פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר הקלטה מותאם אישית ובאלקטרודות כדי להקליט פוטנציאלים של שדות מקומיים ולחקור את זרימת המידע בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקלטות חוץ-תאיות כפולות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית
במאמר זה
סיכום
תקציר
הטכניקה של רישום פוטנציאלי שדה מקומי (LFPs) היא שיטה אלקטרופיזיולוגית המשמשת למדידת הפעילות החשמלית של אוכלוסיות נוירונים מקומיות. הוא משמש ככלי חיוני במחקר קוגניטיבי, במיוחד באזורים במוח כמו ההיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית. הקלטות LFP כפולות בין אזורים אלה מעניינות במיוחד מכיוון שהן מאפשרות לחקור תקשורת אותות בין-אזורית. עם זאת, שיטות לביצוע הקלטות אלה מתוארות רק לעתים רחוקות, ורוב מכשירי ההקלטה המסחריים יקרים או חסרי יכולת הסתגלות כדי להתאים לעיצובים ניסיוניים ספציפיים. מחקר זה מציג פרוטוקול מקיף לביצוע רישומי LFP כפולי אלקטרודות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית כדי לחקור את ההשפעות של תרופות אנטי-פסיכוטיות ומודולטורים של תעלות אשלגן על תכונות LFP באזורים אלה. הטכניקה מאפשרת מדידה של תכונות LFP, כולל ספקטרום כוח בתוך כל אזור במוח וקוהרנטיות בין השניים. בנוסף, פותח מכשיר הקלטה בעלות נמוכה ומותאם אישית עבור ניסויים אלה. לסיכום, פרוטוקול זה מספק אמצעי להקליט אותות עם יחסי אות לרעש גבוהים באזורים שונים במוח, מה שמקל על חקירת תקשורת מידע בין-אזורית בתוך המוח.
מבוא
פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) מתייחסים לפעילות החשמלית שנרשמה מהמרחב החוץ-תאי, ומשקפים את הפעילות הקולקטיבית של קבוצה מקומית של נוירונים. הם מציגים מגוון רחב של תדרים, החל מגלים איטיים ב-1 הרץ ועד תנודות מהירות ב-100 הרץ או 200 הרץ. פסי תדרים ספציפיים נקשרו לתפקודים קוגניטיביים כגון למידה, זיכרון וקבלת החלטות 1,2. שינויים בתכונות LFP שימשו כסמנים ביולוגיים להפרעות נוירולוגיות שונות, כולל דמנציה וסכיזופרניה 3,4. ניתוח הקלטות LFP יכול להציע תובנות חשובות לגבי המנגנונים הפתולוגיים הבסיסיים הקשורים למצבים אלה ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
רישום LFP כפול הוא טכניקה המשמשת למדידת פעילות חשמלית מקומית בתוך ובין שני אזורי מוח ספציפיים. טכניקה זו מספקת הזדמנות רבת ערך לחקור את הדינמיקה העצבית המורכבת ואת תקשורת האותות המתרחשת בתוך ובין אזורי מוח שונים. מחקרים קודמים גילו כי זיהוי שינויים בתכונות העצביות של אזורי מוח בודדים יכול להיות מורכב, אך שינויים בתקשורת קליפת המוח הבין-אזורית ניתן לראות 5,6. לכן, השימוש בהקלטת LFP כפולה מציע אמצעי רב עוצמה לטיפול בבעיה זו.
קישוריות היפוקמפוסית-קדם-מצחית ממלאת תפקיד מכריע בוויסות תפקודים קוגניטיביים, ותפקוד לקוי נקשר להפרעות נוירולוגיות שונות 7,8. הקלטות אלקטרודות כפולות של אזורים אלה יכולות לספק מידע על אינטראקציות אלה. למרבה הצער, קיים מידע מוגבל זמין על שיטות לביצוע רישומי אלקטרודה כפולה LFP בין אזורים אלה. יתר על כן, מכשירי הקלטה הזמינים מסחרית הם בדרך כלל יקרים וחסרי יכולת הסתגלות לעיצובים ניסיוניים ספציפיים. השיטה המקובלת להקלטת LFPs כוללת שימוש בכבל מסוכך לחיבור מכשיר ההקלטה לאלקטרודות שהושתלו במוחו של בעל חיים. עם זאת, גישה זו רגישה לתנועה ולרעשים סביבתיים, ומשפיעה על האיכות והאמינות של האותות המוקלטים.
פרוטוקול זה מתאר הליך מקיף לביצוע הקלטות LFP כפולות אלקטרודות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית, באמצעות במת ראש מותאמת אישית בעלות נמוכה שניתן להניח על ראשה של החיה. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לחקור דפוסי תנודה ספציפיים לאזור בתוך שני אזורים מוחיים נפרדים ולחקור חילופי מידע בין-אזוריים וקישוריות בין אזורים אלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים פלורי (אוניברסיטת מלבורן, מס '22-025UM) בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. C57BL/6 עכברים זכרים (8 שבועות), שהתקבלו ממרכז משאבי בעלי חיים (אוסטרליה), שימשו במחקר הנוכחי.
1. עיצוב וייצור במת ראש
הערה: לוח המעגלים המודפסים של שלב הראש הוא לוח ארבע שכבות קומפקטי בגודל 14 מ"מ x 12 מ"מ המיועד להצבה ישירות על ראש החיה. הוא משתמש בשבב מגבר מסחרי (ראה טבלת חומרים), וכל קבצי העיצוב ו- Gerber זמינים באינטרנט (קישור GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- ספק את המפרטים הבאים ליצרן: עובי לוח: 0.6 מ"מ; מעקב/ריווח מינימלי: 4 מיל; גודל חור מינימלי: 0.2 מ"מ.
- במהלך תהליך הרכבת המעגלים המודפסים, בצע את הסדר הבא:
- הלחמת את שבב המגבר על הלוח באמצעות אקדח אוויר חם להגדיר ב 350 ° C.
- לרתך את הרכיבים הפסיביים.
- הלחמת את מחבר SPI ואת מחבר האלקטרודה (ראה טבלת חומרים).
- בדקו את ההלחמה תחת מיקרוסקופ להבטחת איכות. אבטח את מחבר SPI במקומו באמצעות אפוקסי ליציבות נוספת.
- השתמש בתוכנת הקלטה של צד שלישי ובלוח בקרה (ראה טבלת חומרים) לרכישת אותות. עיין במדריך למשתמש של התוכנה לקבלת הוראות מפורטות.
- במת הראש המעוצבת תומכת ב-8 ערוצים. בתוכנה, הפעל את ערוצים 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 ו- 23 להקלטה.
2. ייצור אלקטרודות
- חתכו חוטי טונגסטן מצופים PFA (ראו טבלת חומרים) לאורכים ספציפיים עבור סוגי אלקטרודות שונים: אלקטרודת קליפת המוח הקדם-מצחית (12 מ"מ), אלקטרודת היפוקמפוס (10 מ"מ) ואלקטרודת הארקה (6 מ"מ).
- חותכים את צינור הפליז (ראו טבלת חומרים) למקטעים בקוטר 3 מ"מ.
- הסירו 2 מ"מ מהציפוי בקצה כל חוט באמצעות מצית, ולאחר מכן הלחכו היטב את חוט האלקטרודה לצינור הפליז. לצינור הפליז קוטר פנימי של 0.45 מ"מ וקוטר חיצוני של 0.60 מ"מ.
- עבור אלקטרודת הארקה, הלחמת בורג נירוסטה M1.2 (ראה טבלת חומרים) לאלקטרודה. יש למרוח שטף על בסיס חומצה זרחתית על הבורג כדי לשפר את ההלחמה. לאחר ההלחמה, נקו את הבורג באמצעות אלכוהול.
הערה: יש ללבוש כפפות להגנה במהלך תהליך ההלחמה.
3. הליך כירורגי
- מרדימים את העכבר בתא הרדמה עם 3% איזופלורן וזרימת חמצן של ליטר אחד לדקה.
- הניחו את העכבר המורדם על כרית חימום ואבטחו אותו במסגרת סטריאוטקסית (ראו טבלת חומרים).
- התאם את קצב התחזוקה של איזופלורן ל 2.5-3% והפחת את זרימת החמצן ל -500 מ"ל / דקה. באמצעות צביטת הבוהן, ודא אם בעל החיים עדיין תחת הרדמה עמוקה.
- תת עורית להזריק carprofen ב 0.5 מ"ג / ק"ג ולמרוח משחת עיניים להגנה על העין.
- לגלח ולעקר את ראש העכבר באמצעות פובידון-יוד ו 80% אתנול.
- בצע חתך 8 מ"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת, הסרת רקמת חיבור באזור החתך.
- החל מי חמצן כדי לנקות את פני השטח של הגולגולת, להיות זהיר לא לגעת בעור שמסביב.
- יישרו את ציוני הדרך של ברגמה ולמבדה לאותה רמה לקבלת מיקום אלקטרודות מדויק (ברגמה ולמבדה הם המקום שבו התפר הסגיטלי מצטלב בין התפרים הקורונליים והלמבדואידים).
- חורי קידוח עבור אלקטרודת ייחוס/הארקה, ברגי עיגון (בור קידוח 0.9 מ"מ) ואלקטרודות פעילות (בור קידוח 0.3 מ"מ) בקואורדינטות שצוינו.
- חבר את האלקטרודה המותאמת אישית (שלב 2) לזרוע המסגרת הסטריאוטקסית וודא שהיא ניצבת למוח.
- השתיל את האלקטרודה באזור CA1 בהיפוקמפוס (AP - 1.8 מ"מ, ML - 1.3 מ"מ, DV - 1.4 מ"מ).
הערה: AP, anteroposterior; ML, בינוני; DV, dorsoventral. - השתלת אלקטרודות חוזרת בקליפת המוח הקדם-מצחית (AP - 2.0 מ"מ, ML - 0.3 מ"מ, DV - 1.7 מ"מ).
- אבטחו אלקטרודות עם דבק עוצמתי ומלט דנטלי זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים).
- השתל שני ברגי עיגון בקוטר 1.2 מ"מ (AP - 1.8 מ"מ, ML -1.6 מ"מ) למניעת תזוזה.
- מקם את אלקטרודת הייחוס/הארקה במגע ישיר עם הדורה מאטר, 2 מ"מ אחורי ו-2 מ"מ חד צדדי לנקודת ציון הלמדא.
- חבר את צד צינור הפליז של האלקטרודות למחבר שקע רב-ערוצי (ראה טבלת חומרים) עם אלקטרודת הארקה באמצע.
- השתמש בצינורות כיווץ חום 0.8 מ"מ בחלק החיצוני של הסיכה האמצעית לבידוד.
- אבטח את האלקטרודות, ברגי העוגן והמחבר באמצעות דבק וצמנט דנטלי.
4. טיפול לאחר הניתוח
- כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח, יש להזריק קרפרופן במינון של 5-10 מ"ג/ק"ג תת עורית כל 12-24 שעות בהתבסס על הערכת כאב לתקופה של שלושה ימים.
- ספק לבעל החיים תקופת החלמה של שבוע לפני תחילת כל הליך הקלטה או ניסוי.
5. הליך הקלטה
- טפל בבעל החיים במשך 15 דקות, פעמיים ביום, במשך שלושה ימים רצופים.
- הרימו את העכברים על ידי סגירה עדינה של היד סביבם מבלי להפעיל לחץ מוגזם.
- הניחו את לוח הבמה על ראשו של בעל החיים למשך 30 דקות פעם ביום במשך שלושה ימים רצופים.
- ביום ההקלטה יש להרגיל את החיה לחדר ההקלטות למשך 30 דקות.
- הניחו את בעל החיים בתא הקלטה קטן בתוך כלוב פאראדיי כדי להפחית הפרעות חשמליות חיצוניות. צרף את במת הראש המותאמת אישית להקלטה.
- פתח את תוכנת ההקלטה ובחר קצב דגימה של 2.00 קילוהרץ. השבת את כל הערוצים, למעט 13 ו- 20, על-ידי בחירת כל ערוץ והקשה על מקש הרווח.
- בחלון רוחב הפס של החומרה, הגדר את רוחב הפס התחתון ל- 2 הרץ ואת רוחב הפס העליון ל- 100 הרץ.
- בחלון סינון התוכנה, התאם את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ ואת מסנן המעבר הגבוה ל- 2 הרץ.
- בחר את נתיב האחסון על-ידי לחיצה על בחר שם קובץ ולאחר מכן לחץ על רשומה.
- התחל כל סשן הקלטה עם תקופת הרגלה של 10 דקות ואחריה הקלטת EEG בסיסית של 15 דקות.
- לאחר ההקלטה הבסיסית, יש לתת את התרופה באמצעות הזרקה תוך צפקית ולהמשיך בהקלטה במשך 30 דקות נוספות ללא דיחוי.
הערה: עיין בסעיף התוצאות לקבלת פרטים על התרופות שבהן נעשה שימוש.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות המוצגות כאן מדגימות את ההשפעות של מספר תרופות על תכונות פוטנציאלי שדה מקומי (LFPs) שנבדקו בארבע קבוצות של עכברים זכרים C57BL/6 (n = 8 עבור כל עוקבה; גיל: 8 שבועות; משקל: 24.0 ± 0.42 גרם). התרופות שנבדקו כללו את התרופה האנטי פסיכוטית קלוזאפין, מודולטורים של תעלת אשלגן 4-אמינופירידין (4-AP) ורטיגבין, כמו גם את מי המלח של רכב הבקרה.
כפי שניתן לראות באיור 1, העכבר הונח בתא הקלטה קטן ו-LFPs נאספו מההיפוקמפוס (HIP) ומקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) באמצעות במת ראש ש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליך לבניית במת ראש מותאמת אישית שתוכננה במיוחד להקלטה סימולטנית של פוטנציאלי שדה מקומיים כפולים (LFPs) בהיפוקמפוס (HIP) ובקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC). השלבים המפורטים המפורטים בפרוטוקול זה מציעים מידע מספיק לחוקרים כדי לבחון ביסודיות את תקשורת האותות הן בתוך כל אזור והן בין HIP ו- PFC.
שלב הראש שעוצב בהתאמה אישית משתמש בשבב מגבר מסחרי. בעוד שהתצורה הנוכחית תומכת בהקלטה של 8 ערוצים, ניתן להתאים בקלות את במת הראש כך שתתאים לקיבולת המלאה של 32 ערוצים, ובכך לספק פוטנצ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המלכותית למדעי המוח של בית החולים מלבורן (A2087).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שפופרת פליז | סגסוגות אלביון, ארה"ב | קוטר פנימי של 0.45 מ"מ | |
| קרפרופן | רימדיל, פייזר בריאות בעלי חיים | ||
| שבב מגבר מסחרי | Intantech | RHD 2132 | |
| לוח בקרה | Intantech | RHD מלט | |
| שיניים | Paladur | ||
| Heat מתכווץ | Panduit | קוטר | |
| M1.2 בורג נירוסטה | שעון | בורג שעון ושעון | |
| מחבר שקע רב ערוצי | Harwin, AU | 1.27 מ"מ פסיעה, שקע | |
| חוטי טונגסטן מצופים PFA | א-מ מערכות, ארה"ב | קוטר פנימי של 150 ומיקרו; מ | |
| שטף מבוסס חומצה זרחתית | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| תוכנת הקלטה | Intantech | RHX תוכנת | |
| מסגרת סטריאוטקטית World | Precision Instruments | עכבר מכשיר | |
| דבק סופר | UHU | מהיר במיוחד |
מקורות
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190(2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572(2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
