מאמר שיטה

הפקת ארס מהצרעה הטפילית Trichogramma dendrolimi באמצעות פונדקאי מלאכותי

DOI:

10.3791/66032

⸱

6 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Nanjing Agricultural University, 2Key Laboratory of Integrated Pest Management of Crop of East China, Ministry of Agriculture, 3Sanya Institute of Nanjing Agricultural University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת ארס מ Trichogramma dendrolimi באמצעות מארח מלאכותי שנוצר עם סרט פוליאתילן ותמיסת חומצות אמינו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צרעות טפיליות הן קבוצה מגוונת של חרקים הימנופטריים המשמשים כמשאבים יקרי ערך להדברה ביולוגית של מזיקים. כדי להבטיח טפילות מוצלחת, צרעות טפיליות מזריקות ארס לפונדקאים שלהן כדי לדכא את חסינות המארחים שלהן, לווסת את התפתחות הפונדקאים, חילוף החומרים ואפילו ההתנהגות שלהם. עם יותר מ-600,000 מינים מוערך, מגוון הצרעות הטפיליות עולה על זה של בעלי חיים ארסיים אחרים, כגון נחשים, חלזונות חרוט ועכבישים. ארס צרעה טפילי הוא מקור לא נחקר מספיק של מולקולות ביו-אקטיביות עם יישומים פוטנציאליים בהדברה וברפואה. עם זאת, איסוף ארס הטפילים מאתגר בשל חוסר היכולת להשתמש בגירוי ישיר או חשמלי והקושי בדיסקציה בגלל גודלם הקטן. טריכוגרמה (שם מדעי: Trichogramma ) הוא סוג של צרעות טפיליות ביצים זעירות (~0.5 מ"מ) הנמצאות בשימוש נרחב להדברה ביולוגית של מזיקים לפידופטרניים הן בחקלאות והן ביערות. כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת ארס מ T. dendrolimi באמצעות פונדקאים מלאכותיים. פונדקאים מלאכותיים אלה נוצרים עם סרט פוליאתילן ותמיסות חומצות אמינו ולאחר מכן מחוסנים בצרעות טריכוגרמה לטיפול בטפילות. לאחר מכן נאסף הארס ורוכז. שיטה זו מאפשרת מיצוי כמויות גדולות של ארס טריכוגרמה תוך הימנעות מזיהום מרקמות אחרות הנגרמות כתוצאה מדיסקציה, בעיה נפוצה בפרוטוקולי דיסקציה של מאגרי ארס. גישה חדשנית זו מאפשרת את המחקר של ארס טריכוגרמה , וסוללת את הדרך למחקר חדש וליישומים פוטנציאליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צרעות טפיליות הן חרקים טפיליים המהווים משאבים חשובים להדברה ביולוגית1. יש מגוון רחב של צרעות טפיליות, עם מעל 600,000 מינים מוערכים2. מגוון הצרעות הטפיליות עולה בהרבה על זה של פרוקי רגליים ארסיים אחרים, כגון נחשים, חלזונות חרוט, עכבישים, עקרבים ודבורים. ארס הוא גורם טפילי חשוב בצרעות טפיליות. לטפילות מוצלחת, הארס מוזרק לפונדקאי, ומווסת את התנהגותו, חסינותו, התפתחותו וחילוף החומרים של הפונדקאי3. יתר על כן, הארס של צרעות טפיליות מציג מגוון יוצא דופן במבנים המולקולריים שלו, במטרות ובתפקודים, ומשקף קו-אבולוציה מורכבת עם המארחים שלהם. לפיכך, ארס טפילי הוא משאב יקר ערך ולא מוערך מספיק של מולקולות פעילות למטרות קוטלי חרקים או רפואיים4. בניגוד לארס של נחשים, חלזונות חרוט, עכבישים, עקרבים ודבורים, ארס צרעה טפילי אינו יכול להיאסף על ידי גירוי ישיר או גירוי חשמלי5. השיטה הנוכחית להפקת ארס צרעה טפילי היא לנתח את מאגר הארס. עם זאת, צרעות טפיליות הן לרוב קטנות, ונתיחת צרעות טפיליות דורשת מיומנויות טכניות גבוהות. לכן, אם נוכל למצוא דרך לאסוף את ארס הצרעות הטפיליות בצורה יעילה ונוחה, זה יעזור מאוד לחקור את הארס של צרעות טפיליות.

טריכוגרמה (שם מדעי: Trichogrammatidae) היא סוג של צרעות טפיליות זעירות (~0.5 מ"מ אורך)6. צרעות אלה הן בין חומרי ההדברה הביולוגית הנפוצים ביותר, במיוחד נגד ביצים של מזיקים לפידופטרנים שונים הן בחקלאות והן ביערות. לדוגמה, T. dendrolimi, אחד ממיני הטריכוגרמה הנפוצים ביותר בסין, יושם באופן נרחב להדברת מגוון מזיקים חקלאיים וייעוריים, כגון Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis, ו Chilo suppressalis. מחקרים קודמים הראו כי צרעות טריכוגרמה יכולות להזריק את ביציהן לפונדקאים מלאכותיים7. ניתן ליצור פונדקאים מלאכותיים באמצעות חומרים כגון שעווה8, אגר9, פרפילם10 ופילם פלסטיק11. התמיסה בפונדקאים מלאכותיים המשרה מספיק אוביפוזיציה עבור טריכוגרמה יכולה להיות פשוטה, כגון חומצות אמינו או מלחים אנאורגניים12. בהתבסס על המאפיין כי T. dendrolimi יכול לטפיל פונדקאים מלאכותיים, מחקר זה מספק שיטה חדשה להפקת ארס מצרעות טפיליות באמצעות פונדקאים מלאכותיים. גישה זו נועדה לטפל בחסרונות של תפוקה נמוכה, טוהר נמוך ורגישות לזיהום בטכניקות מיצוי נוכחיות. באמצעות שיטה זו, כמות גדולה של ארס טוהר גבוה מ T. dendrolimi ניתן לחלץ, אשר עונה על הצרכים של מחקר מדעי וסינון של מולקולות ביו-אקטיביות למטרות קוטלי חרקים או רפואיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול חרקים

  1. להאכיל Corcyra cephalonica על קמח תירס בטמפרטורה של 26 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 40% ± 10%.
  2. הזן T. dendrolimi מחרק Jilin בתוך הבית תוך שימוש בביצים של Corcyra cephalonica כפונדקאים. להאכיל צרעות בוגרות 10% מי סוכרוז בצינורות דרוזופילה בטמפרטורה של 26 ± 1 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 70% ± 10%, בהיר (L): כהה (D) תקופה של 14 שעות: 10 שעות.

2. הכנת כרטיסי ביצה מפלסטיק פוליאתילן

  1. קח סרט פלסטיק פוליאתילן באורך של 16 ס"מ, רוחב של 12 ס"מ, ועובי של 20 מיקרומטר. לחץ החוצה 30 בליטות חצי עגולות בקוטר של 2-3 מ"מ וגובה של כ -3 מ"מ באמצעות מוט השחזה זכוכית על פי פריסת צלחת PCR סטנדרטית של 96 חורים.
    הערה: תהליך של לחיצה החוצה 30 בליטות חצי עגולות באמצעות מוט השחזה זכוכית צריך להיעשות תוך שימת לב ללחץ מכיוון שלחיצה חזקה מדי תנקב את הפלסטיק ותנהם את מוט השחזה חסר הארס שחולץ.
  2. יש לחטא את שכבת הפלסטיק הדחוסה מפוליאתילן על ידי חשיפת שני הצדדים לאור אולטרה סגול (UV) למשך שעה אחת.
  3. הוסיפו כמות קטנה של 10% אלכוהול פוליוויניל למשטח החצי עגול.

3. טפילות Trichogramma dendrolimi

  1. לאחר הרדמת CO2 , הכניסו את נקבות הצרעות T. dendrolimi לקופסת איסוף, ומספר הצרעות היה ~3000.
  2. מניחים את הצד הקמור של כרטיס ביצת הסרט לכיוון קופסת האיסוף ומאבטחים את הקצוות בגומייה.
  3. הוסף 4 מיקרוליטר של תמיסת חומצות אמינו (6 גרם / ליטר לאוצין, 4 גרם / ליטר פנילאלנין, 4.25 גרם / ליטר היסטידין) לכל בליטה חצי עגולה. מכסים אותו בסרט פלסטיק פוליאתילן שטוח באורך 16 ס"מ וברוחב 12 ס"מ. השתמש בגומייה כדי לכסות היטב את קופסת האיסוף בשתי יריעות פלסטיק.
  4. תנו לצרעות T. dendrolimi לטפיל בחופשיות במשך 4-8 שעות ולספק 10% מי סוכרוז דרך כותנה רטובה.

4. איסוף ארס T. dendrolimi

  1. השג את תמיסת חומצות האמינו הטפיליות מהבליטה הפנימית של כרטיס הביצה המלאכותית והעבר אותה למכסה של צינורות 1.5 מ"ל.
  2. מכסים את מכסה הצינור ברשת ניילון 10 מיקרומטר בקוטר 25 מ"מ, מהדקים היטב את רשת הניילון וצינור הצנטריפוגה. מניחים את צינור הצנטריפוגה זקוף לצנטריפוגה קצרה באמצעות מיני צנטריפוגה (1360 x גרם) למשך 10 שניות ואוספים את התמיסה המסוננת (~ 100 מיקרוליטר ארס T. dendrolimi ).
  3. מדוד את ריכוז ארס T. dendrolimi שנאסף באמצעות ערכת בדיקה של חומצה ביצינכונינית (BCA) (טבלה של חומרים).
  4. אחסנו את הארס בטמפרטורה של -80°C לניתוחים נוספים.

5. ניתוחי SDS-PAGE

  1. הוסף 30 μL של ארס T. dendrolimi ל 10 μL של 4x סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) דגימת חיץ טעינה (טבלה של חומרים) וחום ב 95 ° C במשך 10 דקות.
  2. ביצוע ריצת ג'ל SDS-PAGE במתח של 130 וולט למשך 120 דקות.
  3. יש לצבוע ולהסיר את הצבע של ג'ל SDS-PAGE באמצעות מנגנון צביעת החלבונים (Table of Materials).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריכוז החלבונים של דגימות ארס מייצגות נמדד באמצעות ערכת בדיקת החלבון, והתוצאות מוצגות בטבלה 1. התוצאות הראו כי ריכוז חלבון הארס שנאסף בשיטה זו נע בין 0.35 מיקרוגרם/מיקרוליטר ל-0.46 מק"ג/מיקרוליטר, בעוד שבבקרה השלילית של תמיסת חומצות אמינו היה ריכוז חלבון של 0.03 מק"ג/μL עד 0.05 מיקרוגרם/μL. ריכוז חלבון הארס שנאסף בשיטה זו גבוה בהרבה מזה של בקרה שלילית, מה שמראה כי שיטה זו יכולה לאסוף היטב את הארס של צרעות טפיליות. בנוסף, אין מתאם ספציפי בין זמן הטפילות לריכוז, מכיוון שקבוצות שונות של צרעות טפיליות עשויות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה להפקת ארס מ T. dendrolimi באמצעות פונדקאים מלאכותיים. להלן נקודות המפתח בניסוי איסוף הארס. (1) במהלך ההכנה, T. dendrolimi חייב להיות מורדם במהירות עם ריכוז מתאים של CO2. אם ריכוז CO2 נמוך מדי, זה לא יהיה מספיק כדי להרדים את Trichogramma במהירות. לעומת זאת, אם הריכוז גבוה מדי, טריכוגרמה עלולה למות, מה שמקטין את יכולתם לטפיל את הפונדקאי המלאכותי. (2) יש להבטיח את הסטריליות של תמיסת חומצות האמינו, שכן זיהום של תמיסת חומצות האמינו עלול להשפיע לרעה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחבר אין מה לחשוף ואין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בתמיכה כספית מהקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן (מענק מס '323QN262), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '31701843 ו -32172483), קרן החדשנות המדעית והטכנולוגית של ג'יאנגסו לחקלאות (מענק מס '. CX(22)3012 ו- CX(21)3008), קרן "Shuangchuang Doctor" של מחוז ג'יאנגסו (מענק מס '202030472), וקרן הסטארט-אפים של האוניברסיטה החקלאית נאנג'ינג (מענק מס '804018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 μ m ניילון נטוMilliporeNY1002500לסינון ביצים
10% אלכוהול פוליווינילאלאדיןP139533למשיכה  T. dendrolimi  להטלת ביצים
10% מי סוכרוזסינופארם ריאגנט כימי 10021463 הזנה Trichogramma dendrolimi
>4x מאגר טעינת LDSAce חומרהB23010301SDS-PAGE
קופסת איסוףמעדנייה8555מיכל עבור T. dendrolimi טפילות
עתידית PAGE  4– 12% (12 בארות)Ace חומרהJ70236502XSDS-PAGE
GenScript eStain L1 מכשיר צביעת חלבוןGenScriptL00753SDS-PAGE
מוט שחיקה מזכוכית   Applygentb6268בליטות חצי עגולות 
L- LeucineSolarbioL0011רכיבי מארח מלאכותיים
L-HistidineAladdinA2219458רכיבי מארח מלאכותיים
L-פנילאלניןSolarbioP0010רכיבי מארח מלאכותיים
מיני צנטריפוגותScilogexD1008צנטריפוגה
MOPS-SDS מאגר ריצהAce HardwareB23021SDS-PAGE
ערכת בדיקת חלבון BCA מיידית Omni-Easyשנחאי Yamay טכנולוגיה ביו-רפואית ZJ102להערכת ריכוז חלבון הארס
פריסת צלחת PCR של 96 חוריםתרמו פישרAB1400Lבליטות חצי עגולות 
סרט פלסטיק פוליאתילןSuzhou Aopang מסחר  001c5427כרטיס ביצה מלאכותית
סמן חלבון צבע מוכתם מראש (10– 180 kDa)YiFeiXue BiotechYWB007SDS-PAGE
רצועתגומי גואנגג'ואו qianrui ביולוגיה מדע וטכנולוגיה009הדק את סרט הפלסטיק ואת קופסת האיסוף
מחצלת מחיצת גומי סיליקון, 96 בארות, חור עגולSangon BiotechF504416-0001בליטות חצי עגולות 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
  2. Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
  3. Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
  4. Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
  5. Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
  6. Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
  7. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
  8. Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568(1982).
  9. Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
  10. Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
  11. Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
  12. Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
  13. Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
  14. Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
  15. Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS Page

מאמרים קשורים