הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66036

⸱

9 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Eye Hospital, Jinan University, 2Shenzhen Eye Institute, 3Shenzhen Research Institute, Wuhan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מבססים מודל חולדה של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות כדי לספק בסיס לחקר עין יבשה חסרת מים.

תקציר

עין יבשה חסרת מים (ADDE) היא סוג של מחלת עין יבשה שיכולה לגרום לירידה בכמות ואיכות הפרשת הדמעות. ייצור דמעות חריג ממושך עלול להוביל להפרעה בסביבת פני השטח של העין, כולל נזק לקרנית ודלקת. במקרים חמורים, ADDE יכול לגרום לאובדן ראייה או אפילו עיוורון. נכון לעכשיו, טיפול בעין יבשה מוגבל לטיפות עיניים או פיזיותרפיה, אשר יכולים רק להקל על תסמיני אי נוחות בעין ולא יכולים לרפא באופן יסודי תסמונת העין היבשה. כדי לשחזר את תפקוד בלוטת הדמעות בעין יבשה, יצרנו מודל חייתי של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות בחולדות המושרה על ידי סקופולמין. באמצעות הערכה מקיפה של בלוטת הדמעות, הקרניות, הלחמית וגורמים אחרים, אנו שואפים לספק הבנה מלאה של השינויים הפתולוגיים של ADDE. בהשוואה למודל עכבר העין היבשה הנוכחי, מודל זה של בעלי חיים ADDE כולל הערכה תפקודית של בלוטת הדמעות, ומספק פלטפורמה טובה יותר לחקר תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות ב- ADDE.

מבוא

עד שנת 2021, כ -12% מהאנשים מושפעים באופן משמעותי מיובשבעיניים 1, מה שהופך אותה לאחת ממחלות העיניים הכרוניות הנפוצות ביותר. ניתן לחלק את העין היבשה לשני סוגים: עין יבשה חסרת מים (ADDE) ועין יבשה באידוי (EDE)2, בהתאם לגורמים השונים המשפיעים על המחלה. ADDE מחולק גם לתסמונת סיוגרן (SS) ולא SS, אך רוב חולי העין היבשה הם חולים שאינם SS בקליני3. תסמיני עין יבשה כרוניים משפיעים באופן חמור על איכות הראייה של החולים. נכון לעכשיו, הטיפול הקונבנציונלי של DED כרוך ביישום של דמעות מלאכותיות כדי לשמן את פני העין ופיזיותרפיה של העפעפיים. עם זאת, תסמונת העין היבשה לא יכול להציע תרופה מלאה במקרים רבים. לכן, חקר הפתוגנזה של מחלת העין היבשה הוא חיוני לפיתוח טיפולים ותרופות חדשות. מודלים של בעלי חיים של תסמונת העין היבשה מספקים בסיס למחקר נוסף.

ישנן דרכים רבות לבנות מודלים של בעלי חיים של תסמונת העין היבשה4, כולל שינוי רמות הפרשת הדמעות על ידי שינוי רמות ההורמונים. לדוגמה, הסרת האשכים של חולדות יכולה להפחית את הפרשת אנדרוגן, להגביר את הפרשת הדמעות, ולהפחית את הריכוז של רכיב הפרשה חופשית (SC) ו- IgA בדמעות 5,6. שיטה נוספת היא להצביע על תגובות אוטואימוניות בבלוטת הדמעות על ידי הסרת עצבי פני העין השולטים על הבלוטה. בנוסף, ניתן להשיג הפחתה ישירה של הפרשת הדמעות על ידי הסרה כירורגית של בלוטת הדמעות7. תנאי סביבה משתנים יכולים גם להאיץ את אידוי הדמעות. לדוגמה, גידול בעלי חיים בתנאי לחות נמוכה ואוורור יבש יכול לבסס מודל של עין יבשה באידוי מוגזם8, אשר ניתן לשלב עם שיטות אחרות כדי להגביר את חומרת העין היבשה. התרופות העיקריות המשמשות להשראת מודלים ניסיוניים של עין יבשה הן אטרופין וסקופולאמין9. כמעכבים פאראסימפתטיים, שניהם יכולים לגרום לחסימה פרמקולוגית של קולטנים כולינרגיים (מוסקריניים) בבלוטת הדמעות ולעכב הפרשת דמעות. בהשוואה ליובש בעיניים הנגרם על ידי הזרקת שריר אטרופין10, לסקופולמין יש השפעה מעכבת חזקה יותר על בלוטות ההפרשה, משך זמן ארוך יותר של פעילות תרופתית, והשפעות חלשות יותר על שרירי הלב, המעי הדק והסימפונות. זוהי אחת התרופות הבשלות ביותר עבור מודלים של בעלי חיים עם עיניים יבשות.

ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי לגרום לעין יבשה עם סקופולמין, כגון הזרקה תת עורית, משאבת סמים, או יישום תיקון 4,11,12. על מנת להפחית את תדירות מתן התרופות לחיות ניסוי, חוקרים רבים מדביקים טלאים טרנסדרמליים על זנבות עכברים או משתמשים במשאבות סמים. עם זאת, לשתי השיטות הללו יש מגבלות. לדוגמה, ספיגת טלאים עוריים צריכה לקחת בחשבון את הקליטה האישית של עכברים, מה שעלול להוביל למינון תרופות לא עקבי. למרות משאבות סמים יכול לשלוט במדויק על המינון של כל ממשל, הם לא תמיד תואמים את התרופה מועברת או את הריכוז בשימוש. כמו כן, יש למקם אותם בניתוח – שהוא פולשני יותר לבעל החיים, הדורש אירוע הרדמה, וקיים פוטנציאל לסיבוכים לאחר הניתוח כגון הלחשה. הזרקה תת עורית, אם כי מסורבלת יותר, יכולה להבטיח מינון מדויק לכל מתן ולשמור על עקביות במתן התרופה בקרב חולדות שונות. יחד עם זאת, יש לו עלות נמוכה יותר והוא מתאים לביצוע מספר רב של ניסויים בבעלי חיים.

מחקר זה מיישם הזרקות תת עוריות חוזרות ונשנות של סקופולמין כדי לבסס מודל של חולדת עין יבשה. אנו מנתחים אינדיקטורים לעין יבשה כגון פגמים בקרנית, רמות הפרשת דמעות ומורפולוגיה פתולוגית של הקרנית, הלחמית ובלוטת הדמעות. על ידי שילוב של ריכוז תרופות, ביטויים פתולוגיים ותסמיני עין יבשה, אנו מרחיבים עוד יותר את מודל חולדת העין היבשה בפירוט, ומספקים נתונים ניסיוניים מדויקים יותר לחקר הטיפול בעין יבשה ומנגנונים פתולוגיים. אנו גם מתארים בפירוט את תהליך המידול עבור חוקרים עתידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים בהתאם לפרוטוקול זה מבוצעים באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. הכנת בעלי חיים

  1. הכינו 12 נקבות ויסטאר בריאות בנות 6 שבועות עם מקדם הגנה במשקל 160 גרם ±-20 גרם.
  2. השתמש במנורת סדק ואופטלמוסקופ כדי לבחון את תנאי העיניים של כל החולדות, וודא שאין מקטע קדמי או מחלות רשתית.
  3. לגדל את כל החולדות במשך שבוע אחד עם מקורות מזון ומים מספיקים.
  4. חולקו באופן אקראי כל החולדות לקבוצות נורמליות, ריכוז תרופת סקופולמין 2.5 מ"ג/מ"ל, ריכוז תרופת סקופולאמין 5 מ"ג/מ"ל וריכוז תרופת סקופולאמין 7.5 מ"ג/מ"ל, עם שלוש חיות בכל קבוצה.

2. הכנת פתרון

  1. הכינו סקופולאמין הידרוברומיד על ידי המסתו בתמיסת נתרן כלורי 0.9% ליצירת תמיסה בריכוזים של 7.5 מ"ג/מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל ו-2.5 מ"ג/מ"ל.
  2. הכינו תמיסת נתרן כלורי 0.9% ללא הידרוברומיד סקופולאמין שתשמש כזריקה לקבוצת הביקורת של חולדות.

3. הכנת ציוד וחומרים

  1. הכינו מיקרוסקופ של בעלי חיים קטנים.
  2. להכין חומרים לניסוי, כולל מזרק חד פעמי 1 מ"ל עם מחט (26 גרם); רצועות נתרן אופתלמיות פלואורסצאין; רצועת בדיקת דמעות של שירמר; אתנול מוחלט; 4% paraformaldehyde; קסילן; בלסם נייטרלי; hematoxylin, eosin; וערכת צביעה תקופתית של חומצה שיף.

4. הזרקה תת עורית

הערה: הליך זה דורש סיוע מאדם שני כדי לסייע באבטחת החולדות.

  1. החזיקו את גוף החולדה יציב ותפסו ומתחו את רגליה האחוריות השמאלית (או הימנית).
    הערה: עוזר יכול לעזור בהחזקת החיה.
  2. נקו את מקום ההזרקה עם אלכוהול.
  3. יש להכניס מזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל עם מחט (26 גרם) בבסיס קפל העור בין האגודל לאצבע.
  4. שאפו את המזרק על ידי משיכת הבוכנה לאחור של המזרק. כל דם במזרק מצביע על מיקום מחט לא תקין; הסר ומקם מחדש את המחט.
  5. יש לתת תמיסת נתרן כלורי 0.9% עם או בלי סקופולאמין הידרוברומיד בתנועה יציבה וזורמת.
  6. יש להזריק את כל החולדות לפי ריכוזים שונים, כאשר 0.5 מ"ל מוזרק בכל פעם וארבע פעמים ביום (בשעות 9:00, 12:00, 15:00 ו-18:00) במשך תקופה רצופה של 19 ימים, לסירוגין בין גפיים שמאל וימין.
    הערה: שמות הקבוצות הם כדלקמן:
    קבוצה ללא סקופולמין הידרוברומיד: 0 קבוצה (ביקורת)
    קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 2.5 מ"ג/מ"ל: 2.5 קבוצה
    קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 5 מ"ג/מ"ל: 5 קבוצה
    קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 7.5 מ"ג/מ"ל: 7.5 קבוצה
  7. להחזיר את בעל החיים לכלוב שלו ולפקח על נשימה והתנהגות במשך 5-10 דקות.

5. בדיקת הפרשת דמעות (בדיקת דמעות שירמר, STT)

  1. צור רצועת נייר סינון שונה עבור חולדות11. חתכו מחצית מפס נייר הסינון המשמש לבני אדם לאורך קו האמצע (1 מ"מ × 15 מ"מ), וחתכו את ראש הרצועה כדי להפוך אותה לחלקה.
    הערה: לפני ביצוע בדיקת הפרשת הדמעות, יש לרסן ידנית את גוף החולדה כדי למנוע תנועה ולהבטיח חשיפה של עיני החולדה.
  2. הניחו את פס נייר הסינון על 1/3 החיצוני של שק הלחמית התחתון של העפעף של החולדה.
  3. זמן הבדיקה במשך 5 דקות. לשלוט על סגירת העיניים של החולדה לאורך כל ההליך.
  4. לאחר המדידה, השתמש בפינצטה כדי להדק את רצועת נייר הסינון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ולרשום את נפח הקרע על ידי ביצוע סימן על דופן הצינור.
  5. מדדו הפרשת דמעות ביום 0, יום 1, יום 3, יום 5, יום 7, יום 11, יום 15 ויום 19.

6. צביעת פלואורסצאין בקרנית

  1. זרוק 0.5 μL של תמיסת נתרן פלואורסצאין 0.5% לתוך שק הלחמית התחתון של כל חולדה.
  2. יש להתבונן בקרנית תחת אור כחול במשך 3 דקות לאחר החדרת פלואורסצאין.
  3. רשמו את הכתמים הפלואורסצנטיים של הקרנית של כל חולדה ובדקו אם יש פגם בקרנית.
  4. בצעו צביעה פלואורסצאין בקרנית ביום 0, יום 1, יום 3, יום 5, יום 7, יום 11, יום 15 ויום 19.

7. תצפית היסטולוגית של רקמת הלחמית

  1. לאחר השלמת פיתוח המודל, מרדימים את החולדות עמוק עם הזרקה תוך צפקית של 0.4 מ"ל / 100 גרם של הידרט כלורלי מימי 10% כדי להקל על המתח של בעלי החיים. לאחר מכן, הרדימו את החולדות על ידי פריקת צוואר הרחם.
  2. קח את לחמית הבולבר מאותם אזורים של כל חולדה, בגודל של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ.
  3. תקן את הרקמות מיד ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות להטביע פרפין13.
  4. יש לחתוך חתכים בעובי 5 מיקרומטר ולהכתים עם המטוקסילין ואאוזין (HE)14 וכתם חומצה-שיף תקופתי (PAS) (יש לעקוב אחר הוראות היצרן).

8. תצפית היסטולוגית של רקמת הקרנית ובלוטת הדמעות

  1. לאחר השלמת פיתוח המודל, הרדימו את החולדה כמתואר בשלב 7.1.
  2. קח את הקרנית בצד ימין של כל חולדה וקבע אותה מיד בתמיסת פרפורמלדהיד 4%.
  3. חותכים את האפידרמיס הצפלי ואת הרקמה התת עורית לאורך הקו המחבר בין האוזן לפינה החיצונית של העין, מרחיבים את החתך לשני הצדדים ומבודדים עוד יותר את בלוטת האורביטל הנוספת הצהבהבה.
  4. הסירו היטב את פרוות החולדה והפרידו את הבלוטה החוץ-מסלולית בתמיסת נתרן כלורי 0.9%.
  5. מניחים את הבלוטות החוץ-מסלוליות המבודדות בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות ומטמיעים בפרפין.
  6. חתכו חלקים רציפים בעובי ~5 מיקרומטר והכתימו אותם עם HE עבור דגימות רקמת קרנית ובלוטות חוץ-מסלוליות.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח סטטיסטי של הנתונים.
    1. בצע ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) כדי לנתח את הנתונים ואת מבחן ההבדל הכי פחות משמעותי (LSD) להשוואה בין קבוצות. הגדר את רמת המובהקות הסטטיסטית על α = 0.05, כאשר P < 0.05 מציין מובהקות סטטיסטית.
      הערה: תוכנת SPSS 20 שימשה לניתוח סטטיסטי של נתוני הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שירמר אני בודק, SIT I
נפח הדמעות של החולדות נמדד בימים 0, 3, 5, 7, 11, 15 ו-19 לאחר תחילת הניסוי. תוצאות הניסוי הראו כי הפרשת הדמעות של קבוצת הסקופולמין (2.5 קבוצה, 5 קבוצות, 7.5 קבוצות), בהשוואה לקבוצת הביקורת (קבוצת 0), ירדה באופן מובהק, וההפרש היה מובהק סטטיסטית (P < 0.01). לא נמצאה מובהקות סטטיסטית בין קבוצת 2.5, קבוצה 5 וקבוצת 7.5 (P > 0.05). לא נצפה הבדל משמעותי בין הקבוצות השונות מבחינת מספר הימים (P > 0.05) (תרשים 1, לוח 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עין יבשה חסרת מים (ADDE) היא סוג חשוב של עין יבשה, המהווה כשליש מכלל אוכלוסיית העין היבשה17, והגורם העיקרי ל- ADDE הוא נזק פתולוגי לבלוטת הדמעות ודלקת13. עבור סוג זה של עין יבשה, שיטות הטיפול הקליני הנפוצות ביותר הן דמעות מלאכותיות כדי להקל על הסימפטומים או יישום מקומי של סטרואידים או cyclosporine18, בעוד שיש כמה אפשרויות טיפול עבור נזק בלוטת הדמעות. לכן, חשוב מאוד לחקור את ההשפעה של שחזור תפקוד בלוטת הדמעות על עין יבשה ולבסס מודל בעלי חיים של תפקוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים הקשורים לתרופות ולחומרים המשמשים בהליך זה.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי Guangdong Provincial High-Level Clinical Key Specialties (SZGSP014) ו- Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% תמיסת נתרן כלוריSJZ מס' 4 פרמצבטיקהH13023201
4% פרפורמלדהידווהאן Servicebio Technology Co., LtdG1113
אתנול מוחלטסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ
רצועות עיניים נתרן פלואורסצאיןטיאנג'ין Yinuoxinkang מכשור רפואי טק ושות', בע"מYN-YG-I
Hematoxylin ו-eosinNanjing Jiancheng מכון ביו-הנדסהD006
בלזם ניטרליבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות' בע"מ G8590
פרפיןבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מYA0012
ערכת צביעת חומצה-שיף תקופתיתBeyotime ביוטכנולוגיהC0142S
רצועות בדיקת קרע של שירמרטיאנג'ין Yinuoxinkang מכשיר רפואי טק ושות', בע"מYN-LZ-I
Scopolamine הידרוברומידשנחאי מקלין ביוכימיה ושות', בע"מS860151
מיקרוסקופ לבעלי חיים קטניםביוטכנולוגיה ושות'. בע"מZM191
קסילןסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ
10009218ראש10023418

מקורות

  1. Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
  2. Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).
  3. Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).
  4. Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102(2021).
  5. Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
  6. Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
  7. Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
  8. Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
  9. Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
  10. Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
  11. Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
  12. Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
  15. Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).
  16. Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
  17. Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
  18. Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
  19. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).
  20. Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
  21. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

השראה של סקופולמיןמבחן הפרשת דמעותצביעת קרניתמודל חולדהמורפולוגיה של הלועההערכת בלוטת הדמעותנזק לפני השטח של העיןשינויים דלקתיים
מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.