Abcamab32895דילול בשימוש, 1:200
נוגדן אנטי-וימנטין [V9] - סמן שלד ציטו (VIM)Abcamab8069דילול בשימוש, דילול 1:200
קלרטינין פוליקלונליProteinTech12278_1_APדילול, דילול 1:200
DAPIThermoFisherD3571 משומש, 1:100
חמור נגד עכבר IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700דילול בשימוש, 1:200
חמור נגד עכבר IgG H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107דילול בשימוש, 1:200
חמור נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470דילול בשימוש, 1:200
חמור נגד חולדות IgG H& L (Alexa Fluor 568) נספג מראשAbcamab175475דילול בשימוש, 1:200
עיזים נגד עוף IgY H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169דילול בשימוש, 1:500
עיזים נגד עוף IgY H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711דילול בשימוש, 1:500
עיזים נגד עוף IgY H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171דילול בשימוש, 1:500
עז נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077דילול בשימוש, 1:200
רקומביננטי Alexa Fluor 488 נוגדן נגד GFAPAbcamab194324דילול בשימוש, 1:200
נוגדן סומטוסטטין YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706דילול בשימוש, 1:200
דילול מעיים ואזואקטיבי (VIP)ProteinTech16233-1-APבשימוש, 1:200
166782 אישית דילול

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631(2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48(2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684(2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066(2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038(2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447(2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170(2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844(2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234(2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160(2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405(2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808(2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Optical ClearingLight Sheet MicroscopyHuman Brain ImagingTissue ClearingVolumetric ReconstructionAntigen RetrievalNeuronal MarkersImmunostainingRefractive Index MatchingVibratome Sectioning

מאמרים קשורים