הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפעלת מחקרי ביטוי טרנסגנים בתפוקה גבוהה באמצעות טיפול אוטומטי בנוזלים עבור פרוטופלסטים בעלי עלי תירס אטיוליים

968 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65989

⸱

16 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Syngenta Crop Protection, LLC

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר יצירת פריסת טרנספקציה אקראית באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי, פרוטוקול בידוד פרוטופלסט לעלי תירס אטיולטי, והליך טרנספקציה של 96 בארות באמצעות מטפל בנוזלים.

תקציר

תחום הביוטכנולוגיה של הצמח חווה התקדמות יוצאת דופן בשנים האחרונות, שחוללה מהפכה ביכולת לתפעל ולהנדס צמחים למטרות שונות. עם זאת, ככל שהמחקר בתחום זה גדל במגוון והופך מתוחכם יותר ויותר, ברור יותר הצורך בפתרונות סינון חולפים מוקדמים, יעילים, אמינים ובעלי תפוקה גבוהה כדי לצמצם אסטרטגיות המתקדמות לטרנספורמציה יציבה. שיטה אחת שצצה מחדש בשנים האחרונות היא ניצול פרוטופלסט צמחי, שעבורו קיימות שיטות בידוד וטרנספקציה במינים, רקמות ושלבי התפתחות רבים. עבודה זו מתארת פרוטוקול אוטומטי פשוט להכנה אקראית של פלסמיד בתוך צלחת של 96 בארות, שיטה לבידוד של פרוטופלסט עלי תירס אטיולטי, והליך טרנספקציה אוטומטי. אימוץ פתרונות אוטומטיים בביוטכנולוגיה של צמחים, המודגם על ידי פרוטוקולי טיפול בנוזלים חדשניים אלה להעברת פרוטופלסט צמחי, מייצג התקדמות משמעותית על פני שיטות ידניות. על ידי מינוף אוטומציה, חוקרים יכולים להתגבר בקלות על המגבלות של שיטות מסורתיות, לשפר את היעילות ולהאיץ את ההתקדמות המדעית.

מבוא

טרנספקציה של פרוטופלסט צמחי, החדרת חומר גנטי זר לתאי צמחים נטולי דפנות תאים, היא טכניקה מרכזית, ובחצי המאה האחרונה מקיפה מינים רבים התומכים במחקר ביוטכנולוגיה של צמחים. עם זאת, השימוש בשיטות אלו יכול להיות כואב ומוגבל בהיקפו, אפילו עם מיליוני פרוטופלסטים המיוצרים בכל בידוד. שיטות מסורתיות של טרנספקציה של פרוטופלסט צמחי הן לרוב מייגעות, גוזלות זמן, נוטות לשונות ותובעניות מבחינה טכנית, מה שמוביל למערכות נישה עם יכולת שחזור נמוכה1. עם זאת, הפוטנציאל שהציגו פתרונות אוטומטיים בשנים האחרונות מאיר את האפשרות להפיח חיים חדשים בטכניקה הצעירה הזו בת 60 שנה 2,3. עם הפוטנציאל של אוטומציה של שלבים חיוניים אך חוזרים על עצמם כגון הכנת חומרים, דגירה של פולי-אתילן גליקול (PEG) וחלוקת ריאגנטים לאחר מכן, חוקרים יכולים להפחית משמעותית את דרישות הטיפול הפיזי ומקורות פוטנציאליים אחרים לטעויות אנוש4. יתר על כן, הבקרה המדויקת והאחידות המוצעות על ידי מערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים מבטיחות תוצאות העברה עקביות וניתנות לשחזור.

בעוד שבידוד פרוטופלסט הוא תהליך קפדני הכולל קיצוץ, עיכול, דגירה, סינון וצנטריפוגה, חלק הטרנספקציה של פרוטוקולים אלה מותאם למטפלים בנוזלים אוטומטיים. ההליך עבור רוב פרוטוקולי הטרנספקציה של פרוטופלסט הוא מתווך PEG, וערבוב הפרוטופלסט המבודד בנוכחות PEG ו-DNA פלסמיד מטוהר למשך זמן מוגדר בריכוז מדויק (תלוי במין וברקמה) מאפשר לתאים אלה לקלוט את ה-DNA של הפלסמיד5. לאחר טרנספקציה זו באה סדרה של שלבי שטיפה, ששיאם בדגירה של לילה6. לאחר תקופת הדגירה, אם הכל תוכנן ונמסר כראוי, הניסוי מביא לביטוי של מרכיב העניין ו/או הפוטנציאל להעריך רכיבים רגולטוריים שונים7. כל שלבי השאיפה, החלוקה והתסיסה/ערבוב הקשורים להליך זה יטופלו בדרך כלל על ידי פיפטה ידנית. ביצוע פרוטוקול כזה ביד, תגובה בודדת אחת בכל פעם, הוא מייגע ומציג שונות מיותרת בין הדגימות תוך הגבלת היכולת שניתן להעריך בכל זמן נתון. פרוטוקולים אוטומטיים למניפולציה של תאי יונקים או חרקים וסינתזה כימית בתעשיית התרופות קיימים כבר מספר שנים 4,8,9. ניצול פרוטופלסט ופרוטוקולים הכוללים טיפול אוטומטי בנוזלים בחומרים צמחיים נמצאים בעלייה 10,11,12,13.

אימוץ פרוטוקולי טיפול אוטומטיים בנוזלים להעברת פרוטופלסט צמחי טומן בחובו הבטחה גדולה ליישומי מחקר. חוקרים יכולים לחקור ספריות גנטיות גדולות יותר, לסנן תפקודי גנים ספציפיים בקצב מואץ, ולחקור אינטראקציות גנטיות מורכבות הקשורות ללחץצמחי באופן מקיף יותר. יכולת ההרחבה של גישות אוטומטיות המשתמשות בתרמילים של 96 בארות בשילוב עם סינון פלואורסצנטי מאפשרת ניסויים בתפוקה גבוהה ומאפשרת למדענים לייצר במהירות נתונים ותובנות שיכולים להניע התקדמות בביוטכנולוגיה של צמחים11. עם זאת, עם עלייה זו בתפוקה, המובילה ליצירת מאות, אם לא אלפי נקודות נתונים, חייבת להיות בקרת איכות נוספת הלוקחת בחשבון את כל מקורות השגיאה שעלולים לבלבל את התוצאות15. אלמנט אחד שזוהה כגורם תורם בדיסציפלינות מדעיות רבות הוא אפקט הקצה. כמה אסטרטגיות הקלה יציעו את הצלחת הטובה ביותר לשימוש או מילוי חלל בין בארות או את הבארות החיצוניות ביותר במים כדי להילחם בתופעהזו 16,17. עם זאת, אסטרטגיות אלו מוסיפות זמן, ואם חד פעמי ספציפי אינו זמין, האפשרות היחידה היא להסתפק בפחות או לדחות. לחלופין, הסתכלות על אסטרטגיות שמסבירות את האפקט הזה באמצעות סכימת חסימה אינה מקריבה את התפוקה או העיכוב לביצוע.

פרוטוקול פרוטופלסט עלי תירס אטיולי זה ושתי השיטות האוטומטיות שלו המוצגות באיור 1 מבקשים לטפל בשונות הטבועה בניסויי פרוטופלסט על ידי אוטומציה של חלקים מרובים של שיטת הפרוטופלסט הקנונית, הקצאת חומר פלסמיד לכלי המשמש לטרנספקציה והטרנספקציה עצמה. שיטות אלו מודגמות עבור פלטפורמת הפרוטופלסט של עלי תירס אטיולטים מכיוון שהיא פלטפורמת פרוטופלסט מאופיינת היטב, פשוטה ויעילה. כל השלבים המפורטים בפנים נגישים באופן מיידי לפרוטוקולי טרנספקציה של פרוטופלסט, המשתמשים בפתרונות מאגר דומים או זהים. עם זאת, יש לשקול תשומת לב מיוחדת למאפיינים הייחודיים של רקמת מקור פרוטופלסט ומינים לפני אימוץ טכניקות אלה. שיפורים אלה באמצעות אוטומציה מפשטים את הכנת החומר לניסויים בודדים ומשפרים משמעותית את התפוקה, מהעברה רציפה אחד אחד ל-96 טרנספקציות המטופלות בו זמנית. עבודה זו תראה גם הצדקה לשימוש בבלוקים אקראיים לא שלמים כדי להסביר את הטיית מיקום הצלחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. יצירת צלחת טרנספקציה

  1. יצירת פריסת סיפון: כדי ליצור שיטת אקראיות של לוחות DNA, פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים. לחץ על הלחצן שיטה חדשה משורת התפריטים כדי ליצור שיטה חדשה. הוסף קו הגדרת מכשיר בין קווי ההתחלה והסיום על ידי לחיצה על לחצן הגדרת המכשיר בלוח השמאלי.
    הערה: ניתן למצוא צילומי מסך רלוונטיים העוקבים אחר פרוטוקול אוטומטי זה באיור משלים 1, איור משלים 2 ואיור משלים 3.
  2. לחץ על קו הגדרת מכשירים , מצא את תוכנת המעבדה הנכונה מתפריט הקטגוריה Labware וגרור אותם לפריסת הסיפון כפי שמוצג באיור משלים 1.
    הערה: אם תוכנת המעבדה לא הוגדרה בעבר, יהיה צורך לתכנת אותה לתוך המטפל בנוזלים בהתאם למפרט היצרן, אך הוראות כאלה אינן כלולות בפרוטוקול זה.
  3. העברה מ-file הגדרה: לחץ על העברה מ-File כפתור בלוחות השלבים והצב את העברה מ-File שורה מתחת לקו ההתקנה של המכשיר. ודא שבחירת הקצה והחלפתו הם כפי שמוצג באיור משלים 3.
  4. בדוק שלקובץ יש שורת כותרת וודא שפרטי העמודה נכונים.
  5. לחץ על אזור המקור כדי להפעיל אותו ולחץ על לוחית המקור מפריסת הסיפון, הגדר את לוחית היעד והזן את כמות ה-DNA שיש לזרום.
  6. לחץ על כפתור התאמה אישית כדי להגדיר את טכניקת הפיפטינג בפירוט, כגון נגיעות קצה על הקיר.
  7. ציין את כמות ה-DNA של הפלסמיד שיש להעביר. פרוטוקול זה משתמש ב-20 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר DNA פלסמיד לכל טרנספקציה (ובכן).
    הערה: כמות ה-DNA של הפלסמיד המועברת לצלחת הטרנספקציה לפני טרנספקציה של הפרוטופלסט תהיה תלויה בפלטפורמת הפרוטופלסט שבה נעשה שימוש.
  8. צור קובץ העברה מקובץ .csv מסמך.
    1. מסמך זה מורכב משתי עמודות. הכן את העמודה הראשונה, כלומר העמודה מאת, המציינת את מיקום ה-DNA של הפלסמיד בתוך מתלה הצינור, כלומר עבור דגימה 1; זה יהיה טוב A01. מכיוון שהעברה זו מתרחשת שלוש פעמים (שלוש חזרות), שלוש שורות צריכות לציין A01 בעמודה מאת.
    2. הכן את העמודה השנייה, כלומר לעמודה, המשמשת לציון יעד מבנה הפלסמיד היטב של צלחת 96 הבארות. לדוגמה, דגימה 1 (A01) יכולה להיות B02, D04 ו-H07. שמור את זה כקובץ .csv כדי להיות תואם לתוכנת הטיפול בנוזלים.
  9. לפני הפעלת הפרוטוקול, בדוק שעמדות הסיפון נטענות, תוכנת המעבדה מוגדרת כהלכה, מסמך האקראיות כולל מיקומי באר עבור כל ה-DNA של הדגימה במדף הצינורות, ושיש מספיק דגימת פלסמיד בצינורות כדי לבצע את הפרוטוקול.
  10. הרחב את תפריט מאפייני הקובץ של השלב העברה מקובץ, בחר את הקובץ .csv שנוצר והפעל את הפרוטוקול.
  11. כסו את לוחות הטרנספקציה באטם רדיד אלומיניום כאשר הפרוטוקול הושלם בהצלחה. אחסן צלחות העברה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש. הפרוטופלסט המבודד של עלי תירס אטיולטים יתווסף ללוח טרנספקציה זה בשלב 3.3.

2. בידוד פרוטופלסט עלי תירס אטיולטי.

  1. כדי להתחיל בבידוד של פרוטופלסט עלי תירס אטיולטים, השג רקע גנטי תואם פרוטופלסט כגון NP222 ששימש כאן18. הכן רק 3 מאגרים, כלומר מאגרי MMg, W5 ו-WI, המפורטים בטבלה 1 לפני תחילת הניסוי ושמור על 4 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת עיכול ו-PEG ביום הניסוי לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
  2. יש לעקר 25 זרעים על ידי טבילתם בתמיסת אקונומיקה מסחרית של 25% וניעורם על שייקר פלטפורמה סיבובית למשך כ-15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר התסיסה יש לשטוף היטב את הזרעים באמצעות מים סטריליים (DI). חזור על שלב השטיפה 5 פעמים. שתו את הזרעים במים סטריליים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  4. זרעו את הזרע על אדמה לחה וחיטוי למחרת. הוסף כדורי חרס יבשים כדי לנדף עודף לחות מהאדמה כדי למנוע זיהום פטרייתי.
  5. מגדלים את שתילי התירס בתא גידול קל של 16 שעות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס (לחות יחסית (לחות יחסית (30%) למשך כ -3 ימים עד שהקולאופטיל נמצא 1-2 ס"מ מעל האדמה ואז מעבירים לתא חשוך עם אותה טמפרטורה ו- RH למשך 5 - 7 ימים נוספים.
  6. קצרו את רקמת העלים האמיתית הראשונה על ידי חיתוך ממש מעל הצווארון הראשון.
  7. יש לעקר את רקמת העלים לזמן קצר ב-25% אקונומיקה מסחרית ו-250 מיקרוליטר של תמיסת 20% טווין 20 למשך דקה אחת. שוטפים היטב את חומר העלים פי 5 במי DI.
  8. יבשו (בעדינות) את רקמת עלה התירס עם רקמות נטולות מוך, ובעזרת להב חד הסירו ~1.5 ס"מ הן מהקצה והן מהבסיס של כל להב עלה.
  9. חותכים את רקמת העלים הנותרת לרצועות רוחביות צרות (0.5 מ"מ - 1 מ"מ) ומניחים בצלחת פטרי בגודל 100X25 מ"מ.
  10. יש לעקר 25 מ"ל מתמיסת העיכול דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ישירות לתוך צלחת הפטרי המכילה את הרקמה הפרוסה.
  11. ואקום חודר לרקמת העלים עם תמיסת עיכול על ידי הפעלת ואקום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במייבש ואקום בלחץ של כ-75 mbar.
    הערה: לחץ ואקום ביתי עבור מעבדות אקדמיות ופרטיות רבות אמור להספיק לשלב זה.
  12. מניחים על שייקר פלטפורמה סיבובית ומנערים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ב-60 סל"ד למשך 2.5 עד 3 שעות. כאשר נותרו 10 דקות לסוף תקופת העיכול, הגדל את המהירות ל 90 סל"ד.
  13. יוצקים את תמיסת העיכול וכל חומר צמחי לא מעוכל דרך משפך על גבי מסנן מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
  14. צנטריפוגה את התמיסה בתוך צינור 50 מ"ל ב-150 x גרם למשך 4 דקות כדי לגלול את הפרוטופלסט. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10 - 15 מ"ל של תמיסת חיץ MMg.
  15. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש במאגר MMg טרי של 5 - 10 מ"ל.
  16. בעזרת המוציטומטר, מדוד בזהירות את צפיפות הפרוטופלסט המבודד. השעיה לצפיפות משוערת של 5 x 105 פרוטופלסטים למ"ל.
  17. אפשר לבודד לנוח על קרח במשך ~30 דקות לפני הטרנספקציה. במהלך תקופה זו, הכינו את תמיסת ה-PEG. ממיסים לחלוטין PEG לתמיסה באמצעות אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותו שם עד לטרנספקציה.

3. טרנספקציה אוטומטית של פרוטופלסט

הערה: שלבים 3.6 עד 3.15 מנוהלים לחלוטין על ידי המטפל האוטומטי בנוזלים, למעט שתי הפסקות המשתמש בשלבים 3.10 ו-3.13, הדורשות צנטריפוגה ידנית. צילומי מסך רלוונטיים העוקבים אחר פרוטוקול אוטומטי זה ניתן למצוא בתוספת, איור משלים 1, איור משלים 3, איור משלים 4 ואיור משלים 5.

  1. הכן את פריסת הסיפון של המטפל בנוזלים להעברה בהתאם לשיטת העברת הפרוטופלסט המתוארת בשלבים הבאים. הרכיבו את החומרים הבאים: לוחית יעד (במקרה זה, תהיה שחורה של 96 בארות עם מיקרו-פלייט תחתון שקוף למדידת פלואורסצנטיות), קופסה אחת של 25 - 250 מיקרוליטר טיפים לאוטומציה רחבת קידוח לשלב שאיבת PEG, חמש קופסאות של 25 - 250 מיקרוליטר טיפים לאוטומציה של פיפטה עבור שלבי הטיפול בנוזלים הנותרים, שלוש שקתות פלסטיק כמאגרי ריאגנטים, צלחת ריקה אחת של 96 בארות לאיסוף פסולת, פתרונות שטיפת חיץ טרנספקציה שנותרו, W5 ו-WI.
  2. מיד לפני תחילת הליך ההעברה, יש לסנן את תמיסת ה-PEG דרך יחידת מסנן ואקום חד פעמית סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.
  3. מהפרוטופלסט המושעה מחדש במאגר MMg, הוסף 100 מיקרוליטר (כ -50,000 פרוטופלסט) לכל באר של צלחת הטרנספקציה המוכנה מראש ומופשרת. לשם כך, שפכו את תמיסת החיץ המכילה פרוטופלסט לשוקת סטרילית של 10 מ"ל והשתמשו בפיפטה רב ערוצית. המשך בתסיסה עדינה של השוקת כדי למנוע מהפרוטופלסט להתיישב מחוץ לתמיסה במהלך שלב העברה ידני זה.
  4. יוצקים את תמיסת ה-PEG לשוקת המתאימה ומניחים את לוחית הטרנספקציה, המכילה כעת פרוטופלסט ו-DNA פלסמיד המכיל לוחית טרנספקציה, שהוכנה באמצעות שלב 1, במיקום שצוין בהתאם לפריסת הסיפון.
  5. כדי ליצור שיטת טרנספקציה של פרוטופלסט, פתח את תוכנת המטפל בנוזלים ובצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. העברת כלי מעבדה בין חפיסות: החלף את תיבת הקצה הריקה בסיפון טעינת הקצה בחדשה באמצעות הפקודה Move Labware. בחר את החפיסות מ ו אל מהתצוגה תצורה .
    2. עבור נפחים גדולים מ-200 מיקרוליטר: אל תחליף את הקצוות בין ההעברות. עצות טעינה עבור שלב ההעברה הראשון ופריקה לאחר שלב ההעברה האחרון, מה שדורש לציין נכון את אפשרויות הטעינה/פריקה עבור כל שלב העברה כמו באיור משלים 3.
  6. יצירת פריסת סיפון: בדומה לשיטת יצירת לוחות הטרנספקציה, כדי ליצור שיטת טרנספקציה אוטומטית של DNA, פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים. לחץ על לחצן שיטה חדשה משורת התפריטים כדי ליצור שיטה חדשה. הוסף קו הגדרת מכשיר בין קווי ההתחלה והסיום על ידי לחיצה על לחצן הגדרת המכשיר בלוח השמאלי. צור פריסת סיפון בהתאם לפריסת הסיפון המוצגת באיור משלים 1.
  7. ערבוב תאים/DNA: הוסף שלב לערבוב פרוטופלסט ו-DNA לפני הוספת PEG באמצעות כפתור פעולת המכשיר והגדרת המכשיר (ניעור מיקום אוטומטי של תוכנת מעבדה או ALP), מהירות טלטול (1500 סל"ד) וזמן ניעור (10 שניות).
  8. תוספת וערבוב PEG: כדי להתחיל את הטרנספקציה, הוסף שלב העברה להוספת 110 מיקרוליטר של PEG ממאגר PEG באמצעות פיפט של 96 תרמילים. ודא שמיקומי המקור והיעד הנכונים מתוכנתים בהתאם לפריסת הסיפון שצוינה. תכנת את שלב ההעברה לשאוב PEG 1 מ"מ מתחתית המאגר ולהפקיד את ה-PEG 3 מ"מ מבסיס צלחת 96 הבארות המכילה את תערובת הפרוטופלסט/DNA. הוסף שלב טלטול נוסף לאחר הוספת PEG על ידי העתקה והדבקה של השלבים שתוכנתו בעבר.
  9. דגירה של PEG: הוסף שלב הפסקה על ידי בחירה בלחצן השהיה , בחר את השייקר והזן את זמן הדגירה שנקבע מראש, שמתחיל מתוספת PEG.
    הערה: שעון העצר של ההשהיה ימשיך אלא אם כן יהיו הפרעות או שיבושים בווילון האור שיגרמו להודעת שגיאה. ודא שאם יש צורך במניפולציה של החפיסה, הודעות אלה נמחקות לפני שאתה מתרחק.
  10. הוספה/ערבוב של מאגר W5: הוסף שלוש שורות העברה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר בסך הכל 600 מיקרוליטר של מאגר W5 ללוחית הטרנספקציה כדי להרוות את תגובת הדגירה של PEG. עקוב אחר הוספת המאגר W5 על ידי ניעור והפסקת משתמש כדי לאפשר צנטריפוגה של לוחית הטרנספקציה.
  11. השהיית משתמש 1: צנטריפוגה את לוחית הטרנספקציה של הפרוטופלסט ב-100 x גרם למשך 4 דקות. החזר את לוחית הטרנספקציה, כעת עם פרוטופלסט מגולגל, בחזרה למצב הסיפון המתאים. הוסף השהיית משתמש על-ידי לחיצה על לחצן השהה , אלא שכעת עם האפשרות השהה את המערכת כולה והצג את ההודעה שנבחרה.
    הערה: יש לנקות את החלון הקופץ של הודעת ההשהיה לפני שהמטפל בנוזלים ימשיך עם שאר הפרוטוקול.
  12. הסרת סופרנטנט: הוסיפו שתי שורות של העברה כדי להסיר 400 מיקרוליטר של סופרנטנט והעבירו לצלחת הפסולת. כדי למנוע שאיבת תאים במהלך הסרת סופרנטנט, הגדר את המרחק מהקרקעית כ-6 מ"מ.
  13. הוספה/ערבוב WI הוסף 3 קווי העברה כדי להעביר 580 מיקרוליטר של מאגר WI ללוחית הטרנספקציה. הוסף שלב טלטול נוסף לאחר הוספת WI על ידי העתקה והדבקה של השלבים שתוכנתו בעבר. המשך להשהיית המשתמש הבאה.
  14. הפסקת משתמש 2: צנטריפוגה את לוחית הטרנספקציה של הפרוטופלסט ב-100 x גרם למשך 4 דקות. החזר את לוחית הטרנספקציה, כעת עם פרוטופלסט מגולגל, בחזרה למצב הסיפון המתאים.
  15. הסרת סופרנטנט: הוסיפו ארבע שורות של העברה כדי להסיר 680 מיקרוליטר של סופרנטנט והעבירו לצלחת הפסולת. כדי למנוע שאיבת תאים במהלך הסרת סופרנטנט, הגדר את המרחק מהקרקעית כ-6 מ"מ.
  16. העברת פרוטופלסטים למיקרו-פלטה: ההעברה הסופית של פרוטוקול זה מורכבת משני שלבי העברה של 150 מיקרוליטר. לפני כל שלב בודד, שאפו שוב ושוב פרוטופלסטים ב-50 מיקרוליטר לשנייה ב-2 מ"מ מתחתית לוחית הטרנספקציה והוציאו ב-3 מ"מ. לאחר מכן, תוך שימוש באותם קצות פיפטה, העבירו למיקרו-פלטת היעד.
    הערה: שאיבה וחלוקה של נפח חיץ מעל הגלולה לפני ההעברה למיקרופלייט תפריע לכל הפרוטופלסטים שנותרו בתחתית לוחית הטרנספקציה כדי להבטיח שאין אובדן דגימה. מכיוון שהאקראיות נעשתה במהלך יצירת לוחית הטרנספקציה, זה מסכם את הפרוטוקול האוטומטי.
  17. דגרו את המיקרו-צלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 24 עד 48 שעות לפני מדידת הקרינה הראשונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להשיג נתונים תצפיתיים התומכים בכך שהשפעות קצה עשויות להשפיע על מדידות התגובה; מחקר פיילוט נערך כדי לאשר את החשדות הללו. עבור מחקר זה, השיטות לעיל יושמו על שלוש צלחות משוכפלות של 96 בארות עם רמת טיפול אחת בלבד; כל הפרוטופלסטים הועברו באמצעות pSYN1125019, פלסמיד המבטא באופן מכונן את ZsGreen, במטרה להראות שקיימים הבדלים שיטתיים ברמת התגובה ליחידות בקצה הצלחת בהשוואה לשורה השנייה, ואזורים מרכזיים של הצלחת. 36 הבארות בקצה החיצוני של הלוח מוגדרות כבלוק 1, 28 הבארות בשורה השנייה מהקצה כבלוק 2, ו-32 ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לאוטומציה של יצירת לוחות טרנספקציה ובידוד פרוטופלסט עלי תירס עם טרנספקציה אוטומטית. להשלמה מוצלחת של חלק יצירת לוחות הטרנספקציה של הפרוטוקול, הוא דורש רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים המצויד בתרמיל בעל 8 ערוצים. עבור פרוטוקול הטרנספקציה, מומלץ תרמיל של 96 בארות עבור טרנספקציה מלאה ואחידה של 96 בארות. ניתן להשלים את שיטת הטרנספקציה באמצעות תרמיל בעל 8 ערוצים, אך יש לקחת בחשבון במיוחד את משך הזמן שלוקח צעדי השאיפה והחלוקה, כמו גם את הזמן שניתן לייחס להחלפת טיפים בין עמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מועסקים על ידי סינג'נטה, חברת ביוטכנולוגיה חקלאית בינלאומית, המשתמשת באופן שגרתי בטכנולוגיית טרנספורמציה ליצירת מוצרים מהונדסים גנטית.

תודות

המחברים רוצים להודות למדענים הרבים בסינג'נטה שתומכים בעבודה הזו ולצוות שלנו מדי יום. יש להעניק הכרה מיוחדת למשפחה ולחברים שתמיכתם הבלתי נראית לעתים קרובות היא חיונית להמשך הצלחתו של צוות הבדיקה הארעית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(2)&בטא;-מרקפטואתנול SigmaM6250
2-(N-Morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES) מונוהידראטSigma69892
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל עם מכסה שטוח סטריליפישר22-010-064
96 באר אופטי Btm Plt פולימר בסיס שחור עם מכסה תרבית תאים סטרילית PS .4 מ"ל בארפישר12-566-70
Axygen Biomek FX / NX טיפים רובוטיים, לא סטריליים, פישר רחב משעמם14-222-096
Axygen Robotic Tips מסנן 30uL, סטרילי, מתלהפישר14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion מייבש ואקום בסגנון עגולפישר08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 רגל רול מעבדה Parafilm פישר13-374-16
Biomek FXPבקמן קולטר902508
סידן כלוריד דיהידראטסיגמאC5080
Chemglass מדעי החיים המוציטומטר חד פעמי פישר50-131-1352
אקונומיקה קוטל חיידקים קלורוקס,
קורנינג מיקרופלייט פישר07-200-684
קורנינג 96 בלוקים לבדיקת בארות, 2 מ"ל, 96 באר סטנדרטייםפישר07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
D-Mannitol סיגמאM9546
פישרברנד 60 מ"ל מזרק פלסטיקפישר14-955-461
פישרברנד מסננת תאים סטרילית 40umפישר22-363-547
פישרברנד צלחות פטרי עם מכסה שקוף, ניתן לערום, 100 מ"מ x 25 מ"מ, מארז של 325פישרFB0875711
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמאM2670
יחידת מסנן מונעת מזרק Millex סטרילית 33 מ"מ PES .22umפישרSLGPR33RS
יחידת מסנן מונעת מזרק Millex סטרילית 33 מ"מ PVDF.45umפישרSLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליות 50 מ"לPES פישרSCGP00525
פולי (אתילן גליקול) 4000 סיגמא81240
רדי-ארת' פלאג & תערובת שתילים Wyatt QuarlesGP92747
סכיני גילוח סכין גילוח בקצה יחיד בחזרה .009RDפישר12-640
מוצרי מחקר בינלאומיים Corp Cellulase RSפישר50-213-232
מוצרי מחקר בינלאומיים Corp Macerozyme R-10פישר50-213-444
נתרן כלוריסיגמאS7653
מגש פנימי - 36 תאים - 6x6 מקונן האמרט11635000
Tween-20 משאבת ואקום SigmaP1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 הרץ, תקע ארה"בVWR97058-164
סרט איטום אלומיניום מרוכז NC1871274

מקורות

  1. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Prog Mol Biol Transl Sci. 149, 1-26 (2017).
  2. Torres-Acosta, M. A., Lye, G. J., Dikicioglu, D. Automated liquid-handling operations for robust, resilient, and efficient bio-based laboratory practices. Biochem Eng J. 188, 108713(2022).
  3. Cocking, E. C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
  4. Genzen, J. R., et al. Challenges and opportunities in implementing total laboratory automation. Clin. Chem. 64 (2), 259-264 (2018).
  5. Reed, K. M., Bargmann, B. O. R. Protoplast regeneration and its use in new plant breeding technologies. Front Genome Ed. 3, 734951(2021).
  6. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  7. Yang, Y., et al. Synthetic promoter screening using Poplar mesophyll protoplast transformation. Bio Protoc. 13 (8), e4660(2023).
  8. Estes, S., Melville, M. Mammalian cell line developments in speed and efficiency. AdvBiochem Eng Biotechnol. 139, 11-33 (2014).
  9. Possee, R. D., et al. Generation of baculovirus vectors for the high-throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1115-1122 (2008).
  10. Xu, Y., et al. Protoplasts: small cells with big roles in plant biology. Trends Plant Sci. 27 (8), 828-829 (2022).
  11. Rigoulot, S. B., et al. Automated, high-throughput protoplast transfection for gene editing and transgene expression studies. Methods Mol Biol. 2653, 129-149 (2023).
  12. Occhialini, A., et al. High-throughput transfection and analysis of Soybean (Glycine max) protoplasts. Methods Mol Biol. 2464, 245-259 (2022).
  13. Lenaghan, S. C., Stewart, C. N. Jr An automated protoplast transformation system. Methods Mol Biol. 1917, 355-363 (2018).
  14. Gilliard, G., et al. Protoplast: A valuable toolbox to investigate plant stress perception and response. Front Plant Sci. 12, 749581(2021).
  15. Marx, V. Plants: A toolbox of cell-asbed assays. Nat. Methods. 13, 551-554 (2016).
  16. Mansoury, M., et al. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  17. Maxwell, C. B., et al. The edge effect in high-throughput proteomics: A cautionary tale. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (6), 1065-1072 (2023).
  18. Zhong, H., et al. Advances in Agrobacterium-mediated maize transformation. Methods Mol Biol. 1676, 41-59 (2018).
  19. Wenck, A., et al. Reef-coral proteins as visual, non-destructive reporters for plant transformation. Plant Cell Rep. 22 (4), 244-251 (2003).
  20. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jian, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physiol Plant. 36, 1271-1281 (2014).
  21. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149 (3), 1231-1239 (2009).
  22. Coy, M. R., Abbitt, S. E., Frank, M. J. Protoplast isolation and transfection in Maize. Methods Mol Biol. 2464, 91-104 (2022).
  23. Jessop-Fabre, M. M., Sonnenschein, N. Improving Reproducibility in Synthetic Biology. Front Bioeng Biotechnol. 7 (18), (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סריקה בספיקה גבוההבידוד פרוטופלסטיםטרנספקציית פרוטופלסטיםביוטכנולוגיה של צמחיםפלטת 96 בארותביטוי זמניהכנת פלסמיד

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.