הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65980

⸱

15 במרץ 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

תקציר

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ידוע בייצור מגוון רחב של גורמי אלימות כדי לבסס זיהומים בפונדקאי. מנגנון אחד כזה הוא ניקוי ברזל באמצעות ייצור סידרופור. P. aeruginosa מייצר שני סידרופורים שונים: פיוכלין, שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל, ופיוברדין, שיש לו זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל. דו"ח זה מדגים כי ניתן לכמת פיוברדין ישירות מסופרנאטנטים חיידקיים, בעוד שפיוכלין צריך להיות מופק מסופרנאטנטים לפני הכימות.

השיטה העיקרית לניתוח איכותי של ייצור סידרופור היא בדיקת צלחת אגר כרום אזורול סולפונט (CAS). בבדיקה זו, שחרור צבע CAS מקומפלקס Fe3+-Dye מוביל לשינוי צבע מכחול לכתום, מה שמצביע על ייצור סידרופור. לצורך כימות הסידרופורים הכולל, סופרנאטנטים חיידקיים עורבבו בפרופורציות שוות עם צבע CAS בלוח מיקרוטיטר, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי ב-630 ננומטר. פיוברדין כומת ישירות מהסופרנאטנט החיידקי על ידי ערבובו בפרופורציות שוות עם 50 מילימטר Tris-HCl, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי. שיא של 380 ננומטר אישר את נוכחותו של pyoverdine. באשר לפיוכלין, כימות ישיר מהסופרנאטנט החיידקי לא היה אפשרי, ולכן היה צורך לחלץ אותו תחילה. ניתוח ספקטרופוטומטרי שנערך לאחר מכן גילה נוכחות של פיוכלין, עם שיא של 313 ננומטר.

מבוא

אורגניזמים זקוקים לברזל כדי לבצע פונקציות חיוניות שונות, כגון הובלת אלקטרונים ושכפול דנ"א1. Pseudomonas aeruginosa, פתוגן אופורטוניסטי גראם-שלילי, ידוע כבעל מגוון גורמים אלימים לביסוס זיהום בפונדקאי, ביניהם מנגנון אחד הוא היווצרות סידרופור2. בתנאים של דלדול ברזל, P. aeruginosa משחרר מולקולות מיוחדות שנקראות סידרופורים, אשר מרווה ברזל מהסביבה. Siderophores chelate ברזל extracellularly, ואת קומפלקס ferric-siderophore וכתוצאה מכך מועבר באופן פעיל בחזרה לתא3.

P. aeruginosa ידוע לייצר שני siderophores, pyoverdine ו pyochelin. ידוע שפיוברדין הוא בעל זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל (1:1), ואילו פיוכלין ידוע כבעל זיקה פחותה לתצבית ברזל (2:1)4. פיוכלין נקרא גם סידרופור משני מכיוון שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל5. הייצור והרגולציה של סידרופורים נשלטים באופן פעיל על ידי מערכות חישת מניין (QS) ב- P. aeruginosa6.

מלבד מרווה ברזל, סידרופורים מעורבים גם בוויסות גורמי אלימות וממלאים תפקיד פעיל בהיווצרות ביופילם7. סידרופורים ממלאים תפקידים חיוניים נוספים, כולל מעורבות באיתות תאי, הגנה מפני עקה חמצונית והקלה על אינטראקציות בין קהילות מיקרוביאליות8. סידרופורים מסווגים בדרך כלל על בסיס הקבוצות הפונקציונליות הספציפיות שדרכן הם מכלכים ברזל. שלושת הליגנדים הדו-שינטיים העיקריים בסיווג זה הם קטכולאט, הידרוקסאמט ו-α-הידרוקסי-קרבוקסילט3. Pyoverdines הם סימני היכר של מיני Pseudomonas פלואורסצנטיים כגון P. aeruginosa ו P. fluorescens5. הם מורכבים מכרומופור פלואורסצנטי ירוק מעורב המחובר לאוליגופפטיד המכיל 6-12 חומצות אמינו. מספר סינתזות פפטידיות לא ריבוזומליות (NRPs) מעורבות בסינתזה שלהן9. ארבעה גנים המעורבים בייצור ובוויסות של פיוברדין הם pvdL, pvdI, pvdJ ו-pvdD10. פיברדין אחראי גם לזיהום ולאלימות ביונקים11. P. aeruginosa ידוע לייצר pyochelin בתנאים מתונים הגבלת ברזל, בעוד pyoverdine מיוצר בסביבות חמורות הגבלת ברזל12. שני אופרונים המעורבים בייצור פיוכלין הם pchDCBA ו-pchEFGHI13. יצוין כי בנוכחות pyocyanin, pyochelin (catecholate) גורם נזק חמצוני ודלקת ומייצר רדיקלים hydroxyl, אשר מזיקים לרקמות המארח11.

בדיקת Chrome Azurol Sulfonate (CAS) מאומצת באופן נרחב בשל מקיפותה, רגישותה הגבוהה ונוחותה הרבה יותר בהשוואה לבדיקות מיקרוביולוגיות, אשר, למרות רגישותן, יכולות להיות ספציפיות מדי14. בדיקת CAS יכולה להתבצע על משטחי אגר או בתמיסה. הוא מסתמך על שינוי הצבע המתרחש כאשר יון הברזל עובר מהקומפלקס הכחול העז שלו לכתום. בדיקת CAS colorimetric מכמתת את דלדול הברזל מקומפלקס טרינרי Fe-CAS-surfactant. קומפלקס מסוים זה, המורכב ממתכת, צבע אורגני וחומרים פעילי שטח, הוא בעל צבע כחול ומציג שיא ספיגה של 630 ננומטר.

דו"ח זה מציג שיטה לזיהוי איכותי של ייצור סידרופורים, שבה ניתן לזהות ייצור של סידרופורים על צלחת אגר. שיטה להערכה כמותית של סך ייצור הסידרופורים בצלחת מיקרוטיטר וזיהוי וניתוח כמותי של שני סידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין, מ- P. aeruginosa, מסופקת גם כן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המבודדים החיידקיים של P. aeruginosa התקבלו ממעבדות מיקרוביולוגיה רפואית מוואדודרה וג'איפור, הודו. כל המבודדים הקליניים שנבחרו טופלו בארון הבטיחות הביולוגית (BSL2) וננקטה זהירות מרבית בעת הטיפול במבודדים חיידקיים במהלך הניסויים. הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים/פתרונות מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת צבע כרום אזורול סולפונט (CAS) ומדיה אגר

  1. הכן צבע CAS (100 מ"ל) עם הרכב הבא:
    1. יש להמיס 60 מ"ג CAS ב-50 מ"ל מים מזוקקים (תמיסה 1).
    2. יש להמיס 2.7 מ"ג של FeCl3·6H2O ב-10 מ"ל של 10 mM HCl (תמיסה 2).
    3. להמיס 73 מ"ג של Cetrimonium bromide (HDTMA) ב 40 מ"ל של מים מזוקקים (תמיסה 3).
    4. ערבב בזהירות את פתרון 1, פתרון 2 ופתרון 3. אחסנו אותו בבקבוק זכוכית.
  2. הכינו אגר CAS לפי השלבים הבאים:
    1. הוסף 100 מ"ל של תמיסת מלח MM9 ל 750 מ"ל של מים מזוקקים.
    2. ממיסים 32.24 גרם של חומצה חופשית פיפרזין-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES).
    3. מוסיפים 15 גרם אגר אגר. Autoclave ולאפשר לו להתקרר.
    4. הוסף 30 מ"ל של תמיסת חומצות קאמינו סטריליות ו -10 מ"ל של תמיסת גלוקוז סטרילית 20% לתערובת.
    5. מוסיפים 100 מ"ל צבע CAS, מערבבים ויוצקים בתנאים אספטיים.
      הערה: הכנת מדיה MM9, תמיסת חומצות קאמינו ו- 8-הידרוקסיקינולין מסופקים בקובץ משלים 1. מאגר PIPES רגיש ל- pH. זה לא יתמוסס עד pH 5.6 מושגת. ודא כי ה- pH מנוטר כל הזמן מכיוון שכאשר PIPES מתחיל להתמוסס במים, זה יוריד עוד יותר את ה- pH. לחלץ חומצת קאמינו באותו נפח של 3% 8-hydroxyquinoline מומס כלורופורם. השאירו את התמיסה הבלתי ניתנת להפרכה על 4°C למשך כ-20 דקות ואספו בזהירות את השלב העליון של התמיסה מבלי להפריע לשלב התחתון.

2. ניתוח איכותי של ייצור סידרופורים

  1. הגדר את OD600 ננומטר ל- 0.2 עבור תרביות שגדלו ב- 24 שעות של P. aeruginosa.
  2. בעזרת לולאת תיל סטרילית, פזרו את תרבית החיידקים על צלחת אגר CAS.
  3. לדגור ב 30 ° C במשך 24 שעות.
    הערה: ניתן להשתמש במי פפטון או במי מלח רגילים של 0.8% כדי לדלל את תרבית החיידקים. אם לא נצפתה צמיחת חיידקים במשך 24 שעות, דגרו על לוחות CAS במשך 48 עד 72 שעות.

3. אומדן כמותי של סך הסידרופורים

  1. יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במצע המים של פפטון לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25, ולדגור ב-30°C למשך 48 שעות.
  2. לאחר 48 שעות, צנטריפוגו את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של צבע CAS אליו.
  4. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  5. לאחר הדגירה, בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- 630 ננומטר.
  6. חשב את התוצאות המתקבלות לכימות של סך כל הסידרופורים כיחידת סיידרופור אחוז (PSU).
    הערה: ניתן לחשב ספק כוח כ: [(Ar - As)/Ar] x 100
    כאשר,A r = ספיגה של הייחוס ב 630 ננומטר, As = ספיגה של supernatant ללא תאים של הדגימה. לשם השוואה, יש להוסיף צבע CAS למצע מי פפטון לא מחוסנים. מלאו את כל כלי הזכוכית, כגון מבחנות, צלוחיות וכו', ב-6 M HCl למשך שעתיים ושטפו אותם פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר כל זכר ברזל עליהם.

4. הערכה כמותית של pyoverdine

  1. יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגודלו ב-24 שעות במדיית המים של פפטון לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C במשך 48 שעות.
  2. לאחר 48 שעות, מדדו את OD600 ננומטר של צמיחת החיידקים לפני שתמשיכו הלאה.
  3. צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) אליו.
  5. בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- OD405 nm.

5. מיצוי פיוכלין וספקטרופוטומטריה

  1. יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במדיה של King's B (קובץ משלים 1) לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C למשך 24 שעות.
  2. לאחר 24 שעות, קח 100 מ"ל של תרבית וצנטריפוגה ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הצנטריפוגה, להוסיף 5 מ"ל של 1 M חומצת לימון supernatant. לחלץ פעמיים עם 50 מ"ל של אתיל אצטט.
  4. מסננים את השלב האורגני עם מגנזיום גופרתי דרך מסנן מזרק. אחסנו את הפאזה האורגנית המסוננת בטמפרטורה של -20°C.
  5. בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ברזולוציה של 320 ננומטר.
    הערה: מכיוון שפיוכלין היא תרכובת מאוד לא יציבה בטמפרטורת החדר, בצע את תהליך המיצוי על קרח. השתמש מזרק סטרילי 50 מ"ל להפרדת המסנן. מניחים כותנה בקצה המזרק ומוסיפים עליו 1 גרם מגנזיום גופרתי. מקבעים מסנן מזרק סטרילי בקצה המזרק ואוספים את התסנין בצינור סטרילי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לפני כימות של סידרופורים ממבודדים קליניים, בוצע סינון איכותי לייצור סידרופורים כדי להבטיח ייצור סידרופורים. זיהוי איכותי של סידרופורים ממבודדים קליניים נצפה על ידי חיידקים מפוספסים על לוחות אגר CAS. שלושה מבודדים קליניים, כלומר MR1, TL7, J3, יחד עם PAO1 (זן הייחוס), נבחרו למחקר. כל שלושת המבודדים הקליניים ו-PAO1 הראו תוצאות חיוביות לייצור סידרופורים, כאשר הילה כתומה ברורה סביב צמיחת החיידקים על משטח האגר הכחול הצביעה על ייצור סידרופור חיובי (איור 1). היווצרות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את סך כל הסידרופורים ושני סידרופורים שונים של P. aeruginosa, כלומר פיוברדין ופיוצ'לין, מהסופרנטנט נטול התאים של החיידקים. במבחן צלחות אגר CAS, צבע CAS ויוני Fe3+ יוצרים קומפלקס. כאשר חיידקים מייצרים סידרופורים, הם מרווים יוני Fe3+ מקומפלקס CAS-Fe3+, מה שמוביל לשינוי צבע סביב צמיחת החיידקים. שינוי זה גורם להילה כתומה ברורה סביב צמיחת החיידקים14,15. בעוד חיידקים יכולים להיות מפוזרים ישירות על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים על מימון DBT - תוכנית הוראת ביוטכנולוגיה, DBT - תוכנית BUILDER ו- FIST. מר תודה מלגת שו"ד. מלגת תודה של HP שהתקבלה מ-CSIR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגר אגר, סוג IHIMEDIAGRM666
8-הידרוקסיקווינוליןחומצה4151
חומצה קסאמיתSRL כימיקלים68806
ציטילטרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
כלורופורםMerck1070242521
כרום אזורול סולפונאטHIMEDIARM336-10G
חומצת לימוןMerck100241
דקסטרוז מונוהידראטMerck108342
דיכלורומתאןMerck107020
ברזל כלוריד הקסהידראטHIMEDIAGRM6353
צלוחיות זכוכיתBorosil5100021
מבחנות זכוכיתBorosil9820U05
חומצה הידרוכלוריתSDFCL20125
בסיס B בינוני של קינגסHIMEDIAM1544-500G
M9 מלחים בינוניים מינימלייםHIMEDIAG013-500G
מגנזיום סולפט Qualigens10034
MultiskanGO ספקטרופוטומטר UVתרמו מדעי51119200
פפטון מסוג I, בקטריולוגיHIMEDIARM667-500G
צינורות חומצה חופשיתMP ביו-רפואי190257
אשלגן דימימן פוספטMerck1048731000
פרוטאוז פפטוןHIMEDIARM005-500G
ספקטרופוטומטר UV-VisShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
נתרן כלוריקוואליגנים15915
כימית

מקורות

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

כימות Pyoverdineמיצוי Pyochelinבדיקת CAS Agarאנליזה ספקטרופוטומטריתסופרנאטנט נטול תאיםגורמי virulentאיסוף ברזלפלטת מיקרוטיטר
ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.