Method Article

שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום

DOI:

10.3791/66021

⸱

January 26th, 2024

 ,  , 
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משכו תשומת לב משמעותית במחקר פיזיולוגי ופתולוגי, אבחון מחלות וטיפול; עם זאת, התרגום הקליני שלהם הוגבל על ידי היעדר גישות ייצור בקנה מידה גדול. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) הנגזר מהאנדוזומים, שיש להם תפוקה גבוהה פי 100 בערך משיטת אולטרה-צנטריפוגה קונבנציונלית. בשיטה זו, ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) הופנמו על ידי תאי ההורים באמצעות אנדוציטוזה ולאחר מכן הצטברו בתוך האנדוזומים שלהם. לאחר מכן, אנדוזומים עמוסי MNPs נאספו וטוהרו על ידי טיפול היפוטוני והפרדה מגנטית. הומוגנייזר במהירות גבוהה שימש לפירוק אנדוזומים טעוני MNP לננו-שלפוחיות חד-פיזוריות. השלפוחיות שמקורן באנדוזום המתקבלות הן בעלות אותו מקור ביולוגי ומבנה, ומאופיינות בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וכתם מערבי. המורפולוגיה והרכב החלבונים שלהם דומים לרכבים חשמליים מקומיים, מה שמצביע על כך ש- EMs עשויים לשמש כתחליף בעלות נמוכה ובתפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מקוריים לתרגומים קליניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות קטנות המופרשות כמעט על ידי כל התאים בטווח גדלים של 30-150 ננומטר, המכילות שפע של חומרים ביו-אקטיביים. בהתאם לתא המוצא, כלי רכב חשמליים מראים הטרוגניות גבוהה, בעלי רכיבים מרובים ספציפיים לתאי אב1. כלי רכב חשמליים משתחררים לנוזלי הגוף ומועברים לאתרים מרוחקים, שם הם נלקחים על ידי תאי מטרה לפעולה2, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לספק מגוון רחב של מולקולות ביו-אקטיביות ותרופות לתיקון רקמות, אבחון וטיפול בגידולים ומודולציה חיסונית 3,4. עם זאת, ננו-חלקיקים ביולוגיים אחרים (למשל, ליפופרוטאינים) וננו-שלפוחיות (למשל, כלי רכב חשמליים שמקורם במסלולים שאינם אנדוזומליים) בעלי תכונות ביופיזיקליות דומות בנוזלי גוף משפיעים באופן בלתי נמנע על בידוד וטיהור רכב חשמלי. נכון להיום, אולטרה-צנטריפוגה נותרה תקן הזהב לבידוד רכב חשמלי, ושיטות בידוד אחרות, כולל צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז, אולטרה-סינון, משקעים מפוליאתילן גליקול, כרומטוגרפיה ובידוד חרוזים אימונומגנטי, פותחו5. צוואר הבקבוק הנוכחי המגביל את התרגום הקליני והמסחור של טיפולים ברכב חשמלי הוא המחסור החמור בטכניקות בידוד המאפשרות בידוד מדרגי וניתן לשחזור של כלי רכב חשמליים 6,7,8. טכניקות בידוד מסורתיות של כלי רכב חשמליים (למשל, צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגית וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל) סובלות מתפוקות נמוכות (1 x 107-1 x 108/1 x 106 תאים), מחזור ייצור ארוך (24-48 שעות), יכולת שחזור ירודה של איכות המוצר, ודורשות ציוד ייצור יקר ועתיר אנרגיה שאינו יכול לענות על הביקוש הקליני הנוכחי לרכבים חשמליים6.

חיקויים אקסוזומיים (EMs), פונדקאיות סינתטיות של כלי רכב חשמליים מקומיים, משכו תשומת לב חשובה בשל המבנה, התפקוד והמדרגיות הדומים מאוד שלהם בייצור. המקור העיקרי של EMs הוא מהאקסטרוזיה הישירה של תאי הורים שלמים עם חתך רציף9,10, המדגים פונקציות ביולוגיות חזקות כמו EVs מקומיים11,12. לדוגמה, EMs שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי (hUCMSCs) מפעילים השפעות ריפוי פצעים דומות לאלה של כלי רכב חשמליים מקומיים, והם עשירים יותר בהרכב חלבונים13. למרות EMs נגזר תאים שלמים יש את המורכבות הביולוגית של EVs, החיסרון העיקרי שלהם הוא ההטרוגניות של מוצרים כי הם מזוהמים באופן בלתי נמנע על ידי אברונים תאיים שונים פסולת התא. ניתוח לוקליזציה של חלבונים גילה עוד כי EMs שמקורם באקסטרוזיה של תאים שלמים מכילים חלבונים רבים שאינם ספציפיים ל- EVs מהמיטוכונדריה ומהרשתית האנדופלסמית13. יתר על כן, רוב השיטות לייצור EMs עדיין דורשים אולטרה-צנטריפוגה, תהליך גוזל זמן רב ואנרגיה14. בהתחשב בעובדה שאקסוזומים נגזרים באופן בלעדי מאנדוזומים תאיים, שיערנו כי ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים מהונדסים ביולוגית עשויות לשחזר טוב יותר את ההומולוגיה הביולוגית בין אקסוזומים ו- EMs בהשוואה ל- EMs המבוססים היטב שמקורם בקרום התא המיוצרים בשיטת אקסטרוזיה של תאים שלמים14. עם זאת, הייצור של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזום קשה בשל היעדר גישות בנות קיימא.

מחקרים קליניים בוצעו על ידי שימוש ברכבים חשמליים כתחליף לטיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות ננומטרית לטיפול במחלות שונות. לדוגמה, כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים ממח עצם שימשו לטיפול בדלקת ריאות חמורה שנגרמה על ידי COVID-19 והשיגו תוצאות מבטיחות. לאחרונה, כלי רכב חשמליים מהונדסים גנטית הנושאים חלבוני CD24 הוכיחו גם יתרונות טיפוליים רבי עוצמה לטיפול בחולי COVID-1915,16. עם זאת, הדרישה הקלינית של טיפול ברכב חשמלי עדיין לא יכולה להיענות בשיטות בידוד מסורתיות בגלל התשואה והעלות הנמוכות. מחקר זה מדווח על ייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזום באמצעות גישת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית. הוא מנצל את מסלול האנדוציטוזה של MNPs כדי לבודד אנדוזומים טעוני MNP באמצעות הפרדה מגנטית, ולאחר מכן הומוגניזציה במהירות גבוהה כדי לנסח אנדוזומים לננו-שלפוחיות חד-פיזור. מכיוון שסוגי האנדוזומים הנאספים על ידי פרוטוקול זה מגוונים, עדיין נדרש מחקר מעמיק נוסף כדי לבסס שיטות ייצור נאותות (GMP) בתעשייה. גישה חדשנית זו להכנת EM יעילה יותר בזמן (5 דקות של הומוגניזציה במהירות גבוהה) כדי להשיג ננו-שלפוחיות הומולוגיות לרכבים חשמליים מקומיים. הוא מייצר באופן אקספוננציאלי יותר שלפוחיות מאותן כמויות של תאים מאשר אולטרה-צנטריפוגה, אשר ניתן ליישם בדרך כלל על סוגי תאים שונים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: סכמה של השיטה מוצגת באיור 1.

1. הכנה ובידוד EM

  1. הפנמת תאים של MNPs
    1. תרבית תאים
      1. השהה 1 × 106 תאי גזע מזנכימליים של מח עצם חולדה (BMSC), 293T או תאי סרטן אפיתל של שחלות עכבר (ID8) ב- DMEM בינוני מלא עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו- 5% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (P / S) ב -2 מ"ל לכל צלחת שש בארות (ראה טבלת חומרים).
      2. תרבית את התאים לילה ב 37 ° C ו 5% CO2.
        הערה: מספר התאים לאחר ההיצמדות היה בערך 1 × 106.
    2. אנדוציטוזה של MNPs
      1. הפחת את נפח בינוני של כל צלחת שש בארות ל 1 מ"ל. תרבית משותפת של התאים עם ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל מהונדסת פוליליזין (IONPs) (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 100 מיקרוגרם/1 × 106 תאים ודגרה ב-37°C באטמוספירה המכילה 5% CO2 למשך 12 שעות כדי לאפשר לתאים אנדוציטוזה IONPs באופן מלא.
  2. בידוד והומוגניזציה של אנדוזומים
    1. טיפול היפוטוני בתאים
      1. לעכל את התאים שהפנימו IONPs באופן מלא עם 0.5 מ"ל / טוב טריפסין במשך 3 דקות, ולסיים את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל / טוב מדיום שלם.
      2. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant. השהה מחדש את התאים במי מלח חיץ פוספט (PBS) ובצנטריפוגה, פעמיים שוב ושוב כדי לשטוף את שאריות התווך והבלתי נספגות.
      3. לבסוף, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-8 מ"ל בתמיסה היפוטונית מוכנה מראש (71.4 מ"מ אשלגן כלורי, 1.3 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.2-7.4) למשך 15 דקות (ראה טבלת חומרים).
    2. שחרור אברונים על ידי הומוגניזציה במהירות נמוכה
      1. מעבירים את מתלה התא בתמיסה היפוטונית למבחנה מזכוכית ומשחררים את האברונים באמצעות הומוגנייזר זכוכית (ראו טבלת חומרים) ב-20 זעזועים ב-1000 סל"ד.
    3. הפרדה מגנטית להשגת אנדוזומים
      1. העבירו 1 מ"ל של תמיסת התא ההומוגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל והניחו במפריד מגנטי למשך שעה אחת כדי להפריד באופן מלא אנדוזומים טעוני IONP מאברונים אחרים (כגון גרעין ומיטוכונדריה) ומפסולת תאים.
      2. אספו את הכדוריות החומות על משטח המגע של צינורות המיקרוצנטריפוגות ליד המסגרת המגנטית (ראו טבלת חומרים), כלומר אנדוזומים טעוני IONP. השליכו את הנוזל לצינורות המיקרוצנטריפוגות והוסיפו 3 מ"ל PBS כדי להשעות מחדש את האנדוזומים.
  3. הומוגניזציה במהירות גבוהה
    1. מעבירים את התמיסה המכילה את האנדוזומים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עם נפח נוזלי בין 3-10 מ"ל.
    2. הרחב את הגשושית בקוטר 10 מ"מ של ההומוגנייזר המהיר (ראה טבלת חומרים) לתחתית צינור הצנטריפוגה מבלי לגעת בתחתית. התאם את לחצן המהירות מתחת למסך, הגדר את המהירות ל -140 x g וכוונן את לחצן הזמן כדי להגדיר את הזמן של 5 דקות, ולאחר מכן לחץ על הלחצן אישור .
    3. לחץ על לחצן התחל כדי לבצע את ההומוגניזציה לאחר הנחת קופסת קרח מתחת לדגימה.
  4. מיון מגנטי עבור EMs
    1. להעביר את הפתרון המכיל nanovesicles המתקבל הומוגניזציה במהירות גבוהה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולשים אותו במפריד מגנטי במשך 1 שעות.
    2. אסוף את הנוזל המכיל את ה- EMs הנדרשים. היזהר לא לגעת בפני השטח של הצינורות הסמוכים למסגרת המגנטית, אשר ספחה IONPs חופשיים ו- EMs טעונים IONP.

2. אפיון EM (איור 2 ואיור 3)

  1. ניתוח פיזור אור דינמי (DLS)
    1. הזריקו 1 מ"ל של דגימת EMs (20 מיקרוגרם/מ"ל) לאורך הקיר לתוך הקובטה והניחו אותה בחריץ דגימת המכשיר של מכשיר ה-DLS (ראו טבלת חומרים).
    2. פתח את תוכנת DLS, בחר בדיקת גודל חלקיקים והתחל בבדיקה.
    3. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (ראה טבלת חומרים).
  2. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    1. לדלל EMs עם PBS לתמיסה ב 1 × 107-1 × 108 חלקיקים / מ"ל ולהזריק אותם לתוך התא של מכשיר נת"ע (ראה טבלת חומרים) באמצעות מזרק 1 מ"ל בקצב זרימה של 500-1000 מיקרוליטר / דקה.
    2. פתח את 488 ערוצי הלייזר וודא שמספר ה- EMs בממשק התוכנה הוא בטווח של 100-300 ובתנועה בראונית.
    3. בהתאם לפרוטוקול היצרן, בחר את ה- SOP המתאים (EV-488) כדי להבטיח שרגישות המכשיר מתאימה לזיהוי EM.
  3. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
    1. תקן EMs (1 מ"ג / מ"ל) עם נפח שווה של 5% גלוטראלדהיד למשך 30 דקות, וכמת את ריכוז EMs כ- 1 מ"ג / מ"ל על ידי ערכת בדיקת חלבון BCA.
    2. הניחו טיפה של 10 μL של EMs בצד הפחמן של רשת הנחושת, והסירו נוזלים עודפים מהצד עם נייר סינון לאחר 10 דקות. הוסף 10 μL של PBS וכתם מיד עם נייר סינון. יש לחזור על הפעולה פעמיים כדי להסיר עודפי גלוטראלדהיד.
    3. יש לטפטף 5 μL של חומר ניגוד אורניל אצטט ולהכתים באופן שלילי למשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר את חומר הניגוד העודף. יש לשטוף שלוש פעמים במים נטולי יונים, ולייבש בטמפרטורת החדר (RT).
    4. הקלט תמונה על ידי TEM במתח תאוצה של 100 kV.
  4. כתם מערבי
    1. הוסף 100 μL של חיץ ליזה התא ו 5 μL של קוקטייל מעכבי פרוטאז 50x לדגימות (ראה טבלה של חומרים). מערבבים בעדינות עם אקדח פיפטה ומניחים על קרח למשך 30 דקות.
    2. צנטריפוגה את התמיסה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, לכמת את ריכוז החלבון של supernatant עם ערכת בדיקת חלבון BCA, ולאסוף אותו.
    3. ערבבו את הסופרנאטנט בנפח 100 מיקרוליטר עם 25 מיקרוליטר של מאגר העמסת חלבון פי 5 וחממו בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.
    4. הכינו ג'לים על פי הוראות הג'לים המוכנים. לטעון 15 מיקרוגרם של חלבון לכל באר ולהפעיל על ידי אלקטרופורזה ג'ל ב 80 V. לחכות הדגימה לרוץ לג'ל ההפרדה, לשנות ל 100 V, ולאחר מכן להעביר את החלבון לקרום nitrocellulose ב 100 V, 60 דקות תחת אמבט קרח.
    5. זהה את הסמנים שאינם ספציפיים לרכב חשמלי (Calnexin) ואת הסמנים הביולוגיים של EV (Annexin ו- CD63) על ידי כתמים מערביים (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הנוגדנים מדוללים בהתאם להמלצות היצרן.

3. זיהוי פונקציית EM חוץ גופית

  1. תיוג EMs
    1. ערבבו 1 μL של PKH26 עם 250 μL של מדלל C (1:250) ליצירת תמיסת צביעה 2x (4 × 10-6 M) (ראו טבלת חומרים).
    2. מערבבים 250 μL של EMs (1 מ"ג / מ"ל) עם 250 μL של תמיסת צביעה 2x ונושפים במהירות עם אקדח פיפטינג.
    3. יש לדגור ב-RT למשך 2-5 דקות תוך היפוך עדין של צינור הצנטריפוגה.
    4. הוסיפו נפח שווה של סרום או 1% חלבון בסרום בקר ודגרו במשך דקה אחת כדי לסיים את העיכול.
    5. הסר עודפי PKH26 על ידי אולטרה-סינון עם צינורות אולטרה-סינון של 1000 KD ב-3000 x גרם למשך 30 דקות, וחזור על הפעולה שלוש פעמים על-ידי הוספת PBS. יש להשהות מחדש את הנוזל שנותר ל-500 מיקרוליטר עם PBS ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
  2. בדיקת ספיגת תאים
    1. חיסון תאים: זרע 1 × 106 תאים בצלחות קונפוקליות 35 מ"מ עם 1 מ"ל DMEM המכיל 10% FBS ו 5% P / S, ודגרה ב 37 ° C ו 5% CO2 לילה.
    2. סנן את ה- EMs עם מסנני מזרק סטריליים 0.22 מיקרומטר כדי להסיר זיהום פוטנציאלי.
    3. טפל בתאים עם EMs המסומנים ב- PKH26 (10 9 חלקיקים / מ"ל) במשך 8 שעות.
    4. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להוסיף DAPI (10 ננוגרם/מ"ל) ולדגור במשך 10 דקות ב-RT.
    5. קבל את התמונות הפלואורסצנטיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לסריקת לייזר קונפוקלית באמצעות תעלות לייזר של 405 ננומטר ו- 561 ננומטר (ראה טבלת חומרים).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה של הכנת EM על-ידי הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית מוצגת באיור 1. תאים מפנימים IONPs מהונדסים בפוליליזין בגודל 10 ננומטר, אשר מצטברים באופן ספציפי באנדוזומים באמצעות אנדוציטוזה (איור 3A). לאחר שטופלו בחיץ היפוטוני והומוגני, האנדוזומים טעוני IONP משתחררים מהתאים ולאחר מכן נאספים על ידי הפרדה מגנטית. האנדוזומים המבודדים מורכבים מחדש לננו-שלפוחיות חד-מפוזיות, הידועות גם בשם EMs, על ידי הומוגניזציה במהירות גבוהה. חקרנו פרמטרים מרכזיים מרובים (למשל, הומוגניזציה, מהירות וזמן) כדי לזהות תנאי הכנה אופטימליים של קרינה אלקטרומגנטית (איור 2). לבסוף, מהירות הומוגניזציה של 140 x גרם למשך 5 דקות נבחרה כתנאי האופטימלי על ידי התחשבות בגודל החלקיקים והתשואה של EMs המיוצרים. IONPs בחינם ו- EMs טעונים ב- IONP מוסרים בסופו של דבר מפתרון המוצר הסופי על ידי סבב שני של הפרדה מגנטית כדי להשיג EMs נטולי IONP. השיטה מייצרת ננו-שלפוחיות אחידות וחד-מפוזרות מאנדוזומים של תאי הורים, החולקים את אותו מקור ביולוגי כמו כלי רכב חשמליים מקומיים.

כדי להשוות כלי רכב חשמליים שהושגו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה עם EMs שנוצרו בשיטה זו, BMSC ו-293T הוכנו עבור כלי רכב חשמליים ו-EMs. הקוטר והמורפולוגיה של EMs נותחו על ידי נת"ע ו-TEM. למורפולוגיה של BMSC-EMs יש תכונה של מבנה טיפוסי דמוי שלפוחית בצורת קערה, והיא תחומה על-ידי דו-שכבה ליפידית (איור 3A). כפי שנותח על-ידי NTA, גם ל-BMSC-EMs וגם ל-293T-EMs יש קוטר הידרודינמי דומה לזה של כלי רכב חשמליים מקומיים (BMSC-EV ו-293T-EVs) (איור 3B). תפוקות BMSC-EMs של הומוגניזציה במהירות גבוהה היו 8.16 × 10 8-1.42 × 109/1 × 10 6 תאים, והתשואה של כלי רכב חשמליים מקומיים שהוכנו על ידי אולטרה-צנטריפוגה הייתה רק 7.2 × 10 7-1.12 × 108/1 × 106תאים. באופן דומה, תפוקות 293T-EMs של הומוגניזציה במהירות גבוהה היו 3.71 × 10 8-7.58 × 108/1 × 10 6תאים, אשר מגיע עד בערך פי 100 גבוה יותר מאלה של 293T-EV מקומיים שהוכנו בשיטת אולטרה-צנטריפוגות קונבנציונלית (≈5.5 × 10 6/1× 106 תאים) (איור 4A).

יתר על כן, תוצאות הכתמים המערביים הראו כי BMSC-EMs מכילים את אותם סמנים ביולוגיים חלבוניים כמו EVs (CD63 ו Annexin). גם EMs וגם EV הם שליליים עבור ביטוי Calnexin, מה שמרמז על כך של- EMs שיוצרו בשיטה זו כמעט ולא היה זיהום בקרום הפלזמה (איור 3C). אין הבדל משמעותי בריכוז החלבונים בין EM ל- EV, BMSC-EMs ו- BMSC-EV הציגו ריכוזי חלבון כוללים דומים, 11.15 מיקרוגרם / 1 × 10 9 חלקיקים ו- 14.71 מיקרוגרם / 1 × 109 חלקיקים באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. יתר על כן, 293T-EMs ו-293T-EV הציגו ריכוזי חלבון כוללים של כ-31.8 מיקרוגרם/1 ×-10 9 חלקיקים ו-9.95 מיקרוגרם/1 ×-10 9 חלקיקים, בהתאמה (איור 4B). תוצאות אלה מצביעות על כך של- EMs יש הרכב חלבוני דומה לזה של כלי רכב חשמליים מקומיים. כדי לזהות אם EMs יכולים להיות אנדוציטוזיים, EMs ו- EV המסומנים ב- PKH26 הודגרו יחד עם BMSC ו- ID8 בריכוז של 1 × 109 חלקיקים / מ"ל במשך 8 שעות, והתאים נצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי כדי לאשר ש- EMs יכולים להיקלט בקלות על-ידי התאים לפעולה כמו גם על ידי כלי רכב חשמליים (איור 5).

figure-results-1
איור 1: תרשים סכמטי של שיטת ההומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע מגנטי. שלב 1: תאים מפנימים IONPs לתוך אנדוזומים באמצעות אנדוציטוזה. שלב 2: איסוף אברונים, כולל אנדוזומים עמוסי IONP, לאחר טיפול היפוטוני והומוגניזציה. שלב 3: טיהור אנדוזומים טעוני IONP על ידי הפרדה מגנטית. שלב 4: האנדוזומים עוברים הומוגניות ומורכבים מחדש לננו-שלפוחיות חד-מפוזיות. שלב 5: הסר IONPs חופשיים ו- EMs טעוני IONP על ידי הפרדה מגנטית כדי לאסוף EMs נטולי IONP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אופטימיזציה של תנאי הכנה לקרינה אלקטרומגנטית . (A) הקוטר וה-PDI של BMSC-EMs בתגובה לשינויים במהירות הומוגניזציה כאשר הזמן מוגדר ל-5 דקות נותחו על-ידי DLS. (B) הקוטר וה-PDI של BMSC-EMs בתגובה לשינויי זמן הומוגניזציה כאשר מהירות ההומוגניזציה מוגדרת ל-140 x g נותחו על-ידי DLS. (C) הקוטר וה-PDI של BMSC-EMs בנקודות זמן אחסון שונות נותחו על-ידי DLS. (D) הקוטר והריכוז של BMSC-EMs בתגובה לשינויי מהירות הומוגניזציה כאשר הזמן מוגדר ל-5 דקות נותחו על ידי נת"ע. (E) הקוטר והריכוז של BMSC-EMs בתגובה לשינוי זמן ההומוגניזציה כאשר מהירות ההומוגניזציה מוגדרת ל-140 x גרם נותחו על ידי נת"ע. (F) הקוטר והתנובה של BMSC-EMs בתגובה לדגירה משותפת של תאי BMSC עם IONPs בריכוזים שונים נותחו על ידי נת"ע. עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אפיון EMs. (A) אפיון TEM של המורפולוגיה של תאי הורים עם IONPs, אנדוזומים ו-EMs אנדוציטוזיים. פסי קנה המידה מייצגים 500 ננומטר. (B) קטרים הידרודינמיים של BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM ו-293T-EV מאופיינים על ידי נת"ע. (C) תוצאות ניתוח כתמים מערביים של BMSC-EMs, BMSC-EV וליזאטים של תאי BMSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
תרשים 4: תפוקת EMs גבוהה יותר מאשר EVs . (A) התפוקה של EMs ו- EV שהוכנו מ- BMSC ו- 293T נותחה על-ידי נת"ע. (B) תפוקת חלבון של EMs ורכבים חשמליים שהוכנו מ-BMSC ו-293T. **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מייצג של כלי רכב חשמליים ואלקטרומגנטיים המסומנים בתווית PKH26 שהופנמו על-ידי BMSC ו-ID8. פסי קנה המידה מייצגים 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפונדקאית של טיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות בקנה מידה ננומטרי, כלי רכב חשמליים עדיין לא עמדו בציפיות הקליניות שלהם, ומכשול עיקרי הוא היעדר שיטות ייצור וטיהור ניתנות להרחבה ולשחזור6. לכן, סוגים שונים של EMs פותחו כאנלוגים EV עם מורכבות ביולוגית דומה14. נכון להיום, הדוגמה הנפוצה ביותר לקרינה אלקטרומגנטית היא ננו-שלפוחיות שמקורן בקרום פלסמת התא. ההכנה של ננו-שלפוחיות כאלה קלה ופשוטה יחסית על ידי הרחקה ישירה של תאי הורה שלמים17. עם זאת, ננו-שלפוחיות שמקורן בקרום פלסמת התא אינן יכולות לשחזר כלי רכב חשמליים מקוריים בשל שני חסרונות: ראשית, המקור הביולוגי של ננו-שלפוחיות אלה הוא מקרום פלסמת התא, המכיל הרכבי שומנים וחלבונים שונים בהשוואה לרכבים חשמליים מקומיים; שנית, הזיהומים, כולל חלבונים, חומצות גרעין ושומנים מאברונים שאינם EV ופסולת תאים, גורמים להטרוגניות EM בלתי נמנעת. בשיטה זו, דגרנו על תאים עם IONPs ואספנו אנדוזומים טעוני IONP באמצעות הפרדה מגנטית, ולאחר מכן יצרנו ננו-שלפוחיות חד-פיזור באמצעות הומוגניזציה במהירות גבוהה, ובסופו של דבר השגנו EMs נטולי IONP בסבב שני של הפרדה מגנטית. יתר על כן, ביצענו אופטימיזציה של תנאי הכנת EM על ידי בחינת ההשפעה של פרמטרים שונים, כגון מהירות הומוגניזציה וזמן, על גודל ותפוקת EM. פרוטוקול זה מנצל תופעה ביולוגית מעניינת: MNPs (למשל, 10 ננומטר IONPs) יכולים להיות מופנמים ביעילות על ידי כמעט כל התאים באמצעות אנדוציטוזה ולצבור אך ורק אנדוזומים ולא אברונים אחרים. תהליך ביולוגי ייחודי זה איפשר בידוד של אנדוזומים טעוני MNP ללא זיהומים שאינם EV באמצעות הפרדה מגנטית. בתמורה, ננו-שלפוחיות שהוכנו על ידי אנדוזומי תאים מטוהרים אלה יכלו לשחזר בצורה נאמנה יותר את המורכבות הביולוגית של כלי רכב חשמליים מקומיים.

יתר על כן, תקן הזהב של שיטת בידוד EV הוא אולטרה צנטריפוגה, אשר עולה מדיה תרבית תאים מסיבית זמן עיבוד ארוך של מעל 5 שעות ומייצרת רק 1 × 107-1 × 108 חלקיקים מ 1 x 10 6 תאים6. שיטות מסורתיות של שחול תאי הורים שלמים כוללות שלבים מרובים הכוללים שחול קרום בלחץ גבוה במיוחד ואולטרה-צנטריפוגה, שיש להם תפוקה גבוהה יחסית אך דורשים ציוד יקר17. עם זאת, תפוקת הייצור של EM, יעילות, עלות וכוח אדם משופרים באופן משמעותי על ידי שימוש בפרוטוקול שלנו. הומוגנייזר במהירות גבוהה הוא ציוד נפוץ ובעלות נמוכה לזמן עיבוד קצר של 5 דקות בפרוטוקול זה, ושיטה זו יכולה לייצר עד פי 100 יותר EMs מ 1 × 106 תאים בהשוואה לרכבים חשמליים מקומיים. עם זאת, שיטה זו יש כמה מגבלות, כגון אובדן של חלבונים אנדוזומליים במהלך הומוגניזציה במהירות גבוהה, וזה הוכח כי MNPs אנדוציטוזה על ידי תאים יכול להיות מועבר ליזוזומים, אשר יהיה זיהום פוטנציאלי18.

בפרספקטיבה, EMs ניתן להנדס להפעיל פונקציות ביולוגיות חשובות כמו עמיתיהם הילידים, אשר עשוי לשמש סוג חדש ומבטיח של טיפולים ביולוגיים. חומרים ביו-אקטיביים (למשל, חלבונים וחומצות גרעין) יכולים להיות משולבים ב- EMs באמצעות בחירת תאי הורים ספציפיים (למשל, תאי גזע19) או שינוי גנטי (למשל, חלבוני היתוך20). לדוגמה, לננו-שלפוחיות שמקורן בתאים על ידי הרחקת תאי גזע עובריים חיים יש השפעה חיובית על תהליך ההחלמה או ריפוי הפצע19. שינוי גנטי הוא גישה חלופית ליצירת EMs עם פונקציות ביולוגיות ספציפיות. לדוגמה, כאשר תאים היו נגועים בווקטורים של ננו-גופים של קולטן גורם גדילה אנטי-אפידרמלי (EGFR) המאוחים לפפטידים של אותות עוגן גליקוזילפוספטידילינוזיטול (GPI), ננו-גופי EGFR יכולים להיות מעוגנים על פני השטח של EVs לצורך התמקדות בתאי גידול המבטאים EGFR20. EMs תפקדו היטב כפונדקאית של טיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות בקנה מידה ננומטרי במחקרים פרה-קליניים מרובים14, אך קיים חוסר הבנה מכניסטית מקיפה של טיפול מבוסס EM או EV עם חששות לגבי ההטרוגניות והשכפול של EVs ו- EMs בחקירות קליניות. יחד, הפונקציות הביולוגיות של EMs וההשלכות הקליניות שלהם מצדיקים חקירות נוספות.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.W. ו- P.G. הם ממציאים משותפים של בקשת פטנט שהוגשה על ידי המכון לרפואה בסיסית וסרטן (IBMC), האקדמיה הסינית למדעים. המחבר השני מצהיר שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון לרפואה בסיסית וסרטן (IBMC), האקדמיה הסינית למדעים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC; 82172598), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג, סין (LZ22H310001), פרויקט הכשרת כישרונות בריאות 551 של ועדת הבריאות של מחוז ג'ג'יאנג, סין, פרויקט המחקר לפיתוח חקלאי וחברתי של לשכת המדע והטכנולוגיה העירונית של האנגג'ואו (2022ZDSJ0474) ומענק המחקר הבין-תחומי Qiantang.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדן AnnexinABclonalA11235Western blotting
BCA ערכת בדיקתBeyotimeP0012בדיקת ריכוז חלבון
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
CD63 נוגדןABclonalA19023Western blotting
מאגר ליזה של תאים עבור מערבי ו-IPBeyotimeP0013מערבי
צנטריפוגהבקמןאלגרה X-30Rצנטריפוגת
תאים CO2 חממהתרמו תרבית תאיםקונפוקלית
סריקת לייזר מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתNIKONA1 HD25צילום תמונת הקרינה
DMEM בסיסי (1x)GIBCOC11995500BTתרבית תאים
פיזור אור דינמי (DLS)MalvernZetasizer Nano ZSניתוח קוטר
הומוגנייזר זכוכית חשמליתSCIENTZ (נינגבו, סין)DY89-IIהומוגניזציה במהירות נמוכה
FBS מדולדלת אקסוזוםBioscienceEXO-FBS-50A-1תרבית תאים
הומוגנייזר במהירות גבוההSCIENTZ (נינגבו, סין)XHF-DYהומוגניזציה במהירות גבוהה
סורגמגנטיTuohe טכנולוגיה אלקטרומכנית (שנגחאי, סין)הפרדה מגנטית
PKH26 ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים לתיוג קרום תא כלליSigma-AldrichPKH26GL-1KTהערכה מכילה מקשר תאים PKH26 באתנול
וננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מדללים C פוליליזין (IONPs)טכנולוגיית Zhongke Leiming (בייג'ינג, סין)Mag1100-10תרבית תאים
אשלגן כלורידאלאדין7447-40-7טיפול היפוטוני בתאים
קוקטייל מעכב פרוטאזBeyotimeP1030מעכב פרוטאינאז
נתרן ציטראטאלאדין7447-40-7טיפול היפוטוני בתאים
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)JEOLJEM-2100plusתמונת מורפולוגיה
אולטרה-צנטריפוגהבקמןאופטימה צנטריפוגת אקסוזום XPN-100
ZetaView מנתחי מעקב אחר ננו-חלקיקים ניתוח מעקבMetrixPMX120
סופגת ZEN3600מערכת NA אחר חלקיקים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977(2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
  3. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
  4. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  5. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  6. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  7. Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
  8. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
  9. Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
  10. Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
  11. Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161(2022).
  12. Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
  13. Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312(2022).
  14. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  15. Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12(2022).
  16. Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997(2022).
  17. Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
  18. Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
  19. Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
  20. Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Magnetic SeparationHigh Speed HomogenizationEndosome Derived VesiclesExosome MimicsExtracellular VesiclesNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopeWestern BlottingHypotonic TreatmentMagnetic Nanoparticles

Related Articles