הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף מתגלה כמערכת מודל בעלת יכולת טיפול גבוהה כדי לחקור את הרגולציה של תאי גזע אפיתל ומזנכימליים בוגרים והתחדשות שיניים. אוכלוסיות אבות אלה מחולקות, נעות ומתמיינות באופן פעיל כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות ולחדש תאים אבודים באופן מגיב. עם זאת, ניתוחים מסורתיים באמצעות קטעי רקמות קבועים לא יכלו ללכוד את התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות, מה שהגביל את יכולתנו לחקור את התקנות שלהם. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשמירה על חותכות עכבר שלמות במערכת תרבית אקספלנט ותאי אפיתל דנטליים במסלול חי באמצעות מיקרוסקופ קיטוע זמן מולטיפוטון. טכניקה זו מוסיפה לארגז הכלים הקיים שלנו למחקר דנטלי ומאפשרת לחוקרים לרכוש מידע מרחבי-זמני על התנהגויות תאים וארגונים ברקמה חיה. אנו צופים כי מתודולוגיה זו תסייע לחוקרים להמשיך ולחקור מנגנונים השולטים בתהליכים התאיים הדינמיים המתרחשים הן במהלך חידוש השיניים והן במהלך התחדשותן.
מבוא
במהלך שני העשורים האחרונים, החותכת לעכבר התפתחה כפלטפורמה רבת ערך לחקר עקרונות ויסות תאי גזע בוגרים והתחדשות שיניים 1,2. החותכת לעכבר גדלה ברציפות ומתחדשת לאורך כל חיי החיה. הוא עושה זאת על ידי שמירה על תאי גזע אפיתל ומזנכימליים, אשר יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים של השן 1,2. בעוד שתאי גזע אפיתליאליים דנטליים מולידים אמלובלסטים, המפרישים את מטריצת האמייל, תאי גזע מזנכימליים דנטליים מולידים אודונטובלסטים, צמנטובלסטים ופיברובלסטים, היוצרים דנטין, צמנטום ורצועה חניכית, בהתאמה 3,4,5,6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העכברים הוחזקו במתקנים נטולי פתוגנים של בעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA) או באוניברסיטה העברית בירושלים (HUJI). כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם לתקנות ולפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) או (MD-23-17184-3; הוג'י). זרימת עבודה כללית של שלבי הניסוי מוצגת באיור 2A. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל המכשירים, הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת פתרונות וג'לים
- אמצעי דיסקציה: הכינו DMEM/F12 טרי עם 0.5% גלוקוז ושמרו אותו חם בטמפרטורה של 37°C עד לצורך בשלב 2.4.
הערה: אנו ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האזור האפי של חותכת העכבר הבוגר עטוף בתוך הלסת התחתונה (איור 1) ולכן אינו נגיש ישירות להדמיה ולמעקב חי אחר תאי האב השוכנים באזור הגדילה. לכן, פיתחנו שיטה לחלץ את כל החותכת מעצם הלסת ולתחזק אותה במערכת תרבית אקספלנט עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר של שני פוטונים (איור 2). כאן אנו מתארים תוצאות מייצגות הלוכדות את התהליך הדינמי של התפשטות תאים ותנועה באזור הלולאה הצווארית של אפיתל השיניים.
כדי להדגים את ההליכים הניסיוניים, השתמשנו בשני מודלים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיית רקמות חיות היא טכניקה חשובה המאפשרת לנו לחקור את התהליכים וההתנהגויות הדינמיים של תאים כאשר הם נשמרים בסביבת הנישה שלהם41. באופן אידיאלי, הדמיה חיה מבוצעת in vivo עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. עם זאת, הדמיה in vivo עבור איברים יונקים יכול להיות מאתגר בשל חוסר נגישות רקמות, אטימות אופטית, וקושי לשתק את החיה או את האיבר לתקופה ממושכת42. צמחי רקמות עוקפים חלק מהאתגרים הללו ואומצו בהצלחה במספר מחקרים למעקב אחר התנהגויות תאים, כגון במהלך מורפוגנזה של ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים למעבדה המתקדמת למיקרוסקופיית אור/ספקטרוסקופיה של UCLA ולמרכז המצוינות של Leica Microsystems במכון הננו-מערכות של קליפורניה (RRID:SCR_022789) על אספקת מיקרוסקופ שני פוטונים. AS נתמך על ידי ISF 604-21 מהקרן הלאומית למדע. JH נתמך על ידי R03DE030205 R01DE030471 מה-NIH/NIDCR. AS ו-JH נתמכו גם על ידי 2021007 מענקים מהקרן הדו-לאומית למדע ארה"ב-ישראל (BSF).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 24 באר, צלחת תרבית רקמות תחתונה שטוחה | פלסטיק אולימפוס | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR מטרת טבילה במים | Leica | 11507704 | |
| חומצה אסקורבית (ויטמין C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-גלוקוז bioxtra | מערכת סיגמא אולדריץ' | G7528 | |
| דלתא T | Bioptechs | 0420-4 | כולל בקרת טמפרטורה, כלי תרבית והגדרת זלוף |
| מיקרוסקופ דיסקציה- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | מדיה בזאלית ללא פנול |
| אדום להב כירורגי נוצה (#15) | נוצה | 72044-15 | |
| מלקחיים עדינים | FST | 11252-23 | |
| גלוטמקס | Thermo Scientific | 35050-061 | תחליף גלוטמין |
| Leica SP8-DIVE מצויד במטרת טבילה במים 25X HC IRAPO motCORR | Leica | n/a | |
| NuSieve | 50080 | בהתכה נמוכה | |
| (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| פניצילין– סטרפטומיצין | תרמו סיינטיפיק | 15140122 | 10,000 יח'/מ"ל |
| צלחת פטרי | Gen Clone | 32-107G | 90 מ"מ |
| סרום | עכברושים עמק AS3061SC ביו-רפואי | מעובד להדמיה חיה | |
| סכין גילוח #9 | VWR | 55411-050 | |
| ידית אזמל | FST | 10003-12 | |
| מספריים | FST | 37133 | |
| מלקחיים משוננים | FST | 11000-13 | |
| מספריים קפיציים | FST | 91500-09 |
מקורות
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Ro....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
