פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר הקלטה מותאם אישית ובאלקטרודות כדי להקליט פוטנציאלים של שדות מקומיים ולחקור את זרימת המידע בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית.
מאמר שיטה
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר הקלטה מותאם אישית ובאלקטרודות כדי להקליט פוטנציאלים של שדות מקומיים ולחקור את זרימת המידע בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית.
הטכניקה של רישום פוטנציאלי שדה מקומי (LFPs) היא שיטה אלקטרופיזיולוגית המשמשת למדידת הפעילות החשמלית של אוכלוסיות נוירונים מקומיות. הוא משמש ככלי חיוני במחקר קוגניטיבי, במיוחד באזורים במוח כמו ההיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית. הקלטות LFP כפולות בין אזורים אלה מעניינות במיוחד מכיוון שהן מאפשרות לחקור תקשורת אותות בין-אזורית. עם זאת, שיטות לביצוע הקלטות אלה מתוארות רק לעתים רחוקות, ורוב מכשירי ההקלטה המסחריים יקרים או חסרי יכולת הסתגלות כדי להתאים לעיצובים ניסיוניים ספציפיים. מחקר זה מציג פרוטוקול מקיף לביצוע רישומי LFP כפולי אלקטרודות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית כדי לחקור את ההשפעות של תרופות אנטי-פסיכוטיות ומודולטורים של תעלות אשלגן על תכונות LFP באזורים אלה. הטכניקה מאפשרת מדידה של תכונות LFP, כולל ספקטרום כוח בתוך כל אזור במוח וקוהרנטיות בין השניים. בנוסף, פותח מכשיר הקלטה בעלות נמוכה ומותאם אישית עבור ניסויים אלה. לסיכום, פרוטוקול זה מספק אמצעי להקליט אותות עם יחסי אות לרעש גבוהים באזורים שונים במוח, מה שמקל על חקירת תקשורת מידע בין-אזורית בתוך המוח.
פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) מתייחסים לפעילות החשמלית שנרשמה מהמרחב החוץ-תאי, ומשקפים את הפעילות הקולקטיבית של קבוצה מקומית של נוירונים. הם מציגים מגוון רחב של תדרים, החל מגלים איטיים ב-1 הרץ ועד תנודות מהירות ב-100 הרץ או 200 הרץ. פסי תדרים ספציפיים נקשרו לתפקודים קוגניטיביים כגון למידה, זיכרון וקבלת החלטות 1,2. שינויים בתכונות LFP שימשו כסמנים ביולוגיים להפרעות נוירולוגיות שונות, כולל דמנציה וסכיזופרניה 3,4. ניתוח הקלטות LFP יכול להציע תובנות חשובות לגבי המנגנונים הפתולוגיים הבסיסיים הקשורים למצבים אלה ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
רישום LFP כפול הוא טכניקה המשמשת למדידת פעילות חשמלית מקומית בתוך ובין שני אזורי מוח ספציפיים. טכניקה זו מספקת הזדמנות רבת ערך לחקור את הדינמיקה העצבית המורכבת ואת תקשורת האותות המתרחשת בתוך ובין אזורי מוח שונים. מחקרים קודמים גילו כי זיהוי שינויים בתכונות העצביות של אזורי מוח בודדים יכול להיות מורכב, אך שינויים בתקשורת קליפת המוח הבין-אזורית ניתן לראות 5,6. לכן, השימוש בהקלטת LFP כפולה מציע אמצעי רב עוצמה לטיפול בבעיה זו.
קישוריות היפוקמפוסית-קדם-מצחית ממלאת תפקיד מכריע בוויסות תפקודים קוגניטיביים, ותפקוד לקוי נקשר להפרעות נוירולוגיות שונות 7,8. הקלטות אלקטרודות כפולות של אזורים אלה יכולות לספק מידע על אינטראקציות אלה. למרבה הצער, קיים מידע מוגבל זמין על שיטות לביצוע רישומי אלקטרודה כפולה LFP בין אזורים אלה. יתר על כן, מכשירי הקלטה הזמינים מסחרית הם בדרך כלל יקרים וחסרי יכולת הסתגלות לעיצובים ניסיוניים ספציפיים. השיטה המקובלת להקלטת LFPs כוללת שימוש בכבל מסוכך לחיבור מכשיר ההקלטה לאלקטרודות שהושתלו במוחו של בעל חיים. עם זאת, גישה זו רגישה לתנועה ולרעשים סביבתיים, ומשפיעה על האיכות והאמינות של האותות המוקלטים.
פרוטוקול זה מתאר הליך מקיף לביצוע הקלטות LFP כפולות אלקטרודות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית, באמצעות במת ראש מותאמת אישית בעלות נמוכה שניתן להניח על ראשה של החיה. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לחקור דפוסי תנודה ספציפיים לאזור בתוך שני אזורים מוחיים נפרדים ולחקור חילופי מידע בין-אזוריים וקישוריות בין אזורים אלה.
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים פלורי (אוניברסיטת מלבורן, מס '22-025UM) בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. C57BL/6 עכברים זכרים (8 שבועות), שהתקבלו ממרכז משאבי בעלי חיים (אוסטרליה), שימשו במחקר הנוכחי.
1. עיצוב וייצור במת ראש
הערה: לוח המעגלים המודפסים של שלב הראש הוא לוח ארבע שכבות קומפקטי בגודל 14 מ"מ x 12 מ"מ המיועד להצבה ישירות על ראש החיה. הוא משתמש בשבב מגבר מסחרי (ראה טבלת חומרים), וכל קבצי העיצוב ו- Gerber זמינים באינטרנט (קישור GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
2. ייצור אלקטרודות
3. הליך כירורגי
4. טיפול לאחר הניתוח
5. הליך הקלטה
התוצאות המוצגות כאן מדגימות את ההשפעות של מספר תרופות על תכונות פוטנציאלי שדה מקומי (LFPs) שנבדקו בארבע קבוצות של עכברים זכרים C57BL/6 (n = 8 עבור כל עוקבה; גיל: 8 שבועות; משקל: 24.0 ± 0.42 גרם). התרופות שנבדקו כללו את התרופה האנטי פסיכוטית קלוזאפין, מודולטורים של תעלת אשלגן 4-אמינופירידין (4-AP) ורטיגבין, כמו גם את מי המלח של רכב הבקרה.
כפי שניתן לראות באיור 1, העכבר הונח בתא הקלטה קטן ו-LFPs נאספו מההיפוקמפוס (HIP) ומקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) באמצעות במת ראש שעוצבה בהתאמה אישית. מכיוון שמחקר זה התמקד בעיקר בבחינת תחומי התדרים תטא וגמא, האות המוקלט עבר תחילה סינון פסים ראשוני בטווח תדרים של 2-100 הרץ, ולאחר מכן דגימה בתדר 2000 הרץ. לאחר מכן חולק האות למספר תקופות של 2 שניות. כל התקופות המציגות תוצרי תנועה בולטים זוהו ולאחר מכן הוצאו מתהליכי הניתוח הבאים. ספקטרום ההספק של LFPs הן ב-HIP והן ב-PFC, כמו גם בקוהרנטיות HIP-PFC, נמדדו באמצעות שיטת ניתוח רב-חדנית9. הניתוח השתמש בחמישה טייפרים סלפיים, ורוחב הפס של הזמן הוגדר לשלושה כדי להשיג את הריכוז הספקטרלי האופטימלי. חלון הזזה של 1 שניות וגודל צעד של 100 מילישניות שימשו ליצירת ספקטוגרמות זמן-תדר ומסלול הזמן של קוהרנטיות HIP-PFC.
כפי שניתן לראות באיור 2 ובאיור 3, מתן מי מלח לא יצר השפעות ניכרות על ספקטרום ההספק של LFPs ב-HIP וב-PFC, וגם לא על הקוהרנטיות של HIP-PFC. הן רטיגבין והן קלוזאפין הדגימו הפחתה ברורה בעוצמת פס הגמא (30-100 הרץ) ב-HIP וב-PFC, כמו גם בקוהרנטיות של פס הגמא HIP-PFC. לעומת זאת, 4-AP הציג השפעות הפוכות, המאופיינות בעוצמת פס גמא משופרת ב-HIP וב-PFC, יחד עם קוהרנטיות מוגברת בתוך רצועת הגמא בין HIP ל-PFC.

איור 1: סכמטיות של מערך הניסוי. אלקטרודות הושתלו בהיפוקמפוס (HIP) ובקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) לרישום פוטנציאלי שדה מקומיים. החיה הונחה בתא הקלטה קטן, ובמת ראש מעוצבת במיוחד חוברה למחבר האלקטרודה. כל סשן הקלטה החל בסשן בסיסי של 10 דקות, ואחריו סשן סמים של 30 דקות. נבדקו ההשפעות של מלוחים, קלוזאפין, 4-AP ורטיגאבין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ההשפעה של תרופות אנטי-פסיכוטיות ומודולטורים של תעלות אשלגן על הפעילות האלקטרופיזיולוגית המתמשכת בהיפוקמפוס (HIP) ובקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC). הספקטוגרמה המנורמלת של פוטנציאלי השדה המקומיים ב-HIP וב-PFC, יחד עם הקוהרנטיות של HIP-PFC, הציגה השפעות תלויות זמן עבור כל התרופות שנחקרו. התרופות ניתנו באמצעות הזרקה תוך צפקית בזמן t = 15 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ההשפעה של תרופות אנטי-פסיכוטיות ומודולטורים של תעלות אשלגן על צפיפות ספקטרום ההספק ב-HIP וב-PFC. 4-AP שיפר באופן משמעותי את עוצמת פס הגמא בשני אזורי המוח, בעוד שקלוזאפין ורטיגבין דיכאו את עוצמת פס הגמא בשני האזורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליך לבניית במת ראש מותאמת אישית שתוכננה במיוחד להקלטה סימולטנית של פוטנציאלי שדה מקומיים כפולים (LFPs) בהיפוקמפוס (HIP) ובקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC). השלבים המפורטים המפורטים בפרוטוקול זה מציעים מידע מספיק לחוקרים כדי לבחון ביסודיות את תקשורת האותות הן בתוך כל אזור והן בין HIP ו- PFC.
שלב הראש שעוצב בהתאמה אישית משתמש בשבב מגבר מסחרי. בעוד שהתצורה הנוכחית תומכת בהקלטה של 8 ערוצים, ניתן להתאים בקלות את במת הראש כך שתתאים לקיבולת המלאה של 32 ערוצים, ובכך לספק פוטנציאל לקיבולת ערוץ מורחבת המתאימה להקלטת מערך אלקטרודות. בהתחשב בעלות הנמוכה של במת הראש, אפשרות אחת היא להצמיד את הלוח לצמיתות לראש החיה. גישה זו מציעה את היתרון של מזעור ארטיפקטים תנועתיים והפחתת רמת ההפרעה הכוללת הנגרמת על ידי תנועה.
האלקטרודה בהתאמה אישית מדגימה הקלטה יציבה לטווח ארוך של LFPs, תוך שמירה על איכות אות טובה לאורך 3-5 חודשים. גישה מעשית נוספת כוללת שימוש במעגלים גמישים מבוססי פולימיד כמערכי אלקטרודות10,11. ניתן לשלב מעגלים גמישים אלה עם ראש ההקלטה כדי לאפשר הקלטה רב-ערוצית. שיטה זו מספקת את היתרון של פישוט הכנת אלקטרודות והליכים כירורגיים. משקל השתל עם ובלי הראש קל מאוד, 0.198 גרם ו-0.812 גרם, בהתאמה, מה שהופך אותו מתאים לעכברים צעירים מאוד.
מגבלה אחת של טכניקת ההקלטה הנוכחית היא ההפרעה הפוטנציאלית הנגרמת על ידי הכבל התלוי, אשר עלולה להפריע להתנהגות הטבעית של בעל החיים במהלך ניסויים. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן לשקול פתרונות חלופיים כגון שימוש בכרטיס SD לאחסון נתונים או יישום מודול משדר אותות אלחוטי.
שלב חיוני וקריטי של הפרוטוקול כרוך במיקום מדויק של האלקטרודה. חיוני להבטיח מיקום אלקטרודות מדויק ועקבי כדי לאפשר השוואה בין ניסויים. כדי לאמת את מיקום האלקטרודה, יש לבצע היסטולוגיה12. טכניקה שימושית לשיפור מיקום אלקטרודה תקין ב- HPC היא להקליט בזמן שהאלקטרודה מוחדרת אנכית, שכן מקצבי תטא חזקים וירי עצבי יצביעו על מיקום נכון. מומלץ להשתמש בעכברים בוגרים מעל גיל 8 שבועות, מכיוון שאיכות האות עלולה לרדת עם הזמן או לגרום למיקום שגוי ככל שהעכברים מזדקנים. התחשבות בשיקולים אלה תסייע לשמור על אמינות ותוקפן של תוצאות הניסוי.
לסיכום, הפרוטוקול המוצג במאמר זה מספק מסגרת לחקר תקשורת האותות בין אזורי מוח שונים. הוא מאפשר לחוקרים לחקור את הדינמיקה העצבית ואת האינטראקציות בתוך ובין אזורים אלה.
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המלכותית למדעי המוח של בית החולים מלבורן (A2087).
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שפופרת פליז | סגסוגות אלביון, ארה"ב | קוטר פנימי של 0.45 מ"מ | |
| קרפרופן | רימדיל, פייזר בריאות בעלי חיים | ||
| שבב מגבר מסחרי | Intantech | RHD 2132 | |
| לוח בקרה | Intantech | RHD מלט | |
| שיניים | Paladur | ||
| Heat מתכווץ | Panduit | קוטר | |
| M1.2 בורג נירוסטה | שעון | בורג שעון ושעון | |
| מחבר שקע רב ערוצי | Harwin, AU | 1.27 מ"מ פסיעה, שקע | |
| חוטי טונגסטן מצופים PFA | א-מ מערכות, ארה"ב | קוטר פנימי של 150 ומיקרו; מ | |
| שטף מבוסס חומצה זרחתית | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| תוכנת הקלטה | Intantech | RHX תוכנת | |
| מסגרת סטריאוטקטית World | Precision Instruments | עכבר מכשיר | |
| דבק סופר | UHU | מהיר במיוחד |