הפעלת מחקרי ביטוי טרנסגנים בתפוקה גבוהה באמצעות טיפול אוטומטי בנוזלים עבור פרוטופלסטים בעלי עלי תירס אטיוליים

Summary

פרוטוקול זה מתאר יצירת פריסת טרנספקציה אקראית באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי, פרוטוקול בידוד פרוטופלסט לעלי תירס אטיולטי, והליך טרנספקציה של 96 בארות באמצעות מטפל בנוזלים.

Abstract

תחום הביוטכנולוגיה של הצמח חווה התקדמות יוצאת דופן בשנים האחרונות, שחוללה מהפכה ביכולת לתפעל ולהנדס צמחים למטרות שונות. עם זאת, ככל שהמחקר בתחום זה גדל במגוון והופך מתוחכם יותר ויותר, ברור יותר הצורך בפתרונות סינון חולפים מוקדמים, יעילים, אמינים ובעלי תפוקה גבוהה כדי לצמצם אסטרטגיות המתקדמות לטרנספורמציה יציבה. שיטה אחת שצצה מחדש בשנים האחרונות היא ניצול פרוטופלסט צמחי, שעבורו קיימות שיטות בידוד וטרנספקציה במינים, רקמות ושלבי התפתחות רבים. עבודה זו מתארת פרוטוקול אוטומטי פשוט להכנה אקראית של פלסמיד בתוך צלחת של 96 בארות, שיטה לבידוד של פרוטופלסט עלי תירס אטיולטי, והליך טרנספקציה אוטומטי. אימוץ פתרונות אוטומטיים בביוטכנולוגיה של צמחים, המודגם על ידי פרוטוקולי טיפול בנוזלים חדשניים אלה להעברת פרוטופלסט צמחי, מייצג התקדמות משמעותית על פני שיטות ידניות. על ידי מינוף אוטומציה, חוקרים יכולים להתגבר בקלות על המגבלות של שיטות מסורתיות, לשפר את היעילות ולהאיץ את ההתקדמות המדעית.

Introduction

טרנספקציה של פרוטופלסט צמחי, החדרת חומר גנטי זר לתאי צמחים נטולי דפנות תאים, היא טכניקה מרכזית, ובחצי המאה האחרונה מקיפה מינים רבים התומכים במחקר ביוטכנולוגיה של צמחים. עם זאת, השימוש בשיטות אלו יכול להיות כואב ומוגבל בהיקפו, אפילו עם מיליוני פרוטופלסטים המיוצרים בכל בידוד. שיטות מסורתיות של טרנספקציה של פרוטופלסט צמחי הן לרוב מייגעות, גוזלות זמן, נוטות לשונות ותובעניות מבחינה טכנית, מה שמוביל למערכות נישה עם יכולת שחזור נמוכה¹. עם זאת, הפוטנציאל שהציגו פתרונות אוטומטיים בשנים האחרונות מאיר את האפשרות להפיח חיים חדשים בטכניקה הצעירה הזו בת 60 שנה ^2,3. עם הפוטנציאל של אוטומציה של שלבים חיוניים אך חוזרים על עצמם כגון הכנת חומרים, דגירה של פולי-אתילן גליקול (PEG) וחלוקת ריאגנטים לאחר מכן, חוקרים יכולים להפחית משמעותית את דרישות הטיפול הפיזי ומקורות פוטנציאליים אחרים לטעויות אנוש⁴. יתר על כן, הבקרה המדויקת והאחידות המוצעות על ידי מערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים מבטיחות תוצאות העברה עקביות וניתנות לשחזור.

בעוד שבידוד פרוטופלסט הוא תהליך קפדני הכולל קיצוץ, עיכול, דגירה, סינון וצנטריפוגה, חלק הטרנספקציה של פרוטוקולים אלה מותאם למטפלים בנוזלים אוטומטיים. ההליך עבור רוב פרוטוקולי הטרנספקציה של פרוטופלסט הוא מתווך PEG, וערבוב הפרוטופלסט המבודד בנוכחות PEG ו-DNA פלסמיד מטוהר למשך זמן מוגדר בריכוז מדויק (תלוי במין וברקמה) מאפשר לתאים אלה לקלוט את ה-DNA של הפלסמיד⁵. לאחר טרנספקציה זו באה סדרה של שלבי שטיפה, ששיאם בדגירה של לילה⁶. לאחר תקופת הדגירה, אם הכל תוכנן ונמסר כראוי, הניסוי מביא לביטוי של מרכיב העניין ו/או הפוטנציאל להעריך רכיבים רגולטוריים שונים⁷. כל שלבי השאיפה, החלוקה והתסיסה/ערבוב הקשורים להליך זה יטופלו בדרך כלל על ידי פיפטה ידנית. ביצוע פרוטוקול כזה ביד, תגובה בודדת אחת בכל פעם, הוא מייגע ומציג שונות מיותרת בין הדגימות תוך הגבלת היכולת שניתן להעריך בכל זמן נתון. פרוטוקולים אוטומטיים למניפולציה של תאי יונקים או חרקים וסינתזה כימית בתעשיית התרופות קיימים כבר מספר שנים ^4,8,9. ניצול פרוטופלסט ופרוטוקולים הכוללים טיפול אוטומטי בנוזלים בחומרים צמחיים נמצאים בעלייה 10,11,12,13.

אימוץ פרוטוקולי טיפול אוטומטיים בנוזלים להעברת פרוטופלסט צמחי טומן בחובו הבטחה גדולה ליישומי מחקר. חוקרים יכולים לחקור ספריות גנטיות גדולות יותר, לסנן תפקודי גנים ספציפיים בקצב מואץ, ולחקור אינטראקציות גנטיות מורכבות הקשורות ללחץ^{צמחי באופן} מקיף יותר. יכולת ההרחבה של גישות אוטומטיות המשתמשות בתרמילים של 96 בארות בשילוב עם סינון פלואורסצנטי מאפשרת ניסויים בתפוקה גבוהה ומאפשרת למדענים לייצר במהירות נתונים ותובנות שיכולים להניע התקדמות בביוטכנולוגיה של צמחים¹¹. עם זאת, עם עלייה זו בתפוקה, המובילה ליצירת מאות, אם לא אלפי נקודות נתונים, חייבת להיות בקרת איכות נוספת הלוקחת בחשבון את כל מקורות השגיאה שעלולים לבלבל את התוצאות¹⁵. אלמנט אחד שזוהה כגורם תורם בדיסציפלינות מדעיות רבות הוא אפקט הקצה. כמה אסטרטגיות הקלה יציעו את הצלחת הטובה ביותר לשימוש או מילוי חלל בין בארות או את הבארות החיצוניות ביותר במים כדי להילחם בתופעה^{זו 16,17}. עם זאת, אסטרטגיות אלו מוסיפות זמן, ואם חד פעמי ספציפי אינו זמין, האפשרות היחידה היא להסתפק בפחות או לדחות. לחלופין, הסתכלות על אסטרטגיות שמסבירות את האפקט הזה באמצעות סכימת חסימה אינה מקריבה את התפוקה או העיכוב לביצוע.

פרוטוקול פרוטופלסט עלי תירס אטיולי זה ושתי השיטות האוטומטיות שלו המוצגות באיור 1 מבקשים לטפל בשונות הטבועה בניסויי פרוטופלסט על ידי אוטומציה של חלקים מרובים של שיטת הפרוטופלסט הקנונית, הקצאת חומר פלסמיד לכלי המשמש לטרנספקציה והטרנספקציה עצמה. שיטות אלו מודגמות עבור פלטפורמת הפרוטופלסט של עלי תירס אטיולטים מכיוון שהיא פלטפורמת פרוטופלסט מאופיינת היטב, פשוטה ויעילה. כל השלבים המפורטים בפנים נגישים באופן מיידי לפרוטוקולי טרנספקציה של פרוטופלסט, המשתמשים בפתרונות מאגר דומים או זהים. עם זאת, יש לשקול תשומת לב מיוחדת למאפיינים הייחודיים של רקמת מקור פרוטופלסט ומינים לפני אימוץ טכניקות אלה. שיפורים אלה באמצעות אוטומציה מפשטים את הכנת החומר לניסויים בודדים ומשפרים משמעותית את התפוקה, מהעברה רציפה אחד אחד ל-96 טרנספקציות המטופלות בו זמנית. עבודה זו תראה גם הצדקה לשימוש בבלוקים אקראיים לא שלמים כדי להסביר את הטיית מיקום הצלחת.

Protocol

1. יצירת צלחת טרנספקציה

1. יצירת פריסת סיפון: כדי ליצור שיטת אקראיות של לוחות DNA, פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים. לחץ על הלחצן שיטה חדשה משורת התפריטים כדי ליצור שיטה חדשה. הוסף קו הגדרת מכשיר בין קווי ההתחלה והסיום על ידי לחיצה על לחצן הגדרת המכשיר בלוח השמאלי.
   הערה: ניתן למצוא צילומי מסך רלוונטיים העוקבים אחר פרוטוקול אוטומטי זה באיור משלים 1, איור משלים 2 ואיור משלים 3.
2. לחץ על קו הגדרת מכשירים , מצא את תוכנת המעבדה הנכונה מתפריט הקטגוריה Labware וגרור אותם לפריסת הסיפון כפי שמוצג באיור משלים 1.
   הערה: אם תוכנת המעבדה לא הוגדרה בעבר, יהיה צורך לתכנת אותה לתוך המטפל בנוזלים בהתאם למפרט היצרן, אך הוראות כאלה אינן כלולות בפרוטוקול זה.
3. העברה מ-file הגדרה: לחץ על העברה מ-File כפתור בלוחות השלבים והצב את העברה מ-File שורה מתחת לקו ההתקנה של המכשיר. ודא שבחירת הקצה והחלפתו הם כפי שמוצג באיור משלים 3.
4. בדוק שלקובץ יש שורת כותרת וודא שפרטי העמודה נכונים.
5. לחץ על אזור המקור כדי להפעיל אותו ולחץ על לוחית המקור מפריסת הסיפון, הגדר את לוחית היעד והזן את כמות ה-DNA שיש לזרום.
6. לחץ על כפתור התאמה אישית כדי להגדיר את טכניקת הפיפטינג בפירוט, כגון נגיעות קצה על הקיר.
7. ציין את כמות ה-DNA של הפלסמיד שיש להעביר. פרוטוקול זה משתמש ב-20 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר DNA פלסמיד לכל טרנספקציה (ובכן).
   הערה: כמות ה-DNA של הפלסמיד המועברת לצלחת הטרנספקציה לפני טרנספקציה של הפרוטופלסט תהיה תלויה בפלטפורמת הפרוטופלסט שבה נעשה שימוש.
8. צור קובץ העברה מקובץ .csv מסמך.
   1. מסמך זה מורכב משתי עמודות. הכן את העמודה הראשונה, כלומר העמודה מאת, המציינת את מיקום ה-DNA של הפלסמיד בתוך מתלה הצינור, כלומר עבור דגימה 1; זה יהיה טוב A01. מכיוון שהעברה זו מתרחשת שלוש פעמים (שלוש חזרות), שלוש שורות צריכות לציין A01 בעמודה מאת.
   2. הכן את העמודה השנייה, כלומר לעמודה, המשמשת לציון יעד מבנה הפלסמיד היטב של צלחת 96 הבארות. לדוגמה, דגימה 1 (A01) יכולה להיות B02, D04 ו-H07. שמור את זה כקובץ .csv כדי להיות תואם לתוכנת הטיפול בנוזלים.
9. לפני הפעלת הפרוטוקול, בדוק שעמדות הסיפון נטענות, תוכנת המעבדה מוגדרת כהלכה, מסמך האקראיות כולל מיקומי באר עבור כל ה-DNA של הדגימה במדף הצינורות, ושיש מספיק דגימת פלסמיד בצינורות כדי לבצע את הפרוטוקול.
10. הרחב את תפריט מאפייני הקובץ של השלב העברה מקובץ, בחר את הקובץ .csv שנוצר והפעל את הפרוטוקול.
11. כסו את לוחות הטרנספקציה באטם רדיד אלומיניום כאשר הפרוטוקול הושלם בהצלחה. אחסן צלחות העברה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש. הפרוטופלסט המבודד של עלי תירס אטיולטים יתווסף ללוח טרנספקציה זה בשלב 3.3.

2. בידוד פרוטופלסט עלי תירס אטיולטי.

1. כדי להתחיל בבידוד של פרוטופלסט עלי תירס אטיולטים, השג רקע גנטי תואם פרוטופלסט כגון NP222 ששימש כאן¹⁸. הכן רק 3 מאגרים, כלומר מאגרי MMg, W5 ו-WI, המפורטים בטבלה 1 לפני תחילת הניסוי ושמור על 4 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת עיכול ו-PEG ביום הניסוי לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
2. יש לעקר 25 זרעים על ידי טבילתם בתמיסת אקונומיקה מסחרית של 25% וניעורם על שייקר פלטפורמה סיבובית למשך כ-15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר התסיסה יש לשטוף היטב את הזרעים באמצעות מים סטריליים (DI). חזור על שלב השטיפה 5 פעמים. שתו את הזרעים במים סטריליים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
4. זרעו את הזרע על אדמה לחה וחיטוי למחרת. הוסף כדורי חרס יבשים כדי לנדף עודף לחות מהאדמה כדי למנוע זיהום פטרייתי.
5. מגדלים את שתילי התירס בתא גידול קל של 16 שעות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס (לחות יחסית (לחות יחסית (30%) למשך כ -3 ימים עד שהקולאופטיל נמצא 1-2 ס"מ מעל האדמה ואז מעבירים לתא חשוך עם אותה טמפרטורה ו- RH למשך 5 - 7 ימים נוספים.
6. קצרו את רקמת העלים האמיתית הראשונה על ידי חיתוך ממש מעל הצווארון הראשון.
7. יש לעקר את רקמת העלים לזמן קצר ב-25% אקונומיקה מסחרית ו-250 מיקרוליטר של תמיסת 20% טווין 20 למשך דקה אחת. שוטפים היטב את חומר העלים פי 5 במי DI.
8. יבשו (בעדינות) את רקמת עלה התירס עם רקמות נטולות מוך, ובעזרת להב חד הסירו ~1.5 ס"מ הן מהקצה והן מהבסיס של כל להב עלה.
9. חותכים את רקמת העלים הנותרת לרצועות רוחביות צרות (0.5 מ"מ - 1 מ"מ) ומניחים בצלחת פטרי בגודל 100X25 מ"מ.
10. יש לעקר 25 מ"ל מתמיסת העיכול דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ישירות לתוך צלחת הפטרי המכילה את הרקמה הפרוסה.
11. ואקום חודר לרקמת העלים עם תמיסת עיכול על ידי הפעלת ואקום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במייבש ואקום בלחץ של כ-75 mbar.
    הערה: לחץ ואקום ביתי עבור מעבדות אקדמיות ופרטיות רבות אמור להספיק לשלב זה.
12. מניחים על שייקר פלטפורמה סיבובית ומנערים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ב-60 סל"ד למשך 2.5 עד 3 שעות. כאשר נותרו 10 דקות לסוף תקופת העיכול, הגדל את המהירות ל 90 סל"ד.
13. יוצקים את תמיסת העיכול וכל חומר צמחי לא מעוכל דרך משפך על גבי מסנן מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
14. צנטריפוגה את התמיסה בתוך צינור 50 מ"ל ב-150 x גרם למשך 4 דקות כדי לגלול את הפרוטופלסט. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10 - 15 מ"ל של תמיסת חיץ MMg.
15. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש במאגר MMg טרי של 5 - 10 מ"ל.
16. בעזרת המוציטומטר, מדוד בזהירות את צפיפות הפרוטופלסט המבודד. השעיה לצפיפות משוערת של 5 x 10⁵ פרוטופלסטים למ"ל.
17. אפשר לבודד לנוח על קרח במשך ~30 דקות לפני הטרנספקציה. במהלך תקופה זו, הכינו את תמיסת ה-PEG. ממיסים לחלוטין PEG לתמיסה באמצעות אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותו שם עד לטרנספקציה.

3. טרנספקציה אוטומטית של פרוטופלסט

הערה: שלבים 3.6 עד 3.15 מנוהלים לחלוטין על ידי המטפל האוטומטי בנוזלים, למעט שתי הפסקות המשתמש בשלבים 3.10 ו-3.13, הדורשות צנטריפוגה ידנית. צילומי מסך רלוונטיים העוקבים אחר פרוטוקול אוטומטי זה ניתן למצוא בתוספת, איור משלים 1, איור משלים 3, איור משלים 4 ואיור משלים 5.

1. הכן את פריסת הסיפון של המטפל בנוזלים להעברה בהתאם לשיטת העברת הפרוטופלסט המתוארת בשלבים הבאים. הרכיבו את החומרים הבאים: לוחית יעד (במקרה זה, תהיה שחורה של 96 בארות עם מיקרו-פלייט תחתון שקוף למדידת פלואורסצנטיות), קופסה אחת של 25 - 250 מיקרוליטר טיפים לאוטומציה רחבת קידוח לשלב שאיבת PEG, חמש קופסאות של 25 - 250 מיקרוליטר טיפים לאוטומציה של פיפטה עבור שלבי הטיפול בנוזלים הנותרים, שלוש שקתות פלסטיק כמאגרי ריאגנטים, צלחת ריקה אחת של 96 בארות לאיסוף פסולת, פתרונות שטיפת חיץ טרנספקציה שנותרו, W5 ו-WI.
2. מיד לפני תחילת הליך ההעברה, יש לסנן את תמיסת ה-PEG דרך יחידת מסנן ואקום חד פעמית סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.
3. מהפרוטופלסט המושעה מחדש במאגר MMg, הוסף 100 מיקרוליטר (כ -50,000 פרוטופלסט) לכל באר של צלחת הטרנספקציה המוכנה מראש ומופשרת. לשם כך, שפכו את תמיסת החיץ המכילה פרוטופלסט לשוקת סטרילית של 10 מ"ל והשתמשו בפיפטה רב ערוצית. המשך בתסיסה עדינה של השוקת כדי למנוע מהפרוטופלסט להתיישב מחוץ לתמיסה במהלך שלב העברה ידני זה.
4. יוצקים את תמיסת ה-PEG לשוקת המתאימה ומניחים את לוחית הטרנספקציה, המכילה כעת פרוטופלסט ו-DNA פלסמיד המכיל לוחית טרנספקציה, שהוכנה באמצעות שלב 1, במיקום שצוין בהתאם לפריסת הסיפון.
5. כדי ליצור שיטת טרנספקציה של פרוטופלסט, פתח את תוכנת המטפל בנוזלים ובצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. העברת כלי מעבדה בין חפיסות: החלף את תיבת הקצה הריקה בסיפון טעינת הקצה בחדשה באמצעות הפקודה Move Labware. בחר את החפיסות מ ו אל מהתצוגה תצורה .
   2. עבור נפחים גדולים מ-200 מיקרוליטר: אל תחליף את הקצוות בין ההעברות. עצות טעינה עבור שלב ההעברה הראשון ופריקה לאחר שלב ההעברה האחרון, מה שדורש לציין נכון את אפשרויות הטעינה/פריקה עבור כל שלב העברה כמו באיור משלים 3.
6. יצירת פריסת סיפון: בדומה לשיטת יצירת לוחות הטרנספקציה, כדי ליצור שיטת טרנספקציה אוטומטית של DNA, פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים. לחץ על לחצן שיטה חדשה משורת התפריטים כדי ליצור שיטה חדשה. הוסף קו הגדרת מכשיר בין קווי ההתחלה והסיום על ידי לחיצה על לחצן הגדרת המכשיר בלוח השמאלי. צור פריסת סיפון בהתאם לפריסת הסיפון המוצגת באיור משלים 1.
7. ערבוב תאים/DNA: הוסף שלב לערבוב פרוטופלסט ו-DNA לפני הוספת PEG באמצעות כפתור פעולת המכשיר והגדרת המכשיר (ניעור מיקום אוטומטי של תוכנת מעבדה או ALP), מהירות טלטול (1500 סל"ד) וזמן ניעור (10 שניות).
8. תוספת וערבוב PEG: כדי להתחיל את הטרנספקציה, הוסף שלב העברה להוספת 110 מיקרוליטר של PEG ממאגר PEG באמצעות פיפט של 96 תרמילים. ודא שמיקומי המקור והיעד הנכונים מתוכנתים בהתאם לפריסת הסיפון שצוינה. תכנת את שלב ההעברה לשאוב PEG 1 מ"מ מתחתית המאגר ולהפקיד את ה-PEG 3 מ"מ מבסיס צלחת 96 הבארות המכילה את תערובת הפרוטופלסט/DNA. הוסף שלב טלטול נוסף לאחר הוספת PEG על ידי העתקה והדבקה של השלבים שתוכנתו בעבר.
9. דגירה של PEG: הוסף שלב הפסקה על ידי בחירה בלחצן השהיה , בחר את השייקר והזן את זמן הדגירה שנקבע מראש, שמתחיל מתוספת PEG.
   הערה: שעון העצר של ההשהיה ימשיך אלא אם כן יהיו הפרעות או שיבושים בווילון האור שיגרמו להודעת שגיאה. ודא שאם יש צורך במניפולציה של החפיסה, הודעות אלה נמחקות לפני שאתה מתרחק.
10. הוספה/ערבוב של מאגר W5: הוסף שלוש שורות העברה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר בסך הכל 600 מיקרוליטר של מאגר W5 ללוחית הטרנספקציה כדי להרוות את תגובת הדגירה של PEG. עקוב אחר הוספת המאגר W5 על ידי ניעור והפסקת משתמש כדי לאפשר צנטריפוגה של לוחית הטרנספקציה.
11. השהיית משתמש 1: צנטריפוגה את לוחית הטרנספקציה של הפרוטופלסט ב-100 x גרם למשך 4 דקות. החזר את לוחית הטרנספקציה, כעת עם פרוטופלסט מגולגל, בחזרה למצב הסיפון המתאים. הוסף השהיית משתמש על-ידי לחיצה על לחצן השהה , אלא שכעת עם האפשרות השהה את המערכת כולה והצג את ההודעה שנבחרה.
    הערה: יש לנקות את החלון הקופץ של הודעת ההשהיה לפני שהמטפל בנוזלים ימשיך עם שאר הפרוטוקול.
12. הסרת סופרנטנט: הוסיפו שתי שורות של העברה כדי להסיר 400 מיקרוליטר של סופרנטנט והעבירו לצלחת הפסולת. כדי למנוע שאיבת תאים במהלך הסרת סופרנטנט, הגדר את המרחק מהקרקעית כ-6 מ"מ.
13. הוספה/ערבוב WI הוסף 3 קווי העברה כדי להעביר 580 מיקרוליטר של מאגר WI ללוחית הטרנספקציה. הוסף שלב טלטול נוסף לאחר הוספת WI על ידי העתקה והדבקה של השלבים שתוכנתו בעבר. המשך להשהיית המשתמש הבאה.
14. הפסקת משתמש 2: צנטריפוגה את לוחית הטרנספקציה של הפרוטופלסט ב-100 x גרם למשך 4 דקות. החזר את לוחית הטרנספקציה, כעת עם פרוטופלסט מגולגל, בחזרה למצב הסיפון המתאים.
15. הסרת סופרנטנט: הוסיפו ארבע שורות של העברה כדי להסיר 680 מיקרוליטר של סופרנטנט והעבירו לצלחת הפסולת. כדי למנוע שאיבת תאים במהלך הסרת סופרנטנט, הגדר את המרחק מהקרקעית כ-6 מ"מ.
16. העברת פרוטופלסטים למיקרו-פלטה: ההעברה הסופית של פרוטוקול זה מורכבת משני שלבי העברה של 150 מיקרוליטר. לפני כל שלב בודד, שאפו שוב ושוב פרוטופלסטים ב-50 מיקרוליטר לשנייה ב-2 מ"מ מתחתית לוחית הטרנספקציה והוציאו ב-3 מ"מ. לאחר מכן, תוך שימוש באותם קצות פיפטה, העבירו למיקרו-פלטת היעד.
    הערה: שאיבה וחלוקה של נפח חיץ מעל הגלולה לפני ההעברה למיקרופלייט תפריע לכל הפרוטופלסטים שנותרו בתחתית לוחית הטרנספקציה כדי להבטיח שאין אובדן דגימה. מכיוון שהאקראיות נעשתה במהלך יצירת לוחית הטרנספקציה, זה מסכם את הפרוטוקול האוטומטי.
17. דגרו את המיקרו-צלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 24 עד 48 שעות לפני מדידת הקרינה הראשונה.

Results

כדי להשיג נתונים תצפיתיים התומכים בכך שהשפעות קצה עשויות להשפיע על מדידות התגובה; מחקר פיילוט נערך כדי לאשר את החשדות הללו. עבור מחקר זה, השיטות לעיל יושמו על שלוש צלחות משוכפלות של 96 בארות עם רמת טיפול אחת בלבד; כל הפרוטופלסטים הועברו באמצעות pSYN11250¹⁹, פלסמיד המבטא באופן מכונן את ZsGreen, במטרה להראות שקיימים הבדלים שיטתיים ברמת התגובה ליחידות בקצה הצלחת בהשוואה לשורה השנייה, ואזורים מרכזיים של הצלחת. 36 הבארות בקצה החיצוני של הלוח מוגדרות כבלוק 1, 28 הבארות בשורה השנייה מהקצה כבלוק 2, ו-32 הבארות המרכזיות כבלוק 3 - ראה איור 2A פאנל ימני תחתון. סידור זה יכול להכיל 28 רמות טיפול כעיצוב בלוק שלם אקראי (RCBD) או 32 רמות טיפול כעיצוב בלוק לא שלם אקראי (RIBD). באיור 2A, עבור כל שכפול (חזרה), נקודות הנתונים הגולמיות עבור כל באר נורמלו על ידי הממוצע מאותה צלחת מתאימה. בכל שלושת השכפולים של הניסוי, התגובות בקצה הצלחת גדולות בממוצע פי 1-1.5 מהמינימום. איור 2B מתאר את ממוצע הבלוק כאחוז מממוצע הלוח הכולל עבור כל שכפול. טבלה 2 מציגה טבלאות ANOVA חד-כיווניות מהתאמת מודל ליניארי עם בלוק כאפקט קבוע. מסיבות הקשורות לאקראיות המוגבלת הכרוכה בעיצובי בלוקים, הסקה המבוססת על בדיקת השערות לגורם החוסם נחשבת כמשוערת במקרה הטוב ופסולה במקרה הרע. עם זאת, התאמת מודל עם גורם חסימה קבוע שימושית כדי להעריך אם תוכנית חסימה מועילה. Mn_Sq (בלוק) מייצג את הסטייה הריבועית הממוצעת של ממוצע הבלוק בערך הממוצע הכולל. Mn_Sq (שגיאה) מייצג את הסטייה הריבועית הממוצעת של התצפיות הבודדות על ממוצע הקבוצה שלהן, במקרה זה, הממוצע הכולל מכיוון שאין גורם טיפול במודל. כאשר Mn Sq (בלוק) גדול מ-Mn Sq (שגיאה), כלומר, יחס ה-F גדול מאחד, גודל השגיאה הריבועית הממוצעת הצטמצם למעשה ביחס לעיצוב אקראי לחלוטין (CRD), ובכך מגדיל את הכוח הסטטיסטי להשוות את הטיפולים המעניינים ולהקטין את רוחב מרווחי הסמך המעריכים ניגודי טיפול. איור 2B מציג יחסי F העולים בהרבה על אחד, והתגובה הנמדדת נוטה לרדת ככל שהיא נעה לכיוון המרכז בכל שלושת לוחות השכפול. בכל שלושת השכפולים, נצפים מרווחי סמך של 95% ברמה 0.05 עבור לפחות בלוק אחד שאינו מכסה את ממוצע הלוח הנצפה. לפיכך, ניתן להסיק כי תוכנית החסימה מגדילה באופן משמעותי את הדיוק של אומדנים אלה. מעבר לדיוק פחות, אי התחשבות בשונות המטרד המרחבי עלולה להוביל לתוצאות מזויפות בשל האפשרות לבלבל את השפעות הטיפול עם אפקט הקצה.

למרות שיש היסטוריה ארוכה של פרוטוקולי בידוד וטרנספקציה של פרוטופלסט תירס אטיוליטי שראשיתה בתחילת שנות ה-90, פרוטוקול זה מציג כמה שינויים נוספים לנוהל המסורתי כדי להקל טוב יותר על בידוד פרוטופלסט בתפזורת הניתן לשחזור למטרות טרנספקציה של פרוטופלסט^{בתפוקה גבוהה 20}. שלבי עיקור פני השטח של רקמת הזרע והעלים לפני העיכול מפחיתים את הזיהום הפטרייתי ללא צורך במדיה אספטית. ניצול אדמה יעזור גם לשמור על עלויות נמוכות ביחס לשימוש באמצעי גידול מיוחדים או קניית מיכלים חד פעמיים סטריליים לשימוש חד פעמי. ניתן לשנות את קנה המידה של הפרוטוקול בשלבים רבים כך שיתאים לרמות שונות של תפוקה. כ-2 גרם של רקמת עלה ראשון מביא בין 5 x 10⁶ - 10 x 10⁶ פרוטופלסטים. מכיוון שנדרשים 5 x 10⁶ פרוטופלסטים לכל טרנספקציה של 96 בארות, פרוטוקול הבידוד, כפי שהוא כתוב, יכול להכיל 2 ריצות של פרוטוקול הטרנספקציה. פרוטוקול זה משתמש גם ב-MMg כתמיסת הכביסה במקום בתמיסת W5 הקנונית. זה נגזר במקור מפרסומים עבור פרוטופלסט שורש Arabidopsis כאמצעי להפחתת מספר פתרונות החיץ המשמשים לכל שלב נתון של הליך טרנספקציה של פרוטופלסט²¹. עם זאת, הוא שימש גם עבור פרוטופלסט עלי תירס אטיולטים במהלך 2022²². שיפור נוסף לבידוד והעברה של כל פרוטוקול פרוטופלסט יהיה פישוט והפחתה של פתרונות חיץ. כפי שהוא נראה כרגע, פרוטוקול זה עובר בין מאגר העיכול הקנוני, מאגר W5, מאגר MMg ומאגר WI. פישוט הפתרונות יועיל מאוד לשיפור יכולת השחזור של ניסויי פרוטופלסט ולהפחתת השונות מאדם לאדם או מאצווה לאצווה בין ניסויים. יש לציין כי החידוש האחרון של הפרוטוקול הוא היעדר הסרה מוחלטת של פתרונות חיץ לאחר טרנספקציה של PEG. הסיבה לכך שהאוטומציה אפשרית היא מכיוון שהפרוטופלסט, התירס האטיולי המוצג כאן ואחרים שבדקנו, היא שנראה שהם סובלים את הדילול כאמצעי לדיכוי התגובה במקום הסרה מוחלטת של פתרונות החיץ השונים¹¹. ייצור המדווח, כפי שמצוין על ידי בקרת הטרנספקציה של GFP המשמשת כאן, מצביע על כך שפרוטופלסט יכול לסבול עד 5% PEG ללא השפעה שלילית על עוצמת הקרינה (איור משלים 6). ערך זה הוא יותר מכפול ממה שיהיה ריכוז ה-PEG הצפוי עם השלמת הפרוטוקול המתואר כאן.

איור 1: סכימה להמחשה של הליך בידוד הפרוטופלסט והטרנספקציה. שלבים, שבהם הוכנסה אוטומציה מסומנים על ידי הקווים האדומים המקווקווים והתיבות הכחולות הנלוות. מספרים המוקפים בעיגול אדום תואמים לשלוש השיטות המתוארות. נוצר עם BioRender.com. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפקט הקצה וההשפעה של הפחתת פריסות שכפול. (A) מפות טופוגרפיות המציגות שינוי קיפול של עוצמת הקרינה עבור לוחות של 96 בארות שהועברו עם pSYN11250 ביחס לממוצע הלוח עבור 3 ניסויי שכפול בלתי תלויים (Rep). הממוצע של הניסויים הללו מוצג גם עם סכימת החסימה, המסומנת על ידי קווים מקווקוים בצבעים שונים המונחים מעל. (ב) תרשימי רצועה המראים את אמצעי הבלוק כאחוז מממוצע הלוח הכולל עבור לוחות שכפול 1, 2 ו-3 משמאל לימין. העיגולים השקופים למחצה מייצגים את נקודות הנתונים הגולמיות לאחר החלוקה בממוצע הצלחת. קווי השגיאה הם רווחי בר-סמך של 95% ברמה 0.05, כאשר המקף המרכזי מציין את הממוצע. הצבעים החום, הזהוב והאפור מציינים את הקצה, השורה השנייה והחלק הפנימי של הצלחת, בהתאמה. הקו האדום המקווקו ב-100% מייצג את ממוצע הצלחת הכולל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מאגר	מגיב
עיכול	1.5% תאית Rs
	0.3% מקרו-אנזים
	מניטול 0.6 מ'
	10 מ"מ MES (pH 5.7)
	1 מ"מ CaCl2
	0.1% (w/v) BSA
	0.5 ננומטר β-מרקפטואתנול או 0.5 מ"מ DTT
מ.מ.ג	מניטול 0.6 מ'
	15 מ"מ MgCl2
	4 מ"מ MES, pH 5.7
W5	154 מ"מ NaCl
	125 מ"מ CaCl2
	5 מ"מ KCl
	2 מ"מ MES, pH 5.7
ויסקונסין	מניטול 0.6 מ'
	4 מ"מ MES, pH 5.7
	4 מ"מ KCl
יתד	30% PEG (w/v)
	מניטול 0.6 מ'
	100 מ"מ CaCl2

טבלה 1: פתרונות חיץ לבידוד וטרנספקציה של פרוטופלסט תירס אטיולטי.

נציג	מקור	דף.	סכום מרובע	Mn Sq	ערך F	יח"צ (>F)
שכפל 1	חסימה	2	0.26	0.13	10.64	<0.001
	שיורית	93	1.135	0.012
שכפל 2	חסימה	2	0.507	0.25	21.41	<0.001
	שיורית	93	1.102	0.012
שכפל 3	חסימה	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	שיורית	93	1.861	0.02

טבלה 2: טבלת ANOVA חד כיוונית עבור שלושת השכפולים של ניסוי הטרנספקציה pSYN11250 עם 96 בארות. עבור כל לוח שכפול: עמודת המקור מציינת את מקור הווריאציה, Df מציין דרגות חופש, Sum Sq מציין סכום ריבועים, Mn Sq מציין ריבועים ממוצעים (Sum Sq/Df), ערך F מציין את היחס בין Mn_Sq (בלוק) ל-Mn_Sq (שגיאה), ו-Pr(>F) מציין את ערך ה-p של מבחן F הכללי.

איור משלים 1: צילומי מסך של לוח המחוונים של התוכנה. קטגוריות בחירה הנוגעות ליצירת שיטה חדשה כמו גם פריסות החפיסה עבור פרוטוקולי אקראיות וטרנספקציה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: שלבי מפתח בהגדרה של פרוטוקול יצירת לוחות טרנספקציה. צילומי מסך שצולמו במהלך יצירת פרוטוקול יצירת לוחית הטרנספקציה. המספר והכותרת של כל פאנל תואמים לשלבים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: צילומי מסך עבור מניפולציה של תוכנות מעבדה וטעינת טיפים ליצירת פרוטוקול טרנספקציה. אלה מייצגים שלבים המתרחשים פעמים רבות לאורך הפרוטוקול, כך שכדי להימנע מאזכור חוזר של צעדים מייצגים מוצגים כאן. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: ערבוב תא-DNA באמצעות השהיית משתמש 1. צילומי מסך שצולמו במהלך יצירת פרוטוקול הטרנספקציה. המספר והכותרת של כל פאנל תואמים לשלבים בגוף הפרוטוקול. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 5: הסרת סופרנטנט לאחר השהיית משתמש 1 באמצעות העברת דגימות למיקרו-פלטה. צילומי מסך שצולמו במהלך יצירת פרוטוקול הטרנספקציה. המספר והכותרת של כל פאנל תואמים לשלבים בגוף הפרוטוקול. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 6: פרוטופלסט עלי תירס אטיולטים של ZsGreen שטופל בריכוזים שונים של PEG במהלך זמן חיץ WI. תרשים עמודות המציג את עוצמת הקרינה היחסית של פרוטופלסט לאחר טיפול PEG ב-24, 48 ו-72 שעות עם מדידה על ידי קורא מיקרו-פלטות. שורת שגיאה = SD, n = 4. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לאוטומציה של יצירת לוחות טרנספקציה ובידוד פרוטופלסט עלי תירס עם טרנספקציה אוטומטית. להשלמה מוצלחת של חלק יצירת לוחות הטרנספקציה של הפרוטוקול, הוא דורש רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים המצויד בתרמיל בעל 8 ערוצים. עבור פרוטוקול הטרנספקציה, מומלץ תרמיל של 96 בארות עבור טרנספקציה מלאה ואחידה של 96 בארות. ניתן להשלים את שיטת הטרנספקציה באמצעות תרמיל בעל 8 ערוצים, אך יש לקחת בחשבון במיוחד את משך הזמן שלוקח צעדי השאיפה והחלוקה, כמו גם את הזמן שניתן לייחס להחלפת טיפים בין עמודות. הבדלים במשך הדגירה של PEG מתועדים היטב כבעלי השפעה משמעותית על יעילות הטרנספקציה והביטוי, ולכן יש לשקול תשומת לב מיוחדת לגורמים תורמים אלה כדי למנוע פער בטיפול בדגימה¹³. לפני שמתחילים בפרוטוקול המטפל בנוזלים, חשוב לשקול את שלבי הפרוטוקול והאם ניתן להשלים פעילויות מסוימות בו זמנית. פרוטוקול זה משתמש במכשיר שטוען טיפים על תרמיל 96 הבארות ממיקום אחד על הסיפון. המטפל בנוזלים עבור פרוטוקול זה כולל פונקציה שבה הרובוט מחליף קופסאות טיפים במהלך תקופות הדגירה או במהלך שלבי ההשהיה של המשתמש כדי להימנע מהוספת זמן נוסף לפרוטוקול. בעת קבלת ההחלטה לקנות מטפל בנוזלים, חשוב על פונקציונליות ונוחות פוטנציאלית לחיסכון בזמן.

בעוד שפרוטוקול זה פותח כדי להשתמש בהתקני Beckman Coulter NXp ו- Biomek FX, ניתן להתאים פרוטוקול זה לכל התקן טיפול בנוזלים דומה. לכל המטפלים בנוזלים יש אמצעים מסוימים לציין כיצד להעביר נפחים ממקום אחד למשנהו וכמה. עבור פרוטוקול זה, התקנים אלה השתמשו בפקודה העברה משורת קובץ. אם כלי המעבדה מוגדר כהלכה, משתמש יכול לעבור מכל כלי או אליו. בנסיבות חריגות, כגון אם מדפי צינורות או מתאמים אינם זמינים מסחרית, ניתן להשתמש בהדפסת תלת מימד במחברים כאלה. עבור פרוטוקולי טרנספקציה אופייניים של פרוטופלסט, 20 מיקרוגרם DNA בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר הוא נפח סטנדרטי של חומר עבור פלטפורמות פרוטופלסט רבות¹³_. במהלך יצירת לוחית הטרנספקציה, כאמצעי זהירות נוסף, השתמש בקצות מסנן של 0.2 - 20 מיקרוליטר כדי למזער כל סיכון לזיהום עקב פלסמיד תרסיס במהלך ההעברה. הסרת המרכיב האנושי של ההכנה מפחיתה את השונות לאורך זמן ומשפרת את יכולת השחזור של ניסויים בעלי תפוקה גבוהה אלה. כמו כן, ניתן להכין צלחות זמן רב מבעוד מועד. הכנה זו תקל על הלחץ של מדען הטרנספקציה ביום הניסוי. עם זאת, חשוב להימנע מאחסון לוחות אלה של DNA פלסמיד ב-4 מעלות צלזיוס לפרקי זמן ממושכים מכיוון שדגימות עלולות להתאדות. יש לאחסן דגימות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ניתן להפשיר אותן במקרר של 4 מעלות צלזיוס לפני ההעברה. לאחר שפרוטוקול יצירת לוחית טרנספקציה זה מתוכנת, הוא אמור להיות ניתן לחזרה בקלות על ידי אספקת .csv העברה מקובץ חדש ותפוסת אותם מיקומי סיפון עבור הדגימות, תוכנות המעבדה והריאגנטים.

עבור הליך ההעברה האוטומטי (שלב 3), מכינים עודף של תמיסת PEG כדי להבטיח שאיפה שווה של הנוזל הצמיג מהשוקת, בדרך כלל עודף של 40 מ"ל כדי להסביר את הנפח המת. שימוש בדיוק בכמות הנדרשת לטרנספקציה יכול לגרום למשיכת אוויר לתוך הפיפטות ולשאיבת נפחים לא אחידים של PEG על פני ראש 96 הערוצים. אמנם ניתן להכין פתרון זה גם מבעוד מועד, אך מומלץ להכין אותו ביום הטרנספקציה. עיקור תמיסת ה- PEG יכול להיעשות באמצעות פילטר מזרק, אך בשל הצמיגות זה יכול להיות קשה. השימוש ביחידת מסנן ואקום מהיר יותר ויכול להקל על כל תסכול או כאב הקשורים לפעילות זו. בדומה לתמיסת ה-PEG, מסופק גם עודף של פתרונות חיץ טרנספקציה אחרים (W5, WI) כדי להבטיח פיפטינג שווה על פני ראש 96 הערוצים. ניתן להכין תמיסות חיץ (W5 ו-WI) מבעוד מועד בכמויות גדולות לשימוש לריצות עתידיות של מטפל בנוזלים. בעוד שהריאגנטים אינם יקרים, יש כמות לא מבוטלת של הקרבה של תמיסת חיץ. עם המספר ההולך וגדל של ריצות ביום, ייתכן שעדיף להשתמש בחלופות למאגר שיפחיתו את העודפים המושלכים בסוף הריצה. במהלך הפעלת פרוטוקול המטפל בנוזלים, ניתן להוסיף W5 ו-WI לשקתות המתאימות לפני תחילת הפרוטוקול, במהלך הדגירה של 15 דקות, או במהלך שלבי ההשהיה של המשתמש בפרוטוקול. היזהר בעת הוספת חוצצים במהלך תקופת הדגירה בשל תכונות בטיחות כמו וילון אור. הקפד לנקות את כל הודעות האזהרה מהתוכנה כדי למנוע כל הפרעה לא מכוונת של הפרוטוקול.

פרוטוקול זה משקף שיפור אמין, חוזר וישים באופן נרחב על פרוטוקולים אוטומטיים שתועדו בעבר לטיפול בפרוטופלסט^12,13. שיטה זו ניתנת להתאמה לרפרטואר האינסופי לכאורה של פרוטוקולי פרוטופלסט מכיוון שרבים תלויים באותה סדרה של שלבי מניפולציה של מאגר. הפחתת אפקט הקצה באמצעות ה-RICBD במהלך יצירת לוחית הטרנספקציה האוטומטית מפחיתה בו זמנית את כמות המאמץ והשונות תוך החלת תיקון מובהק סטטיסטית של אפקט הקצה. טרנספקציה של 96 בארות של פרוטופלסט מבטלת את האפשרות של כל וריאציה הקשורה לזמן הדגירה של PEG, ומבצעת את התגובה בתוך כל 96 הבארות בו זמנית. בעוד שהפרוטוקול נועד להשיג אוטומציה מלאה של שלבי הטרנספקציה, הפסקות המשתמש ידרשו התערבות פיזית של מדען הטרנספקציה. בשנים האחרונות חלו התקדמות רבה בצנטריפוגות עמידות לחוסר איזון ותואמות אוטומציה. בעזרת ציוד זה ניתן יהיה להפוך את השיטה כולה לאוטומטית ללא מעורבות המשתמש. לחלופין, פרוטוקולים אחרים נמנעו מצנטריפוגה בכך שאפשרו לפרוטופלסט להתיישב בתחתית הבאר לאחר טרנספקציה^12,13. עם זאת, זה יוסיף זמן נוסף להליך הטרנספקציה ועודף זמן דגירה במאגר W5 לפני דגירה לילה ב-WI.

במקומות רבים בשיטת הטרנספקציה, הוא מתאר את הטיפול בנפחים העולים על 200 מיקרוליטר כאשר הטיפול בנוזל חייב להיעשות באמצעות העברות מרובות. בהתאם לגיל ולדגם של המטפל בנוזלים, שלב זה יכול וצריך להיעשות כנפח אחד בודד. עבור מטפלי הנוזלים הוותיקים יותר, כמו הדגם המתואר כאן, המקסימום שניתן לשאוב באמצעות ראש של 96 בארות הוא 200 מיקרוליטר. שיפור ברור לשיטה הן ביעילות והן ברמת הדיוק יהיה להפחית את מספר ההעברות כדי למזער כל סיכון פוטנציאלי לשפיכה, טפטוף או זיהום. שיקולים אחרים לשיפור פרוטוקולי הטיפול בנוזלים מתוארים בסקירות של טכנולוגיות אלה וניצולן בתחום הביוטכנולוגיה²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)&בטא;-מרקפטואתנול	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES) מונוהידראט	Sigma	69892
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל עם מכסה שטוח סטרילי	פישר	22-010-064
96 באר אופטי Btm Plt פולימר בסיס שחור עם מכסה תרבית תאים סטרילית PS .4 מ"ל באר	פישר	12-566-70
Axygen Biomek FX / NX טיפים רובוטיים, לא סטריליים, פישר רחב משעמם		14-222-096
Axygen Robotic Tips מסנן 30uL, סטרילי, מתלה	פישר	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion מייבש ואקום בסגנון עגול	פישר	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 רגל רול מעבדה Parafilm	פישר	13-374-16
Biomek FXP	בקמן קולטר	902508
סידן כלוריד דיהידראט	סיגמא	C5080
Chemglass מדעי החיים המוציטומטר חד פעמי	פישר	50-131-1352
אקונומיקה קוטל חיידקים קלורוקס,
קורנינג מיקרופלייט	פישר	07-200-684
קורנינג 96 בלוקים לבדיקת בארות, 2 מ"ל, 96 באר סטנדרטיים	פישר	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	סיגמא	M9546
פישרברנד 60 מ"ל מזרק פלסטיק	פישר	14-955-461
פישרברנד מסננת תאים סטרילית 40um	פישר	22-363-547
פישרברנד צלחות פטרי עם מכסה שקוף, ניתן לערום, 100 מ"מ x 25 מ"מ, מארז של 325	פישר	FB0875711
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	סיגמא	M2670
יחידת מסנן מונעת מזרק Millex סטרילית 33 מ"מ PES .22um	פישר	SLGPR33RS
יחידת מסנן מונעת מזרק Millex סטרילית 33 מ"מ PVDF.45um	פישר	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליות 50 מ"ל	PES פישר	SCGP00525
פולי (אתילן גליקול) 4000	סיגמא	81240
רדי-ארת' פלאג & תערובת שתילים	Wyatt Quarles	GP92747
סכיני גילוח סכין גילוח בקצה יחיד בחזרה .009RD	פישר	12-640
מוצרי מחקר בינלאומיים Corp Cellulase RS	פישר	50-213-232
מוצרי מחקר בינלאומיים Corp Macerozyme R-10	פישר	50-213-444
נתרן כלורי	סיגמא	S7653
מגש פנימי - 36 תאים - 6x6 מקונן	האמרט	11635000
Tween-20	משאבת ואקום Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 הרץ, תקע ארה"ב	VWR	97058-164