התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

James Sandy; Halina Mikolajek; Amy J. Thompson; Juan Sanchez-Weatherby; Michael A Hough

doi:10.3791/65964

Method Article

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

DOI:

10.3791/65964

⸱

March 8th, 2024

James Sandy¹ , Halina Mikolajek¹^,² , Amy J. Thompson¹ , Juan Sanchez-Weatherby¹ , Michael A Hough¹^,²

¹Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, ²Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול להתגבשות חלבונים באמצעות מתקן ההתגבשות במתחם המחקר בהארוול ולאחר מכן באתרו איסוף נתונים קריסטלוגרפיים מקרני רנטגן מגבישים בתוך הלוחות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית רב-תכליתית באתרו (VMXi) של דיאמונד. אנו מתארים דרישות לדוגמה, פרוטוקולי התגבשות והנחיות לאיסוף נתונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים להתגבשות חלבונים רובוטיים באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול ואיסוף נתוני טמפרטורת החדר באתרם מלוחות התגבשות ב- Diamond Light Source beamline VMXi מתוארים. גישה זו מאפשרת לקבוע מבנים גבישיים באיכות גבוהה בטמפרטורת החדר מגבישים מרובים בצורה פשוטה ומספקת משוב מהיר מאוד על תוצאות ניסויי התגבשות וכן מאפשרת קריסטלוגרפיה סדרתית. הערך של מבנים בטמפרטורת החדר בהבנת מבנה החלבון, קשירת ליגנדים ודינמיקה הופך מוכר יותר ויותר בקהילת הביולוגיה המבנית. צינור זה נגיש למשתמשים מכל רחבי העולם עם מספר מצבי גישה זמינים. ניסויי התגבשות המוגדרים ניתנים לצילום ולצפייה מרחוק באמצעות גבישים המזוהים באופן אוטומטי באמצעות כלי למידת מכונה. הנתונים נמדדים במערכת מבוססת תור עם ערכות נתונים של עד 60° סיבוב מגבישים שנבחרו על-ידי המשתמש בלוח. נתונים מכל הגבישים בתוך באר מסוימת או קבוצת מדגם מתמזגים באופן אוטומטי באמצעות xia2.multiplex כאשר היציאות נגישות ישירות באמצעות ממשק דפדפן אינטרנט.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן נותרה כלי מפתח להבנת המבנה והתפקוד של חלבונים, ומספקת מבנים ברזולוציה גבוהה של חלבונים או קומפלקסים שלהם עם, למשל, מצעים או מועמדים לתרופה. עם זאת, במקרים רבים, השגת גבישים בעלי תכונות רצויות - דיפוזיה גבוהה, צורה גבישית הניתנת להשריה וללא פתולוגיות גבישיות כגון תאומים - נותרת צוואר בקבוק ניכר¹. מכיוון שתנאים כימיים מתאימים לייצור גבישי חלבונים אינם ניתנים לחיזוי, באופן כללי, סינון התגבשות החוקר אלפי תערובות כימיות פוטנציאליות הוא סטנדרטי, לעתים קרובות בסיוע אוטומציה/רובוטיקה בהגדרת מסכים ומלונות גבישים לצורך ניטור, לעתים קרובות מרחוק, של תמונות טיפות ההתגבשות המוקלטות.

כאשר מופיעים גבישים, בדרך כלל יש לקצור אותם מסביבת ההתגבשות באמצעות ניילון או לולאת קפטון ולאחר מכן, להעביר אותם לטיפה המכילה חומר הגנה קריו-פרוטקטיבי (שהחיפוש אחריו הוא משתנה נוסף) לפני שהם צוללים-קופאים לחנקן נוזלי. שלבים נוספים אלה בין התגבשות ואיסוף נתוני רנטגן יכולים לכלול התייבשות של טיפת ההתגבשות כאשר הסביבה האטומה שלה נשברת, לחצים מכניים על הגביש בעת הטיפול בו, ונזק מחומרי ההגנה הקריוגרטיים לסריג הגביש (בדרך כלל כתוצאה מכך התפשטות פסיפס מוגברת) בין גורמים אחרים². בנוסף, קצירת גבישים דורשת זמן ועבודה רבה ועלולה להוביל לחוסר הומוגניות בין הדגימות, במיוחד כאשר העור נוצר על טיפות במהלך תהליך הקציר. אלומת VMXi מעניקה גישה לנתונים שמישים מגבישים הדבוקים לצלחת, שאחרת היו מושלכים לאיסוף נתונים.

הרוב המכריע של מבני גבישי קרני רנטגן נקבעים ב 100K באמצעות הגישה לעיל, המאפשרת הובלה וטיפול גבישי פשוט ומאריך את חיי הגביש בקרן הרנטגן בסדרי גודל. עם זאת, יש עניין גובר בקביעת מבנים בתנאים לא קריוגניים, כלומר, הרבה יותר קרוב לתנאים הפיזיולוגיים הרלוונטיים לתפקוד חלבון ^2,3,4. זה מאפשר הערכה הרבה יותר טובה של המבנה הדינמי של חלבונים, מונע קונפורמציות של חומצות אמינו או לולאות להיות מוקפאות במצבים פונקציונליים לא רלוונטיים⁵, ומאפשר לחקור את קשירת הליגנד בתנאים הרבה יותר קרובים לאלה בסביבה הטבעית של החלבון בתוך התא והאורגניזם⁶.

גישה חלופית, המיושמת ב-VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ) בסינכרוטרון של מקור אור יהלום, בריטניה, היא למדוד את נתוני העקיפה ישירות מגבישים בסביבה שבה הם גדלו (כלומר, בתוך לוח ההתגבשות), בתנאי סביבה וללא הפרעה ^7,8. זה מאפשר משוב מהיר מאוד ממסכי התגבשות ואופטימיזציות כדי להנחות את המשתמש לצורה גבישית אופטימלית לדרישותיו. הוא גם מאפשר לייצר מבנים באיכות גבוהה בטמפרטורת החדר באופן אוטומטי⁹.

פרוטוקול זה מניח שלמשתמש יש דגימת חלבון טהורה ביותר המוכנה להתגבשות. אנו מתארים את חוויית המשתמש בגישה למתקן ההתגבשות בהארוול כדי לייצר גבישי חלבון, ולאחר מכן משתמשים ב-VMXi של אלומה לאיסוף נתונים (איור 1).

מתקן ההתגבשות בהארוול

מתקן ההתגבשות בהארוול (CF) ממוקם במתחם המחקר בהארוול (RCaH) בסמוך למקור אור היהלום. המתקן מציע למשתמשים מעבדה אוטומטית בתפוקה גבוהה להתגבשות מקרומולקולרית, תוך שימוש ברובוטיקה לסינון קריסטליזציה, אופטימיזציה של גבישים, דימות גבישי ואפיון. באמצעות אינטגרציה הדוקה עם קו האלומה האוטומטי ביותר של VMXi, קצב קביעת מבני טמפרטורת החדר הואץ מאוד ומאפשר אפיון של מבני חלבונים חדשים, קומפלקסים של ליגנד חלבונים וליגנד DNA, כמו גם סינון מקטעים אוטומטי (איור 1), והכל בתנאים לא קריוגניים.

צינור CF הוא חבילת מכשור הכוללת רובוטים להתגבשות ננוליטר⁹ להתגבשות חלבונים מסיסים וממברנלים, רובוטים לטיפול בנוזלים להכנת מסכי התגבשות מסחריים ומסכי אופטימיזציה מותאמים אישית מורכבים, וארבעה מכשירי הדמיה (אחד ב-4°C ושלושה ב-20°C להדמיית לוחות התגבשות (ראו טבלת החומרים). מכשיר הדמיה אחד מסוגל להדמיה של לוחות זכוכית מסוג שלב מעוקב שומנים (LCP) ומכשיר הדמיה אחד מצויד באופטיקה רב-פלואורסצנטית (שניהם בטמפרטורה של 20°C).

המתקן נמצא כיום בשימוש נרחב על ידי ספקטרום רחב של משתמשים אקדמיים ותעשייתיים, כולל מעבדת חלבון הממברנה (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), מתקן הקרנת שברי XChem ¹⁰, אלומות MX, רכזת XFEL, כמו גם מכון רוזלינד פרנקלין (RFI). צנרת מבוססת וממוטבת זו אפשרה לבצע ניסויי התגבשות במגוון רחב של פרויקטים בתחום הביולוגיה המבנית. מאמר זה מתאר את הצינור עבור גבישים המיועדים לאיסוף נתונים ב-VMXi, אם כי ניתן גם לקצור גבישים ולקרר אותם בהקפאה או להפנות אותם לצנרת XChem.

גישת המשתמשים מוקצית באמצעות מערכת ההצעות Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) ומשתמשים תעשייתיים נתמכים באמצעות קבוצת הקישור לתעשיית היהלומים. כל המשתמשים יכולים להגיע לאתר עם הדגימות או הצלחות שלהם, אשר ניתן להעביר ביד. לא מומלץ לשלוח צלחות באמצעות שליח מכיוון שהניסיון שלנו מצביע על כך שטיפות יכולות להתרחק מהמקום בו חולקו, או שהטיפות עלולות להיפגע ממאגר ההתגבשות. לחלופין, על פי הסדר, משתמשים יכולים לשלוח את דגימות החלבון שלהם ל-CF, שם חברי הצוות עורכים ניסויי התגבשות מטעמם. הניסויים יכולים להיות מנוטרים מרחוק על ידי המשתמש על ידי כניסה לאינטרנט Rock Maker במקרה של CF או באמצעות ISPyB במקרה של VMXi. הגישה ל-CF יכולה להתבצע באופן איטרטיבי בהתבסס על תוצאות עקיפה של קרני רנטגן שנאספו בדיאמונד.

Beamline VMXi ב-Diamond Light Source

Beamline VMXi (להלן "קו האלומה") הוא מכשיר ייחודי שפותח לאחרונה המוקדש במלואו לקריסטלוגרפיה אוטומטית ביותר של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר, עם דגש על מדידת נתונים מגבישים בתוך לוחות התגבשות מתאימים. קו האלומה מציע מיקרו פוקוס (10 x 10 מיקרומטר), קרן ורודה (מעבר פס של <5 × ^10-2ΔE/E) עם שטף גבוה של ~2 × 10¹³ פוטונים לשנייה (ב 16 KeV)⁷. אלומת שטף גבוהה זו, יחד עם גלאי מהיר, מאפשרת תפוקה גבוהה מאוד של דגימות ואיסוף נתונים מדגימות בגודל של למעלה מ-10 מיקרומטר.

לוחות התגבשות נכנסים לקו האלומה על ידי אחסון במערכת אחסון לדוגמה ומצולמים על פי לוח הזמנים שסופק על ידי המשתמש בעת רישום הלוחות באמצעות ממשק ISPyB¹¹ SynchWeb¹². בדרך כלל, מומלץ למשתמשים לבחור רצף פיבונאצ'י של נקודות זמן להדמיה (0, 12, 24, 36, 60... 7,320 שעות מכניסת הצלחת למערכת). המשתמש מקבל הודעה בדוא"ל לאחר צילום לוחית. הן אור נראה והן הדמיית אור UV זמינים למשתמשים לפי דרישה. התמונות שצולמו על ידי מערכת אחסון הדגימות מנותחות על ידי אלגוריתם למידת מכונה; פעולה זו מאתרת ומגדירה באופן אוטומטי נקודות עניין של אובייקטים הדומים לגבישים ורושמת את נקודות העניין המוכנות להוספה לתור לאיסוף נתונים. משתמשים יכולים גם ללחוץ ידנית על תמונות האור הנראה כדי לרשום נקודות עניין או יכולים ללחוץ ולגרור אזור לניתוח על ידי סריקת רסטר. נקודות אלה זמינות למשתמשים כדי להוסיף לתור לצד הנקודות הממוקמות באופן אוטומטי.

ברגע שלכל הדגימות יש פרמטרים מתאימים לאיסוף נתונים, הלוח נכנס לתור. כאשר הצלחת מגיעה לראש התור, היא מועברת אוטומטית לקו הקורה. לוחות ההתגבשות נטענים ממלונות הגביש אל קו האלומה באופן אוטומטי על ידי זרוע רובוטית, ולאחר התאמת תמונות נמדדים מערכי נתונים קריסטלוגרפיים של עד 60° סיבוב מכל גביש שנבחר בהתאם להוראות שהוגדרו על-ידי המשתמש. ניתן להשתמש בכל הטיפות בתוך צלחת לניסויים אלה על קו הקורה. הנתונים מתמזגים מגבישים מרובים כדי לייצר ערכות נתונים איזומורפיות הממוזגות בצורה אופטימלית באופן אוטומטי ^7,9. לאחר איסוף כל ערכות הנתונים בתור, המשתמש נשלח הודעת דוא"ל עם קישור לעקוב אחריו כדי להציג את ערכות הנתונים ב- ISPyB¹¹, כמו באלומות אחרות של Diamond MX. המשתמשים מופנים גם לדף האינטרנט beamline (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור גבישים בתוך לוחות באתרם באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול

הערה: הגישה ל-CF נתמכת במספר מסלולים שונים ותלויה ביישום הפרויקט ובסוג המשתמש (אקדמי או תעשייתי). לפרויקטים של XChem ו-MPL יש מערכת בקשת הצעות משלהם באמצעות מערכת ניהול המשתמשים (UAS) וניתן להגיש אותם באמצעות מסלול הגישה הסטנדרטי (כולל iNEXT Discovery ו-EUbOPEN) או באמצעות BAG Access. הפרוטוקול שלהלן ספציפי למשתמשי VMXi.

הגשת הצעות והכנה לביקור
1. ספק מידע על הפרויקט לבקשת הצעת BAG או הוסף אותו להצעת BAG פעילה. בדרך כלל יש רכז BAG, שמארגן את הניירת. לחלופין, הגש הצעת גישה מהירה לגישה לקו הקורה.
2. ודא כי הדגימה נרשמה ואומתה בטיחות במל"ט על הצעה לפני ההגעה לאתר באמצעות שליח או באופן אישי.
3. ודא שהמשתמש רשום (עם FedID וסיסמה).
4. ודא שהמשתמש נוסף להצעת MX כעמית בכטב"ם על ידי מתאם BAG.
5. מלא את טופס פרטי דוגמת התגבשות קו הקרן ושלח את הטופס VMXi@diamond.ac.uk.
6. תקשר עם צוות קו האלומה לגבי דרישות הניסוי וזמינות קו האלומה.
7. אם דגימות חלבון נשלחות, יש לשלוח דגימות רק בתיאום מראש. עיין בסעיף 1.2 לקבלת פרטים.
8. אם המשתמש אמור להיכנס לאתר כדי להתקין לוחות התגבשות ב- CF, בדוק עם צוות המתקן לגבי זמינותו של משבצת זמן לשימוש במכשור המתקן ופעל לפי סעיף 1.2.1.
9. אם המשתמש מביא צלחות לאתר, יש לוודא שהדגימה מחולקת לסוג הצלחת הנכון ולמקם את טיפות ההתגבשות במיקום הנכון ובכמות הנכונה. עקוב אחר סעיף 1.2.2. קו הקרן מקבל רק לוחות התגבשות ספציפיים באתרם (Greiner CrystalQuickX ו- MiTeGen In Situ-1); ודא כי טיפות אינן גדולות מ 200 nL.
ניסוי התגבשות שנערך ב-CF
הערה: המתקן מציע מספר שיטות התגבשות מקרומולקולרית בתפוקה גבוהה כגון דיפוזיה של אדים וכן התגבשות אצווה תחת שמן ו- LCP. מומלץ להתחיל עם 70-100 מיקרוליטר חלבון טהור ולבצע ניסויי דיפוזיה באדים לחלבונים מסיסים עם שלושה מסכים ביחס של 100 nL של תמיסת חלבון ו-100 nL של תמיסת מאגר התגבשות ודגירת הלוחות ב-20°C. מספר מסכים מסחריים זמינים בתוך המתקן. לחות ובקרת טמפרטורה זמינים עם 4 °C ו 20 °C בשימוש ביותר. משתמשים המבקרים ב- CF מקבלים הכשרה ותמיכה סטנדרטיים בהפעלת מכשור ההתגבשות וישתמשו בהגדרות המתוארות כאן.
1. דוגמאות משלוח להתקנה ב- CF
  הערה: לפני ההגעה לאתר, דגימת החלבון חייבת להיות מאומתת על פי הצעה במערכת הכטב"מים. לאחר הגעת דגימת החלבון לאתר, חברי הצוות יבצעו ניסויי התגבשות בהתאם להנחיות בתקשורת קודמת עם המשתמש. אישור יישלח בדואר אלקטרוני עם פרטי ברקוד ללוחות ההתגבשות הניסיוניים. המשתמש יתבקש להוסיף את לוחות ההתגבשות כמיכלים להצעה הרלוונטית. לאחר שהדבר נעשה, ניתן לאחסן את הלוחות במכשירי הדמיה אוטומטיים במתקן ההתגבשות או בקו הקורה. ISPyB יהיה הממשק המשמש לאינטראקציה בקו האלומה.
  1. לספק את תמיסת דגימת החלבון בריכוז להתגבשות בכפולות של 25 μL aliquots. תייגו בבירור את צינורות הדגימה המכילים את דגימת החלבון.
  2. במידת הצורך, ספק תמיסת חיץ חלבונים, תמיסת ליגנד או תמיסת מאגר.
  3. הודע לצוות המתקן באילו מסכים ויחסי נפילה יש להשתמש.
2. הגדרות לוח התגבשות
  הערה: אנו דורשים שטיפות ההתגבשות בלוח Greiner CrystalQuickX ו- MiTeGen In Situ-1 יהיו במיקום מסוים; צלחות שהוקמו במקום אחר צריכות להשתמש בהגדרות הבאות של מוסקיטו¹³ המתוארות כאן.
  1. כדי להתאים את הגדרת הצלחת עבור MiTeGen In Situ-1, פתח את תוכנת Mosquito SPT ולחץ על דף הגדרת הצלחת הסטנדרטי MiTeGen In Situ-1 על ידי לחיצה על הגדרה | 96 באר | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 טיפות) (איור 2A). לחץ על לחצן העריכה ותקן את הערכים עבור מיקום תת-באר 2: X היסט ל - 1.2 ו- Y היסט ל- 1.8 ועבור מיקום תת-באר 3: X היסט ל- 1.3 ו- Y היסט ל - 1.8 (איור 2B,C).
  2. כדי להתאים את הגדרת הצלחת עבור Greiner CrystalQuickX, פתח את תוכנת Mosquito SPT ולחץ על דף הגדרת הצלחת הסטנדרטי של Greiner CrystalQuickX על-ידי לחיצה על הגדרות | 96 באר | Greiner CrystalQuickX (איור 2D). לחץ על לחצן העריכה ותקן את הערכים עבור מיקום תת-באר 1: X היסט ל - 1.95 ו- Y היסט ל- 1.45 ועבור מיקום תת-באר 2: X היסט ל- 1.95 ו- Y היסט ל - 1.45 (איור 2E,F).

2. שימוש בקו האלומה ב-Diamond Light Source

הערה: כל האינטראקציה עם קו האלומה על ידי משתמשים מתבצעת מרחוק באמצעות ממשק ISPyB¹¹ . אין צורך בנוכחות פיזית בקו האלומה והנתונים נאספים באמצעות מערכת מבוססת תור במקום להיות מתוזמנים בזמן מסוים. למשתמשים תהיה הצעה המשויכת לגישה שלהם למקור אור היהלום. בקו האלומה, לכל לוח התגבשות מוקצה ביקור ייחודי והוא מוגדר כ'מיכל' בתוך ISPyB¹¹ המקביל לפאק המכיל דגימות במהירות של 100K. לא ניתן ליצור מסכי אופטימיזציה באמצעות ממשק SynchWeb וככזה, מידע מתווסף בדרך כלל לסעיף ההערות (ראה שלב 2.1.4). האדם הרושם את הצלחת יצטרך לבדוק את כתובת הדוא"ל מכיוון שבעל הצלחת יקבל הודעות דוא"ל לגבי הדמיה וכן הודעות על השלמת לוחית.

רישום לוחיות
1. היכנס ל- ISPyB עם FedID יהלום מתאים ובחר הצעות. חפש את הצעת העניין על ידי גלילה או הקלדה של מספר ההצעה בסרגל החיפוש. בחר משלוח מהתפריט הנפתח תחת מספר ההצעה (איור 3A), אשר יפתח את החלון משלוחים עם משלוחים באותה הצעה. לחץ על +הוסף משלוח בפינה השמאלית העליונה (איור 3B) כדי לפתוח את החלון הוסף משלוח חדש , תן שם למשלוח, לחץ על Automated/Imager ולאחר מכן לחץ על הלחצן Add Shipment בפינה השמאלית התחתונה (איור 3C).
2. בחלון המשלוח (איור 3D), לחץ על +הוסף מכולה, אשר תציג לאחר מכן את תצוגת הדף הוסף גורם מכיל (איור 3E). בחר בתפריט הנפתח סוג מיכל אחד מסוגי הלוחות הרלוונטיים. הדף ישתנה כדי לשקף את סוג הגורם המכיל שנבחר. הזן שם ברקוד ומיכל בהתאם להוראות הדוא"ל מצוות beamline הספציפיות ללוחות הניסוי. שים לב שהוא תלוי רישיות.
3. בחר VMXi 20 °C imager מהתפריט הנפתח Requested Imager , לוח הזמנים להדמיה של פיבונאצ'י מהתפריט הנפתח Imaging Schedule , מסך ההתגבשות מהתפריט הנפתח Crystallization Screen ושם המשתמש מהתפריט הנפתח Owner , לחץ על הלחצן View והזן את כתובת הדוא"ל הנכונה ליצירת קשר בתיבה Email (איור 3F).
4. הזן פרטים נוספים על הצלחת בתיבה הערות . בחר את הדגימה הרלוונטית מהתפריט הנפתח חלבון , והשתמש בראשי התיבות הרשומים במל"ט ואושרו על ידי Diamond במסגרת הצעת הניסוי. הזן את אותו שם בתיבה שם לדוגמה ; השאר את שאר התיבות ריקות.
5. לחץ על סמל +Plate כדי לשכפל את הדגימה על כל הלוח ולאכלס את המכל כולו בריבועים ירוקים. לחץ על +הוסף גורם מכיל בתחתית הדף כדי לרשום את הצלחת. בקש מאיש צוות בקו הקורה להעביר את הצלחת למכונת הצילום המתאימה, שם היא תאוחסן ותוצולם. ביקור ייווצר כאשר המיכל יאוחסן בתמונות והמשתמש יקבל דוא"ל עם קישור לצלחת ולתמונות שלה.
הצגת תוצאות הדמיה
1. נווט אל הצעת העניין (שלבים 2.1.1), בחר גורמים מכילים מהתפריט הנפתח תחת מספר ההצעה וצפה ברשימת הגורמים המכילים הזמינים עבור ההצעה. בחר בלוחות המסנן אם קיימים סוגים אחרים של מחזיקי דוגמאות. כדי לצמצם עוד יותר את החיפוש, סמן את התיבה הגורמים המכילים שלי כדי להציג רק את הגורמים המכילים הרלוונטיים ביותר המשויכים למזהה המשתמש הנוכחי שמחובר. לחץ על הגורם המכיל המתאים על-ידי הזזת הסמן מעל השורה הבודדת ולחיצה שמאלית על העכבר.
2. לאחר בחירת המיכל, תוצג תצוגה חדשה, המציגה סקירה כללית של הצלחת (איור 4A). לחצו על טיפה בייצוג הלוח בצד שמאל של הצג כדי להציג את התמונה העדכנית ביותר מהטיפה המתאימה. השתמש במקשי החצים כדי לנווט בין טיפות, או בחר טיפות בודדות באמצעות עכבר/סמן.
3. כדי להציג תמונות היסטוריות של טיפה, לחץ על כפתור H והמתן לגלריית תמונות קופצת שתופיע מעל תמונת הטיפה הנוכחית. רחף עם הסמן מעל התמונות הבודדות כדי לעדכן את תמונת השחרור הראשית.
4. ניקוד תמונות כדי לציין את המצב של כל טיפה על ידי לחיצה על 0 - 9 כפתורים. כדי לראות את הקטגוריות הבודדות, פתח את התפריט הנפתח ציון בפינה השמאלית העליונה של תמונת השחרור. חפשו צלבים כחולים בכל אחת מתמונות הטיפה, שהם תוצאה של אלגוריתם (CHiMP) שאומן לחפש "גבישים" בתוך התמונות.
5. לחץ על כפתור הסמל השלישי שנקרא מדידה בצד הימני העליון של תמונת השחרור כדי לגשת לכלי מדידה. כדי להשתמש בכלי זה, לחץ וגרור קו, וסרגל יתרחב וייתן את המרחק במיקרומטר.
6. כדי לבקש הפעלת הדמיה נוספת, לחץ על גלוי או על UV בתיבה הנפתחת הסמוכה לכותרת פעולות בתחתית הדף. לאחר מכן, לחץ על הלחצן Request Plate Imaging .
בחירת קריסטל/CHiMP
1. כדי להוסיף נקודות לאיסוף נתונים באופן ידני, לחץ על לחצן +נקודת סימון . העבר את הסמן מעל נקודת העניין הרצויה ובחר. המתן להופעת הצלב האדום.
  הערה: ניתן ליצור עד 100 אובייקטים בכל טיפה.
2. כאשר כל הנקודות מסומנות, לחץ על הלחצן +סיום . זכור גם ללחוץ על לחצן +סיום לפני שתנסה למדוד אובייקטים. כדי להוסיף אזורים לאיסוף נתונים באמצעות סריקות רשת, לחץ על הלחצן +Mark Region . לחץ על הנקודה השמאלית העליונה וגרור למטה וימינה כדי ליצור אזור שייסרק על קו הקרן. בדומה לנקודות, לחץ על הלחצן +Finish כשכל האזורים הרצויים נוצרים.
  הערה: עדיף ליצור אזור אחד גדול יותר מאשר אזורים קטנים רבים.
3. שימו לב לצלבים הכחולים שכבר מופיעים על תמונות השחרור, שהם תוצאה של אלגוריתם שנועד לאתר באופן אוטומטי עצמים גבישיים (CHiMP). כדי להמחיש את הערכת CHiMP של טיפות התגבשות, לחץ על תיבת הסימון הצג ציונים אוטומטיים ולאחר מכן שנה את התפריט הנפתח עבור Class. בדרך כלל, ההגדרה השימושית ביותר כאן היא אפשרות הגביש (איור 4B).
  הערה: זוהי תכונה חדשה ולא מובטח למצוא את כל הגבישים וייתכן גם למצוא עצמים אחרים שאינם גבישים.
4. לאחר שכל הנקודות והאזורים סומנו בטיפות המתאימות, לחץ על לחצן הכן לאיסוף נתונים בתחתית העמוד.
הכנת דוגמאות לאיסוף נתונים
1. התבוננו ברשימת הדגימות המכילות את הנקודות או האזורים שנבחרו בשלב הקודם, או ממוקמות אוטומטית (איור 4C). הוסף נקודות או אזורים בודדים על-ידי לחיצה על לחצן + או הוסף את כל הדוגמאות המוצגות על-ידי לחיצה על לחצן הוסף עמוד נוכחי לתור .
2. מסננים זמינים להצגת נקודות נקודה, אזור, אוטומטי או ידני בלבד. כדי להציג רק את הדגימות שלא צולמו (כלומר, נחשפו לקרני רנטגן), לחץ על האפשרויות ללא נתונים ולא הושלמו מעל לחצני הסינון.
3. בחר דוגמאות בודדות על ידי לחיצה על השורה המתאימה ועדכן את התמונה בצד ימין של המסך כדי להציג את הטיפה הנכונה ואת הנקודה הבודדת. אם יש דוגמאות רבות ברשימה, הגדל את מספר הדגימות המוצגות בכל עמוד על-ידי בחירת התפריט הנפתח עם 10 כברירת מחדל ועד 100 כמספר הדגימות המרבי המוצג.
4. לאחר שכל הנקודות והאזורים נוספו לתור, ודא שכל הפרמטרים של איסוף הנתונים הניסיוניים משויכים לכל ניסוי.
  1. השתמש במסננים עבור נקודה, אזור, ידני ואוטומטי. לחץ על מסנן הצבע ולחץ על תיבת הסימון בחר הכל מתחת ללחצני הסינון כדי להחיל בו-זמנית פרמטרים על כל הדגימות הגלויות ברשימה הנוכחית של דוגמאות בתור .
  2. בחר פרמטרים ניסיוניים מהתפריט הנפתח בצד ימין של המסך מתחת לתמונת השחרור (איור 4D). עבור אזורים, בחר באפשרות של סריקת רשת DMM 10 מיקרון צעדים, 100 אחוז שידור. עבור כל שאר ניסויי הנקודות , בחר אפשרויות אחרות מהתפריט הנפתח בהתאם לצורך.
  3. לאיסוף נתוני תנודה, לחץ על האפשרות Omega Scan DMM 60 מעלות 5 אחוז שידור כדי לאסוף את כמות הנתונים המרבית מדגימה בודדת. החל סיבובים קטנים עבור גבישים קטנים מאוד או דגימות רגישות לקרינה ושנה את השידור בהתבסס על ניסיון קודם עם צורה גבישית מסוימת. לאחר שכל הדגימות הוחלו כראוי פרמטרים ניסיוניים, לחץ על הלחצן תור גורם מכיל בתחתית הדף.
5. לאחר שהצלחת הגיעה לראש התור, היא תוצג לקו האלומה, ייאספו מערכי נתונים, ואז היא תחזור שוב לאחסון הדגימה בתוך קו האלומה. לאחר השלמת איסוף הנתונים מלוחית, חפש דוא"ל עם קישור לעקוב אחריו כדי לגשת לנתונים הרלוונטיים.
יצירת קבוצות לדוגמה
הערה: ניתן ליצור קבוצות לדוגמה כדי לקבץ דגימות דומות על פני טיפות או לוחות מרובים. כל מערכי הנתונים בתוך קבוצות מדגם אלה יעובדו באמצעות צינור xia2.multiplex¹⁴ לאחר עיבודו על ידי DIALS. זה יכול להיות שימושי בעת איסוף טריזים קטנים מאוד של נתונים, ועשוי להיות שימושי גם כדי להגדיל את האות לרעש עבור ניסויים קשירת ליגנד.
1. בחר ניהול קבוצות לדוגמה מהתפריט הנפתח תחת מספר ההצעה. חפש רשימה של קבוצות אם הן כבר נוצרו על-ידי משתמשים אחרים. כדי ליצור קבוצה חדשה, לחץ על הלחצן +צור קבוצה לדוגמה . לחץ על משלוח מהתפריט הנפתח בדף יצירת קבוצה לדוגמה כדי לראות את מציג הדוגמאות (איור 5A). לחץ על הגורם המכיל המכיל את הדוגמאות הרלוונטיות מהרשימה המאוכלסת.
2. לאחר לחיצה על גורם מכיל, חפש גרפיקה המציגה את סקירת הלוחות.
3. לחץ על טיפות בנפרד על-ידי לחיצה על הטיפה הבודדת (איור 5B) או לחץ על טיפות בשורות או בעמודות על-ידי לחיצה על השורה, האות או מספר העמודה הרלוונטיים. לאחר שכל הבארות המשויכות לקבוצה מסוימת נבחרו, הזינו שם לקבוצה בתיבה 'שם קבוצה לדוגמה ' ולחצו על הלחצן 'שמור קבוצה לדוגמה '. לחץ על לחצן הצג קבוצות לדוגמה בדף זה כדי לחזור לרשימת קבוצות המדגם שכבר נוצרו המשויכות להצעה (איור 5C).
עריכת קבוצות לדוגמה
1. לחץ על קבוצה לדוגמה מרשימת הקבוצות בדף ניהול קבוצות לדוגמה .
2. לחץ על הלחצן +Edit Sample Group הסמוך לגורמים המכילים המופיעים מתחת למידע הקבוצה (איור 5C).
3. שימו לב לטיפות, שכבר משויכות לקבוצת דגימה, המודגשות בסקירת הצלחת.
4. הוסף טיפות נוספות לקבוצת הדוגמאות על-ידי לחיצה על טיפות, בארות או עמודות כמו קודם.
  הערה: לא ניתן להסיר טיפות מקבוצת דוגמאות.
5. לאחר הוספת טיפות נוספות, ערוך את שם הקבוצה לדוגמה ולאחר מכן שמור אותו, או פשוט שמור אותו על-ידי לחיצה על הלחצן שמור קבוצה לדוגמה .
ויזואליזציה וניתוח של הפלט של קבוצות מדגם
1. לחץ על קבוצה בודדת מרשימת הקבוצות לדוגמה כדי להציג את סקירת הלוח של הגורם המכיל או הגורמים המכילים המשויכים לקבוצה. הטיפות הכלולות בקבוצה יודגשו בתצוגה זו (איור 5D).
2. חפש רשימה המכילה את שלוש המשימות המרובבות האחרונות הכרונולוגיות אם נאספו נתונים בקבוצה זו.
3. לחץ על הקו להפעלת מולטיפלקס כדי לעדכן את תוצאות העיבוד להלן.
4. שים לב ללחצן הקישור המהיר , המציג את מספר ערכות הנתונים המשויכות לקבוצה. לחץ על לחצן זה כדי לפתוח דף חדש של אוספי נתונים המציג את אוספי ערכות הנתונים הבודדים.

3. גישה לעיבוד הנתונים האוטומטי

הערה: לאחר איסוף הנתונים, הם מועברים דרך מספר צינורות עיבוד נתונים אוטומטיים. ארבעת הצינורות הסטנדרטיים המשמשים לאורך אלומות MX בדיימונד מופעלים גם הם על נתונים שנאספו בקו האלומה. הם 'fast_dp', 'חיוג xia2', 'xia2 3dii' ו- '^autoPROC'15. 'fast_dp' יספק הפחתת נתונים מהירה כדי להעריך במהירות את האיכות. שלושת הצינורות האחרים ידרשו זמן חישוב רב יותר ויפעילו מגוון חבילות תוכנה שונות להפחתת נתונים לצורך השוואה. בהתאם לכך, הפלט הוא בדרך כלל באיכות גבוהה יותר מאשר פלט 'fast_dp'. מערכי הנתונים שייאספו על קו האלומה ירוצו גם באמצעות תוכנת המיזוג הרב-גבישית האוטומטית 'xia2.multiplex'14, שתמזג את כל מערכי הנתונים בתוך קבוצה מוגדרת. שים לב שבעוד שסריקות רשת אינן מעובדות כעת באופן אוטומטי, ניתן לעבד את הנתונים באופן ידני באמצעות צינור 'xia2.ssx'. את התוצאות של צינורות העיבוד האוטומטיים ניתן למצוא ב- ISPyB¹¹ באמצעות הפרוטוקול הבא.

איתור מערכי הנתונים
1. היכנס אל ISPyB כמתואר לעיל ובחר הצעות.
2. חפש את הצעת העניין על ידי גלילה או הקלדה של מספר ההצעה בסרגל החיפוש.
3. לחץ על הביקור הרצוי מהרשימה המופיעה על המסך כדי לגשת לחלון אוספי הנתונים עבור ביקור זה.
4. החל את כל המסננים הרצויים.
  הערה: מסנן פופולרי הוא מסנן 'משולב אוטומטית', שיציג רק ערכות נתונים שפעלו בהצלחה דרך צינור עיבוד אחד או יותר. פעולה זו לא תכלול סריקות רשת מכיוון שהן אינן מעובדות כעת באופן אוטומטי באמצעות ISPyB.
5. גלול מטה בדף כדי למצוא את ערכת הנתונים המעניינת.
  הערה: כל ערכת נתונים תציג את מזהה הדגימה, את הפרמטרים הניסיוניים שבהם נעשה שימוש, מציג תמונות עקיפה, מציג תמונות קריסטל ותרשים ניתוח לכל תמונה לתצפית מהירה על איכות הנתונים.
כדי לגשת לתוצאות העיבוד האוטומטי
1. לחץ על הכרטיסיה עיבוד אוטומטי מתחת לסיכום הנתונים של ניסוי ספציפי כדי לבדוק את התוצאות של הפחתת הנתונים האוטומטית (איור 6A).
2. לחץ על הכרטיסיות השונות המתאימות לצינורות השונים כדי לראות סיכום מפורט של כל פלט.
  הערה: אם הוגדרו קבוצות לדוגמה, יהיו שתי כרטיסיות המתאימות למשימות מרבבות. אחד יתאים למיזוג של כל מערכי הנתונים בקבוצה עד לאותה נקודה, ואילו השני יתאים למיזוג של מערכי נתונים בתוך אותה טיפה בלבד.
3. לחץ על Logs &; Files כפתור כדי להוריד את קבצי ה- .mtz המתקבלים אם העיבוד היה מוצלח וכל קבצי היומן המשויכים. לחץ על הכרטיסייה עיבוד במורד מתחת לקטע עיבוד אוטומטי כדי להציג את הפלט מ- DIMPLE.
  הערה: DIMPLE יפעל רק אם קובץ PDB סופק במהלך שליחת הדגימה.
4. לחץ על Logs &; Files כפתור להורדת כל פלט שנוצר מ- DIMPLE.
כדי לגשת לתוצאות המרבב הקבוצתי, פתח את התפריט הנפתח בחלק העליון של המסך עם מספר ההצעה כתוב עליו ולחץ על ניהול קבוצות לדוגמה. לחץ על השורה המתאימה לקבוצה הרצויה בתוך המיכל הנכון. גלול מטה כדי למצוא את רשימת יציאות המרובב המתאימות לקבוצה כפי שהיא מיוצגת חזותית על-ידי דיאגרמה של הלוח.
1. לחץ על פלט המרבב הרצוי מהרשימה שניתנה. לחץ על לחצן ערכות הנתונים xxx , כאשר xxx הוא מספר ערכות הנתונים הממוזגות (איור 6B).
  הערה: פעולה זו תפתח את המסך אוספי נתונים , אך רק ערכות הנתונים ממשימת המרבב שנבחרה יוצגו.
2. לחץ על הכרטיסייה עיבוד אוטומטי של הניסוי העליון.
3. לחץ על הכרטיסייה Multiplex Processing המתאימה למספר הנכון של ערכות נתונים ממוזגות.
4. לחץ על Logs &; Files כפתור להורדת קובץ ה- .mtz וקבצי היומן המתאימים (כמו בשלב 3.2.3.)
כדי לגשת לתוצאות סריקת רשת
1. נווט אל המסך אוספי נתונים עבור הביקור הרצוי. תוצאות נתוני סריקת הרשת יוצגו לצד כל נתוני הסיבוב שייאספו.
  הערה: לא יהיו תוצאות עיבוד אוטומטי.
2. התמונה של טיפת הגביש תהיה מכוסה ברשת עם מפת חום המייצגת את נוכחות העקיפה. לחצו על ריבוע כדי להציג את תמונת העקיפה של מיקום זה ברשת. לחץ על התפריט הנפתח בחלק העליון של תמונת באר הגביש כדי לשנות את מה שמפת החום מייצגת. ברירת המחדל היא עוצמת עקיפה כוללת, אך ניתן לשנותה לנקודות כוללות, לרזולוציה משוערת או למסגרות ללא קרח.

4. עיבוד מחדש של נתונים

הערה: ניתן לעבד מחדש ערכות נתונים נבחרות באמצעות ממשק ISPyB¹¹ באמצעות אותם צינורות עיבוד המופעלים באופן אוטומטי עם הגדרות שהשתנו כפי שהוגדרו על-ידי המשתמש. ניתן להחיל חיתוך רזולוציה; אם הסימטריה / התא של הגביש ידועה, אז זה יכול להיות מוגדר גם כדי להבטיח כי צינורות עיבוד לרוץ בסביבה הנכונה. ניתן גם למזג טווחי תמונות נבחרים בערכות נתונים ספציפיות באמצעות צינורות רב-גבישיים זמינים. זה עשוי להיות יתרון אם נזק קרינה שיטתי גורם לחלק האחרון של תמונות עקיפה להיות באיכות ירודה. זוהי גם אפשרות עבור המשתמש להוריד את מערכי הנתונים שלהם באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל ולהריץ את תוכנת העיבוד מחדש הרצויה באופן מקומי, הדרכות שעבורן זמינות באופן חופשי במקום אחר (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

כדי לעבד מחדש ערכות נתונים נפרדות מרובות
1. היכנס ל- ISPyB ונווט אל מערכי הנתונים המעניינים (שלב 3.1).
2. לחץ על ערכת נתונים ולחץ על סמל גלגל השיניים בשורת הכותרת של ערכת הנתונים (איור 6) כדי לפתוח את חלון העיבוד מחדש.
3. הגדר את כל ההגדרות הרצויות ובחר אילו מסגרות ייכללו בעיבוד מחדש.
  הערה: ניתן להגדיר את טווח התמונות על-ידי הקלדת טווח בתיבות המסומנות או על-ידי לחיצה וגרירה של האזור הרצוי בתרשים הניתוח לכל תמונה (איור 7A).
4. אופציונלי: כדי להוסיף ערכת נתונים נוספת לעיבוד מחדש בודד, לחץ על סמל גלגל השיניים שלו והוא יופיע בחלון העיבוד מחדש מתחת לערכת הנתונים הראשונה. סמן את התיבה תהליך בנפרד .
5. לחץ על הלחצן שלב .
כדי לעבד מחדש נתונים מרובי גבישים
1. פתח את חלון העיבוד מחדש מכל ערכת נתונים.
2. לחץ על Multi-Crystal כפתור כדי לפתוח מסך חדש.
3. גלול מטה כדי למצוא סדרה של עלילות ניתוח לכל תמונה מניסויים במהלך הביקור.
4. בחר צינור עיבוד מהתפריט הנפתח.
5. אופציונלי: הגדר מגבלות רזולוציה או פרמטרים ידועים של תא יחידה.
6. לחצו וגררו להגדרת טווחי תמונות שייכללו בעיבוד מחדש של גבישים מרובים (איור 7).
  הערה: יש לבצע זאת על פני מספר חלקות שונות, כך שערכות נתונים מגבישים שונים מרובים ימוזגו.
7. לחצו על הלחצן 'שלב' (איור 7B).
כדי לגשת לנתונים שעובדו מחדש
1. נווט אל דף איסוף הנתונים עבור הביקור הספציפי (שלבים 3.1.1-3.1.3).
2. לחץ על Reprocessing כפתור בחלק העליון של המסך.
3. גלול מטה כדי לאתר את העבודה הרצויה.
4. לחץ על נתיב הקובץ בעמודה השמאלית כדי לפתוח את מסך אוספי הנתונים עבור הנתונים שעובדו מחדש.
5. פתח את הכרטיסיה עיבוד אוטומטי והורד נתונים כמתואר קודם לכן (שלב 3.2).
  הערה: כל המשימות שעובדו מחדש ניתנות לזיהוי באמצעות סמל החצים המעגליים לצד שם קו הצינור.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתקן ההתגבשות וקו הקרן VMXi שימשו למגוון רחב של סוגי פרויקטים ומקרי שימוש. הנה מספר קטן של דוגמאות כדי להמחיש מה משתמשים עשויים לרצות להמשיך.

ניתוח מקרה 1: איסוף נתונים סטנדרטי

קו הקרן מאפשר קביעה מהירה של מבני גבישים בטמפרטורת החדר ממספר קטן של גבישים בתוך לוח התגבשות. המספר המינימלי של גבישים תלוי בקבוצת המרחב ובכיווני הגבישים, אך לעתים קרובות הוא 1-4, אם כי ניתן להשיג איכות נתונים משופרת על ידי מיזוג נתונים מכמה עשרות גבישים. דוגמה עדכנית היא אחד מתקני קו הקורה, thaumatin. גבישים מרובים, המוצגים באיור 8A, סומנו לאיסוף נתונים באופן ידני כמתואר בסעיף 2.3 של הפרוטוקול. גבישים אלה נוספו לתור כמתואר בסעיף פרוטוקול 2.4 ונבחרו פרמטרים ניסיוניים מהרשימה הנפתחת. לאחר החלת פרמטרים ניסיוניים, הלוח עמד בתור לאיסוף נתונים. מערכי נתונים נאספו, הוגדלו באופן אוטומטי ומוזגו באמצעות צינור xia2.multiplex כמתואר בסעיף 3 של פרוטוקול. פלט לדוגמה מ-SynchWeb מוצג באמצע, איור 8A . חמישה מערכי נתונים ממוזגים יצרו מערך נתונים ברזולוציה של 1.66 Å. עבור איסוף נתונים סטנדרטי של כחמישה גבישים בבאר, נאספו מערכי נתונים תוך 2.5 דקות.

מקרה מבחן 2: קשירת ליגנד – ניסוי פרגמנט באמצעות חלבון Mac1

ייצור מבנים של קומפלקסים של ליגנד חלבונים בטמפרטורת החדר יכול להיות מושג באופן פשוט באמצעות קו הקרן. ניתן להוסיף ליגנדות לטיפות על לוחות התגבשות (באופן ידני או על ידי הזרקת טיפה אקוסטית) ונתונים נמדדים לאחר זמן דגירה מתאים. בדוגמה המתוארת כאן, סדרה של שברים חולקו לבארות המכילות גבישים של המקרודומיין הראשון של SARS-CoV-2 של החלבון nsp3 (Mac-1) בלוח התגבשות. שתיים מהבארות שהכילו את אותו שבר הוקצו כקבוצה כמתואר בשלב 2.5 של הפרוטוקול. גבישים מרובים (42) סומנו לאיסוף נתונים כמתואר בשלבי פרוטוקול 2.3 ו-2.4, ומערכי נתונים נאספו באמצעות פרמטרים סטנדרטיים (סיבוב 60°, צעד 0.1°, חשיפה של 0.00178 שניות, שידור 5%, 16 KeV - לכל גביש) (איור 8B). מערכי נתונים משתי הבארות עובדו באופן אוטומטי באמצעות צינור xia2.dials ולאחר מכן, צינור xia2.multiplex הופעל כדי למזג באופן אוטומטי 22 מערכי נתונים אלה. DIMPLE הופעל אז על הפלט של צינורות אלה והניב מפות שהראו בבירור עדויות לשבר הכבול. מודל השבר נבנה לתוך הצפיפות הפנויה ושוכלל עוד יותר (איור 8B מימין). ניתן לקבוע בקלות מבנים הקשורים לליגנד בטמפרטורת החדר באמצעות סדרת שלבים זו כדי לספק מידע ומשוב רב ערך לתהליך תכנון התרופות המבוסס על מבנה. עבור איסוף נתונים זה של 42 גבישים על פני מספר בארות, מערכי נתונים נאספו בתוך 10 דקות.

מקרה בוחן 3: פתרון מבנה עם קבוצת מרחב בעלת סימטריה נמוכה וכיוונים מועדפים ערימה של גבישים מרובים עם מורפולוגיה דמוית צלחת הופקה מניסויי התגבשות עם ציטוכרום קושר גז מסוג C (איור 8C). על ידי בחירת מספר מיקומים סביב קצה הערימה שבהם רק גביש אחד היה בקרן הרנטגן, ניתן היה לקבל מערך נתונים באיכות טובה לרזולוציה של 1.75 Å על ידי מיזוג טריזים מארבעה גבישים, למרות קבוצת חלל מונוקלינית (C2). זה איפשר התקדמות מהירה של הפרויקט ללא צורך לייעל עוד יותר את תנאי ההתגבשות. תוצאה זו תוארה בעבר⁹. עבור איסוף נתונים זה של ארבעה גבישים בבאר, נאספו מערכי נתונים תוך 2 דקות.

מקרה מבחן 4: קבלת מידע ומבנה טמפרטורת החדר ממיקרו-גבישים בצלחת באמצעות קריסטלוגרפיה טורית

לעתים קרובות, כאשר מיקרו-גבישים מופיעים בטיפה או כאשר משתמשים מבקשים למטב פרוטוקולי מיקרו-התגבשות באצווה כמבשר לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים במקורות סינכרוטרון או XFEL, מועיל מאוד לקבל משוב מהיר על תכונות העקיפה וממדי יחידת התא של ניסויים שונים תוך שימוש בחומר מינימלי. במקרה השימוש הזה, מיקרו-גבישים של ליזוזים שגדלו באצווה הוכנסו ללוח התגבשות (נפח של 200 nL לטיפה) ונתונים שנאספו משמונה טיפות באמצעות סריקת רשת עם גודל צעד של 10 מיקרומטר (איור 9). 25,906 תמונות הסטילס שהתקבלו עובדו באמצעות תוכנת קריסטלוגרפיה טורית והתוצאה הייתה מערך נתונים, שבו 9,891 תבניות עקיפה נוספו לאינדקס ואוחדו ויצרו מערך נתונים לרזולוציה של 2.0 Å שזוקק היטב כנגד מבנה טמפרטורת החדר שפורסם (R_work= 19.6%,_{R free}= 23.6% באמצעות PDB 8A9D) (טבלה 1). זה איפשר ניתוח מפורט של התפלגות תאי היחידה וקביעת מבנה טמפרטורת החדר של מיקרו-גבישים שיכולים להזין ניסויים מורכבים בקריסטלוגרפיה סדרתית, כולל מחקרים שנפתרו בזמן. הנפח הכולל של תרחיף מיקרוקריסטל נדרש היה 1.6 μL. עבור איסוף נתונים זה של מיקרו-גבישים על פני שמונה בארות באמצעות סריקות רשת, נאספו מערכי נתונים תוך 40 דקות.

figure-results-1
איור 1: סכמה של צינור חלבון-מבנה המשלב סינון התגבשות, אופטימיזציה במתקן ההתגבשות, איסוף ועיבוד נתונים אוטומטיים בטמפרטורת החדר ללא קצירת דגימות ב-VMXi, סינון מקטעי XChem ואיסוף נתונים באלומות MX אחרות. משתמשים יכולים להתחיל את הצינור על ידי אספקת דגימה או על ידי הבאת לוחות לקו הקרן של VMXi. קיצור: קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית רב-תכליתית באתרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ממשק Mosquito SPT Labtech להגדרת לוחות התגבשות. (A) (1) תצוגת ההתקנה MiTeGen In Situ-1. בחר את הצלחת הסטנדרטית של MiTeGen 2 על ידי מעבר אל (2) סוג הצלחת 96 בארות ובחירה (3) צלחת הטיפה MiTeGen 2. כדי לשנות את פרמטרי ההגדרה עבור טיפה 1 ושחרור 2, הנדרש עבור VMXi, לחץ על (4) סמל עריכה. פעולה זו פותחת חלון חדש (B) שבו (5) יש לשנות את היסט X ו- Y כפי שמוצג. בחר (B) את באר המשנה 2 ו- (C) באר משנה 3 ושנה את הערכים בהתאם. (D) תצוגת CrystalQuickX Setup. בחר את הצלחת הסטנדרטית של CrystalQuickX 2 על ידי מעבר לסוג הצלחת 96 בארות ובחירת צלחת הטיפה MiTeGen 2. כדי לשנות את פרמטרי ההגדרה עבור טיפה 1 ו- drop 2, הנדרשים עבור VMXi, לחץ על סמל העריכה זהה לעיל. פעולה זו פותחת חלון חדש שבו (E,F) יש לשנות את היסט X ו- Y כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ממשק SynchWeb המראה כיצד ליצור משלוח VMXi, לרשום לוחית ולבדוק פרטי קשר. צילומי מסך של השלבים השונים של העלאת מידע לממשק SynchWeb מוצגים מתוך (א) התפריט הנפתח, (ב,ג) רישום משלוח חדש, (ד) רישום מכולה חדשה, (ה) הזנת פרטי לוחית, (ו) בדיקת פרטי קשר, ו-(ז) רשימת מכולות רשומות במסגרת הצעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: בחירה והכנה של דוגמאות לאיסוף נתונים באמצעות SynchWeb. סדרה של צילומי מסך המציגים את השלבים השונים של הכנת דוגמאות לאיסוף נתונים באמצעות ממשק SynchWeb מוצגים. (A) נקודות ואזורי עניין נבחרים מתוך סקירת הטיפה. בחלק התחתון של לוח זה, יש סדרה כרונולוגית של תצלומים של טיפה אחת. (B) דוגמה לפלט CHiMP עבור צלחת אחת המדגישה תוצאות עבור קטגוריית 'גביש'. (ג) הוספת דוגמאות לתור מרשימת הנקודות והאזורים שנבחרו ו-(ד) החלת פרמטרים לאיסוף נתונים על הדגימות בתור מהרשימה הנפתחת של הגדרות ניסוי שנוצרו על-ידי קו אלומה. שימו לב להבדל בין דגימות ללא פרמטרים ניסיוניים (באדום) לעומת דגימות שהחילו נכון פרמטרים (למעלה ולמטה). בתחתית לוח זה נמצא כפתור מיכל התור , אשר מעמיד בתור את הצלחת לאיסוף על קו הקורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: יצירת קבוצות לדוגמה ב-SynchWeb. סדרה של צילומי מסך המציגים את השלבים השונים של יצירת קבוצות לדוגמה. (א) הלוחיות המכילות דגימות נבחרות מתוך המשלוח הרלוונטי ו-(ב) הטיפות בתוך הצלחת נבחרות. אלה עשויות להיות טיפות בודדות או שניתן לבחור לפי שורה ו / או עמודה. (ג) רשימה של קבוצות לדוגמה שכבר נוצרו. (D) התפוקות של שלוש משימות עיבוד המרובבות האחרונות מפורטות וניתן לבחור אותן כדי להציג נתונים סטטיסטיים מצינור העיבוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: עיבוד נתונים והפחתת נתונים. (A) צילום מסך של ערכת נתונים מעובדת ב- ISPyB¹¹. הלחצן לגישה לתכונות עיבוד מחדש מסומן. מזהה לדוגמה ופרמטרים ניסיוניים מוצגים בפינה השמאלית העליונה ומציג תמונת העקיפה באמצע. לחיצה על תמונה זו תפתח חלון אינטראקטיבי לבחינת תמונות שונות. מציג תמונות הקריסטל מוצג מימין ולחיצה על תמונה זו תפתח גם חלון אינטראקטיבי להשוואת תמונות אלומה ואחסון Formulatrix. תרשים ניתוח לכל תמונה מוצג בקצה הימני ולחיצה על תמונה זו תפתח גרסה מוגדלת של פלט זה. לחיצה על הכרטיסייה עיבוד אוטומטי תהפוך את העיבוד האוטומטי לגלוי ותקל על ההשוואה בין התוצאות של הצינורות השונים. לחץ על הכרטיסיות כדי לעבור בין צינורות העיבוד השונים ולהציג את הפלט המפורט מהצינור שנבחר. לחצן יומני רישום וקבצים להורדת נתונים מסומן. לחיצה על הכרטיסייה עיבוד במורד הזרם תרחיב ותספק תוצאות עבור כל ערכות הנתונים המופעלות בצינורות לאחר הפחתת נתונים במידת הצורך. (ב) צילום מסך מהמסך 'ניהול קבוצות לדוגמה '. שם הקבוצה המוגדר על-ידי המשתמש מופיע בחלק העליון וניתן לראות את התיאור החזותי של הבארות הכלולות להלן. באר ירוקה מציינת שכל הגבישים שנמדדו מאותה טיפה ייכללו בקבוצה. ניתן לראות סיכום של עבודות מולטיפלקס שונות שבוצעו באותה קבוצה ומתחתיו נמצא הפלט המפורט מהמרבב. לחצן ערכות נתונים לבחינת הניסויים הכלולים מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: חלונות עיבוד מחדש של נתונים. (A) מערכי נתונים נפרדים ו-(B) רב-גבישיים. מוצגות שתי ערכות נתונים נפרדות שבהן נבחרו אזורי נתונים. כאשר תיבת הסימון עבד בנפרד מסומנת, תמונות העקיפה שנבחרו יעובדו בנפרד על-ידי לחיצה על לחצן שלב . לחיצה על הלחצן Multi-crystal תפתח תצוגה של מערכי הנתונים הבודדים. לעיבוד מחדש של תמונות עקיפה מערכות נתונים מרובות, אזורים בתמונות נבחרים כפי שמוצגים, והעיבוד מחדש מופעל בלחיצה על הלחצן 'שלב' כמסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: תוצאות מייצגות מצינור VMXi. (A) גבישים מסומנים עבור חלבון תאומטין בתוך טיפת התגבשות (פאנל שמאלי), תוצאות עיבוד נתונים (פאנל מרכזי) וצפיפות אלקטרונים (פאנל ימני). (B) איסוף על גבישים מרובים כדי לקבוע את קשירת המקטע לתחום המאקרו SARS-CoV-2. מערכי נתונים נאספו על גבישים מרובים בנוכחות מקטע ממסך המקטע EU-OPENSCREEN באמצעות הגדרות ניסוי סטנדרטיות. דוגמאות לאוספי נתונים אלה מוצגות בקטע זה מתוך SynchWeb. השבר נבנה בצפיפות המתאימה ושוכלל עוד יותר כפי שמוצג ברחוק ביותר מימין. (C) גבישים מונוקליניים מסומנים בערימה מלהיט התגבשות מאתגר המשמש לאיסוף נתונים. צלבים ירוקים ומספרים אדומים מציינים היכן נמדדו הנתונים באמצעות קרן של 10 מיקרומטר וסיבוב של 60 מעלות. ארבעה מהטריזים שהתקבלו מוזגו כדי ליצור מערך נתונים ברזולוציה של 1.75 Å. צפיפות אלקטרונים סביב קבוצת Heme מוצגת מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: קריסטלוגרפיה טורית בלוח ההתגבשות. (A) תמונה אופטית של טיפת ההתגבשות, עם תיבה לבנה המייצגת את אזור העניין. (B) הגדרת נקודות סריקת רשת. (C) מפת חום המציינת עקיפה. (D) מפת צפיפות אלקטרונים הנובעת ממערך נתונים של קריסטלוגרפיה טורית מיותר מ-9,000 דפוסי עקיפה דוממים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

רזולוציה (Å)	שלמות (%)	הריבוי	I/σ(I)	_{R פיצול}	סמ"ק_1/2	תצפיות ייחודיות
הכולל	100	95.5	20.8	0.063	0.998	8422
נמוך (55.55 - 5.43)	100	147.1	81.7	0.028	0.999	488
גבוה (2.03 -2.00)	100	75.3	1.2	1.092	0.410	411

טבלה 1: נתונים סטטיסטיים עבור ערכת הנתונים הטורית VMXi RT. קיצורים: I = ממוצע עוצמת התצפיות בקנה מידה; _פיצול R = מדד אי התאמה של העוצמות הנמדדות; CC 1/2 = מקדם מתאם בין שני חצאים אקראיים של מערך הנתונים.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיארנו את ההליך המלא מהגעת דגימת חלבון ב- CF ועד להורדת הנתונים הסופיים על ידי המשתמש ליישומים נוספים. שלבים קריטיים הם ייצור דגימת חלבון איכותית ומסכי גבישים מתאימים, בין אם באמצעות מסכי מטריצה דלילים מסחריים או מסכי אופטימיזציה המבוססים על תנאים שנקבעו. תהליך זה עשוי להתרחש ב- CF, או שהמשתמשים יכולים לבצע את הליכי ההתגבשות במעבדות הביתיות ולהביא לוחות התגבשות מתאימים לקו הקורה. זיהוי פרמטרים מתאימים לאיסוף נתונים עשוי להיות חשוב עבור דגימות מסוימות, במיוחד כאשר קיים חשש לנזקי קרינה. ברוב המקרים, עיבוד נתונים אוטומטי מספיק לחלוטין כדי לענות על השאלה המדעית, אם כי המשתמשים שומרים על היכולת לעבד מחדש באמצעות כלי אלומה, למשל, כאשר קבוצת החלל מעורפלת או רק החלק הראשוני של הנתונים שנאספו משמש כדי למזער את השפעות נזקי הקרינה.

אם גבישים מתאימים אינם מיוצרים מניסויי התגבשות ראשוניים, ניתן לבחון שינויים בריכוז, בטוהר או במסכי התגבשות, כמו גם בשימוש בזריעת גבישים. אם גבישים אינם מתפצלים לרזולוציה שימושית בקו האלומה, ניתן להשתמש בסריקות רשת עם קרן לא מאוישת כדי להעריך את גבול העקיפה האינהרנטי ואת תא היחידה של הגבישים כדי להנחות את מאמצי האופטימיזציה. גבישים קטנים מדי לאיסוף נתונים בתוך לוחות (למשל, <10 מיקרומטר) עשויים במקום זאת להתאים לקריסטלוגרפיה טורית או לניסויי ננו פוקוס (למשל, בקרן יהלום VMXm). פתרון מבנים באמצעות נתוני VMXi הוא בדרך כלל פשוט על ידי החלפה מולקולרית, במיוחד מאז הופעתו של Alphafold¹⁶ כדי לתת מודלים יעילים לחיפוש. אם פעולה זו אינה מצליחה, ניתן לקצור גבישים ולהתקרר בהקפאה מלוחות כדי לאפשר עקיפה חריגה קונבנציונלית באורך גל יחיד, עקיפה חריגה רב-אורכית או ניסויי פאזינג באורכי גל ארוכים.

יתרונותיה של שיטה זו כוללים את היכולת לקבל מערכי נתונים ומשוב מהירים ואיכותיים ישירות מלוחות התגבשות ללא צורך להפריע לגבישים מהסביבות בהן גדלו. מה שמכונה "רנסנס טמפרטורת החדר" בביולוגיה מבנית מציב פרמיה על מבנים המתקבלים בתנאים לא קריוגניים כדי לאפשר יותר רלוונטיות פיזיולוגית ודינמיקה של חלבונים להיחקר². בדרך כלל, מושגת רזולוציה מעט נמוכה יותר מאשר עבור גביש קריו-מקורר אופטימלי, אך רק כאשר נקבעו תנאי קריו-קירור מתאימים ואם הגבישים עמידים לטיפול מכני ולפתיחה של טיפת ההתגבשות³. יישום עתידי שעבורו צינור זה מתאים מאוד הוא סינון בקנה מידה גדול של קומפלקסים של ליגנד חלבונים או קמפיינים של פרגמנטים בטמפרטורת החדר בגילוי תרופות. ליגנדות או שברים יכולים להיות מגובשים או מוספים על ידי פיפטה או פליטת טיפה אקוסטית לפני איסוף נתונים בטמפרטורת החדר. יישום נוסף הוא למדוד במהירות נתונים ממאות או אלפי גבישים בצורה יעילה ביותר ולאחר מכן להשתמש בתוכנת DIALS¹⁷ multiplex¹⁴ כדי לחלץ צבירים איזומורפיים שעשויים לייצג ישויות ביולוגיות שונות או לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית בין אוכלוסיות של גבישים שטופלו בדרך שונה או נחשפו לליגנדות או אותות שונים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למדעני מקור אור היהלום ולחברי צוות התמיכה הרבים שתרמו לתכנון, לבנייה ולתפעול של קו האלומה של VMXi. אנו אסירי תודה למשתמשי beamline, שתרמו רעיונות בהמשך לפיתוח צינורות ההתגבשות ואיסוף הנתונים. מתקן ההתגבשות בהארוול נתמך על ידי Diamond Light Source Ltd, מכון רוזלינד פרנקלין והמועצה למחקר רפואי.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	על פי בקשה	רובוט טיפול בנוזלים
Formulatrix imager	Formulatrix	על פי בקשה	צילום צלחת התגבשות
Greiner CrystalQuick X		צלחת התגבשות	Z617644 גריינר
גריפון	ארט רובינס אינסטרומנטס	620-1000-10	רובוט התגבשות
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	צלחת התגבשות
יתושים LCP	(SPT Labtech)	על פי בקשה	רובוט התגבשות
Rock Imager & Maker	Formualtrix	לפי בקשה	תוכנה עבור Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	רובוט לטיפול בנוזלים https://www.artrobbins.com/scorpion

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).
Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1(2021).
Helliwell, J. R. What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).
Thorne, R. E. Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).
Keedy, D. A., et al. Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr. Structure. 22 (6), 899-910 (2014).
Huang, C. Y., et al. Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).
Sanchez-Weatherby, J., et al. Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).
Jacquamet, L., et al. Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam. Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).
Mikolajek, H., et al. Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi. IUCrJ. 10, 420-429 (2023).
Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source. Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).
Delageniere, S., et al. Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. Synchweb: A modern interface for ispyb. Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).
Jenkins, J., Cook, M. Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology. JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).
Gildea, R. J., et al. Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).
Winter, G., Mcauley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with alphafold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
Winter, G., et al. Dials as a toolkit. Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles