טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הן מבני כרומטין דמויי רשת שנפלטים מנויטרופילים בתגובה לגירויים דלקתיים שונים. NETs מורכבים מדנ"א, היסטונים וחלבונים/פפטידים אנטי-מיקרוביאליים שונים, אשר לוכדים והורגים פתוגנים זיהומיים ומעוררים תגובות דלקתיות¹.

בעוד NETs מועילים להגנה על המארח מפני פתוגנים, הם צברו תשומת לב כמניע פוטנציאלי של מחלות אוטואימוניות שונות², פקקת³, מחלות מטבוליות⁴, וצמיחה גרורתית של סרטן⁵. ככזה, עיכוב של היווצרות NET הוא אופציה טיפולית פוטנציאלית עבור מחלות אלה. עם זאת, למרות כמה מולקולות מכוונות NETs מבטיחות בפיתוח⁶, עדיין אין טיפול מאושר המשפיע באופן ספציפי על מנגנון זה. ניתן לייחס זאת, לפחות חלקית, להיעדר שיטות כימות אובייקטיביות, בלתי מוטות, ניתנות לשחזור ובעלות תפוקה גבוהה ליצירת NET.

הקמנו ודיווחנו על שיטה חדשה המשתמשת בפלטפורמת דימות תאים חיים בצבע כפול ^7,8. תמונות בהילוך מהיר של נויטרופילים מוכתמים בצבע גרעיני חדיר לקרום וצבע DNA בלתי חדיר לקרום מנותחות על ידי התוכנה, ומספרי הנויטרופילים לפני ואחרי יצירת NET נספרים במספר נקודות זמן. מאחר ששלמות קרום הפלזמה אובדת במהלך היווצרות הרשת על ידי ויסות פירוק לאמין B בתיווך PKCα ולאמין 9 בתיווך CDK4/^6, נויטרופילים יוצרי NET מוכתמים על ידי צבע DNA אטום לקרום בעוד נויטרופילים בריאים אינם. שיטה זו מתגברת על הבעיות של טכניקות שדווחו בעבר לכימות היווצרות NET ומספקת כימות NET בלתי מוטה, תפוקה גבוהה, ניתנת לשחזור ומדויקת באופן אוטומטי.

נויטרופילים מנבדקים אנושיים בריאים התקבלו לאחר שניתנה הסכמה מדעת במסגרת פרוטוקול מאושר של מועצת הביקורת המוסדית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של NIH.

1. צביעת הנויטרופילים והכנת צלחת הבדיקה

1. יש ליטול דם היקפי בהסכמה מדעת מתאימה בכתב בהתאם להנחיות של כל מכון ולבודד נויטרופילים בכל שיטה רצויה. לדוגמה, שיטת Ficoll-dextran^10,11 היא שיטה נפוצה לבידוד נויטרופילים מדם היקפי אנושי.
   הערה: למרות שהשיטה הנדונה כאן משתמשת בנויטרופילים אנושיים, ניתן לנתח גם נויטרופילים של עכברים באמצעות פרוטוקול דומה.
2. להשהות נויטרופילים במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI; ראה טבלת חומרים) 1640 בינוני ב 2.0 x 10⁶ נויטרופילים / מ"ל ולמקם את תרחיף נויטרופילים לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
   הערה: בדרך כלל איננו מוסיפים סרום בקר עוברי (FBS) למדיית התרבית מכיוון שאלבומין ב- FBS יכול להפחית היווצרות נטו¹² ונוקלאז יציב בחום ב- FBS יכול לפגוע ב- NETs¹³.
3. הוסף צבע DNA אדום חדיר לקרום (ראה טבלת חומרים) ב 1 μL לכל 1.5 מ"ל של תרחיף נויטרופילים.
4. דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך. צנטריפוגה ב 2500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר supernatant.
5. להשהות נויטרופילים ב 1 מ"ל של RPMI, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר supernatant. חזור על הפעולה 2x (סה"כ כביסה 3x).
6. להשהות נויטרופילים ב 1 מ"ל של RPMI ולספור באמצעות מונה התא. דילול תרחיף נויטרופילים ל 1.5 x 10⁵ נויטרופילים / מ"ל.
7. הוסף 4 μL של 1:100-מראש מדולל מראש קרום אטום קרום ירוק DNA צבע (ראה טבלה של חומרים) לכל 1 מ"ל של תרחיף נויטרופילים.
8. הכניסו 100 מיקרוליטר של תרחיף נויטרופילים לכל באר לתוך צלחת 96 בארות שקופה המטופלת בתרבית רקמה (ראו טבלת חומרים). הגדר כל תנאי במשולש.
   הערה: הראינו בעבר⁷ כי אין הבדל בהיווצרות נטו וכימות בשיטה זו אם נויטרופילים ממוקמים בלוחות עם או בלי ציפוי פולי-L-ליזין. לכן, השימוש בצלחת טיפול בתרבית רקמה מספיק לשיטה זו.
9. הוסף 100 μL של RPMI המכיל ריאגנטים גירוי עם או בלי מעכב, או כל מגיב אחר בעל עניין בבארות בהתאמה. השתמש תמיד בבארות בקרה חיוביות על ידי הוספת 500 ננומטר פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA) או 2.5 מיקרומטר סידן יונופור (A23187), מעכב 30 מיקרומטר AKT שימש כאן.
10. הניחו את הצלחת במערכת ניתוח התאים החיים (ראו טבלת חומרים) השוכנת באינקובטור של 5%_CO2 .
    הערה: עיבוי עשוי להופיע בחלק העליון והתחתון של הצלחת מספר דקות לאחר שלב זה. זה עלול לעכב הדמיה נכונה. נגבו והסירו היטב את העיבוי לפני תחילת הסריקה. הניחו את הצלחת במכונה, הפעילו את התוכנה, הזינו פרוטוקול סריקה ולאחר מכן נגבו את הצלחת ממש לפני הסריקה הראשונה.

2. צלחת סריקה כדי לדמיין נויטרופילים יוצרי NET

1. הפעל את התוכנה (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטי תוכנה). הפעל את הוסף כלי על ידי לחיצה על + בפינה השמאלית העליונה.
2. בחר סרוק לפי לוח זמנים. בחר חדש.
   הערה: לאחר יצירתו, הפעל את אותו פרוטוקול סריקה על-ידי בחירה באפשרות העתק קודם ובחירת פרוטוקול מאוחסן במסך הבא.
3. בחר רגיל. הגדר הגדרות סריקה כ: אפשרויות תא אחר תא: ללא; ערוצי תמונה: שלב, ירוק (זמן רכישה: 200 ms), אדום (זמן רכישה: 400 ms); מטרה: פי 20.
4. בחר את הצלחת שבה נעשה שימוש מהרשימה. בחר את מיקום הכלי שבו להניח את הצלחת על המגש של מערכת הדמיה התא החי.
5. בחר בארות שבהן יש דגימות והחלט כמה תמונות לצלם בכל באר. בהתבסס על מספר התמונות בכל באר, צור משך סריקה משוער עבור הצלחת. בדרך כלל, 4 תמונות לכל באר מספיק; עם זאת, הדבר עשוי להשתנות בהתאם לתנאים ולתדירות הסריקות.
6. הזן את המידע מכל באר (לדוגמה, סוג התא והתרכובת) על-ידי לחיצה על צור מפת לוחות כדי לספק שם למחקר.
   הערה: ניתן להכין ולשמור מראש את מפת הלוחות באמצעות עורך מפת הלוחות בתוכנה. ניתן לייבא את נתוני מפת הלוחות השמורים במהלך שלב זה. אם תרצה, ניתן לדלג על הזנת מידע על מפת הלוחות ולבצע אותה מאוחר יותר. ניתן לקבל נתונים גם מבלי להזין מידע על פריסת הלוחות. עם זאת, מומלץ להזין מידע על הצלחת כדי להקל על הניתוח הבא.
7. במסך הבא, בחר מנתח בסיסי כסוג הניתוח ובחר פרוטוקול ניתוח מהרשימה הנפתחת, המציגה הגדרות ניתוח שהיו בשימוש בעבר (לא פרוטוקולי סריקה). ניתן להשאיר ערבוב ספקטרלי הן עבור ירוק והן עבור אדום ב- 0.0%.
   הערה: ניתן לדלג על שלב זה, אם תרצה בכך.
8. תזמון סריקה. עבור הניסוי כאן, לסרוק בכל 15-20 דקות במשך 8 שעות. הגדר את שעת ההתחלה של הסריקה על-ידי גרירת הפס הלבן והאפור מעל המסך.
   הערה: הימנע מסריקה בתדירות גבוהה מדי, אחרת ייתכן שההתקן לא יפעל היטב עקב התחממות יתר. זמן הסריקה לא יעלה על 12 שעות לכל 24 שעות. ייתכן שתראה התראה אם הסריקה תכופה מדי.
9. בדוק את הגדרת הסריקה במסך הבא ולחץ על הוסף ללוח הזמנים כדי להתחיל בסריקה. המתן עד שקבוצת התמונות הראשונית תיסרק כדי לאשר אם הכל פועל כשורה.
   1. לפעמים תאים עשויים שלא להיות ממוקדים כראוי. במקרה כזה, בדקו אם קיים עיבוי (ונגבו בהתאם), הצלחת מוגדרת כראוי על המגש, או שמיקום הצלחת מצוין נכון וכו'. אם התאים עדיין צפים ולא התיישבו לתחתית הבאר, המתינו כ-5 דקות לפני הסריקה.

3. הגדרת הגדרת הניתוח לכימות NETs

1. פתח את המחקר (כלי) לניתוח בכרטיסיה תצוגה. לחץ על הפעל ניתוח בצד שמאל של המסך. בחר צור הגדרת ניתוח חדשה.
   1. אם ניתוח בוצע בעבר, השתמש באותה הגדרת ניתוח עם שינויים קלים על-ידי בחירה באפשרות העתק הגדרת ניתוח קיים. במקרה זה, עבור לשלב 3.3. אם אתה משתמש בניתוח ללא כל שינוי, בחר השתמש בהגדרת ניתוח קיים; זה לא מומלץ כי רמת פלואורסצנטיות עשויה להשתנות בין בדיקות בימים שונים, וכמה תיקונים קלים הם בדרך כלל הכרחיים.
2. בחר Basic Analyzer. השתמשו בכל ערוצי התמונה: פאזה, ירוק, אדום וחפיפה.
   הערה: למרות שאנו משתמשים בדרך כלל במסיכות עצם ירוקות ואדומות כדי לספור רשתות, מסיכת אובייקט חפיפה שימושית כאשר יש חשיבות לכלוך. במקרים כאלה, מספר ספירת האובייקטים החופפים ישמש כמונה במקום ספירת אובייקטים ירוקים (ראה שלב 3.9). אם נעשה שימוש בספירת אובייקטים חופפים במקום בספירת אובייקטים ירוקים, יש לספור כראוי את כל האותות האדומים. התאם את הגדרת האות האדום כדי לספור את כל העצמים האדומים עם אות אדום נמוך בתמונות שצולמו בנקודות זמן מאוחרות יותר, אך לא כדי לספור פסולת.
3. בחר 6 - 8 תמונות מדגם מייצג לאימון. עבור הניסוי כאן, כלול את התמונות הבאות:
   תמונות שצולמו בין 0 ל-20 דקות כדי למטב את הגדרת האות הירוק כדי לפצות על אותות ירוקים עדינים שיכולים להיווצר בנויטרופילים שאינם יוצרי NET
   תמונות של מקסימום רשתות עם שליטה חיובית, שצולמו בין 3-6 שעות (הזמן משתנה בהתאם לגירוי שבו נעשה שימוש) כדי למטב את הגדרת האות הירוק להגדרת נויטרופילים יוצרי NET
   תמונות שצולמו סביב נקודת הזמן של שעה אחת כדי לספור את מספר התאים הכולל (מוכתמים בצבע אדום) מכיוון שהאות האדום הגרעיני הוא החזק ביותר סביב נקודת זמן של שעה אחת (כאשר כל התאים התיישבו לתחתית הבאר) ופוחת בהדרגה עקב מוות תאי.
   תמונות המכילות פסולת, כדי לא לכלול אותן בספירה.
4. הגדר את הגדרת הניתוח. עצמים אדומים ועצמים ירוקים מקבילים לגרעינים של כל הנויטרופילים ואלה היוצרים רשתות, בהתאמה. התחל עם הדוגמה הבאה של והקש Preview Current או Preview All, ומווסת כל פרמטר כדי למטב את התוצאות:
   לירוק: סגמנטציה- חיסור רקע: כובע עליון; רדיוס: 100 מיקרומטר; סף: 0.3 GCU; פיצול קצוות: מופעל; רגישות קצה: -20; ניקוי -מילוי חור: 100 מיקרומטר²; התאמת גודל 0 פיקסלים; מסננים- שטח: מינימום 20 מיקרומטר², מקסימום 500 מיקרומטר²; אקסצנטריות: מקסימום 0.97; עוצמה ממוצעת: מינימום 1.00
   לאדום: סגמנטציה- חיסור רקע: כובע עליון; רדיוס: 10 מיקרומטר; סף: 1.0 GCU; פיצול קצוות: מופעל; רגישות קצה: -50; מילוי חור ניקוי: 50 מיקרומטר²; התאמת גודל 0 פיקסלים; מסננים- שטח: מינימום 20 מיקרומטר², מקסימום 400 מיקרומטר²; עוצמה ממוצעת: מינימום 1.5.
   1. אם אות ירוק מוגזם מופיע בנויטרופילים שלא אמורים ליצור NETs (למשל, נויטרופילים לא מגורה ב-0 דקות שיש להם גרעינים מאוגדים), זה יכול להיות בגלל הצפה של האות האדום שזוהה בתעלה הירוקה. במקרה כזה, חזור לשלב 3.1, פתח שכבות תמונה בצד שמאל של המסך והסר את האותות האדומים מהערוץ הירוק באמצעות ביטול ערבוב ספקטרלי.
   2. אפשרות נוספת היא להגדיר היטב אחת להכתמה בודדת עם צבע אדום גרעיני כדי להבהיר כמה מהאות האדום יש להסיר מהערוץ הירוק. מצד שני, בדרך כלל אות ירוק מדמם לתוך הערוץ האדום אינו משפיע על הניתוחים.
      הערה: אין זה משנה אם הרגישות לאות אדום נמוכה ולא כל האותות האדומים נלכדים בתמונות שצולמו בנקודות זמן מאוחרות יותר (לדוגמה, נקודת זמן של 6 שעות). המספר המרבי של ספירת עצמים אדומים בכל תמונה נחשב למספר הכולל של נויטרופילים בתמונה וישמש כמכנה בשלב 3.9. בדרך כלל, אותות אדומים גרעיניים מגיעים לשיא בסביבות נקודת זמן של שעה אחת ופוחתים בהדרגה עקב מוות תאי (איור 1B). לכן, התאם את הגדרת האות האדום כדי לספור כראוי אובייקטים אדומים בתמונות עם אותות אדומים מרביים.
5. בחר זמני סריקה ובארות לניתוח. בדרך כלל, יש לנתח את כל נקודות הזמן והבארות. ספק תווית להגדרת הניתוח.
6. בדוק את הסיכום והפעל את הניתוח. זה לוקח כמה שעות להשלמת הניתוח (משך תלוי במספר נקודות זמן בארות). לאחר ההשקה, שם הגדרת הניתוח יוצג תחת שם המחקר בכרטיסיה תצוגה, והתאריך המלא יוצג בסיום.
7. לאחר השלמתו, פתח את המחקר המנותח על ידי לחיצה כפולה על שם הגדרת הניתוח. פתחו את האפשרות 'שכבות ' בצד שמאל של המסך ובדקו אם כל תא מסומן כהלכה. אם הוא אינו מסומן כראוי, חזור לשלב 3.1 וחזור על השלבים הבאים.
8. לחץ על מדדי גרף בצד שמאל של המסך כדי לייצא את הנתונים. בחרו 'ספירה ירוקה', 'ספירה אדומה ' או 'ספירת חפיפה' (לפי תמונה) ובחרו בנקודות הזמן ובבארות שייוצאו. לקיבוץ נבחר, בחר Plate Map Replicates אם כל הבארות צוינו כהלכה בסיום הסריקה.
9. יצא את הנתונים. חשב את אחוז התאים יוצרי NET עבור כל תנאי/נקודת זמן לפי המשוואה הבאה באמצעות תוכנה מתאימה.
   
   הערה: הסיבה לכך שהמכנה הוא ספירת עצמים אדומה מקסימלית היא שמספר העצמים האדומים מגיע לשיא בסביבות נקודת זמן של שעה אחת ויורד בהדרגה עקב מוות תאי.

שיטה זו מספקת ניגודיות פאזה, תמונות פלואורסצנטיות אדומות (צבע חדיר לממברנה) וירוק פלואורסצנטי (צבע אטום לממברנה) שצולמו בכל נקודת זמן. יחד עם תהליך יצירת NET, שינויים מורפולוגיים נצפים בניגודיות פאזה ובתמונות פלואורסצנטיות אדומות, וברגע שהקרום נפרץ, ניתן לראות פלואורסצנטיות ירוקה (איור 1). בניסוי זה, נויטרופילים יוצרי NET הם בדרך כלל עגולים, במקום ליצור מבנה דמוי רשת. הסיבה לכך היא שהרזולוציה של המכונה אינה גבוהה מספיק כדי ללכוד מבנה דמוי רשת עדין וצבע ירוק בלתי חדיר מכתים את הכרומטין לפני שהוא משתחרר ברגע שהקרום נפרץ. הראינו בעבר7 כי ניתן להמחיש NETs באמצעות הדמיה קונפוקלית בלוחות 96 בארות שאוחזרו לאחר דגירה של 4 שעות.

כאשר הגדרת הניתוח מוגדרת כראוי, כל הנויטרופילים בתמונה מסומנים כעצם אדום ונויטרופילים יוצרי NET מסומנים כעצם ירוק (איור 2). המכונה סופרת את מספר העצמים האדומים והירוקים בכל נקודת זמן. מסלול הזמן של היווצרות NET מומחש על-ידי התוויית אחוז הנויטרופילים יוצרי NET בכל נקודת זמן (איור 3). מולקולות פוטנציאליות המכוונות להיווצרות NET (למשל, מעכב AKT) עשויות להיבדק באופן תפוקה גבוהה באמצעות מתודולוגיה זו.

איור 1: שינויים מורפולוגיים בנויטרופילים שעוברים היווצרות רשת. (A) נויטרופילים מדם היקפי אנושי שעוררו ביונופור סידן של 2.5 מיקרומטר במשך 3 שעות. (B) תצוגות מייצגות של תא בודד של תמונת ניגודיות פאזה, תעלה אדומה (צבע גרעיני חדיר לממברנה), תעלה ירוקה (צבע DNA בלתי חדיר לקרום) ותמונה ממוזגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות מייצגות המציגות זיהוי תוכנה של נויטרופילים ורשתות מידע. נויטרופילים ממתנדבים בריאים אנושיים עוררו עם 2.5 מיקרומטר סידן יונופור במשך שעה אחת. מוצגות תמונות בשכבת-על של הדמיית ניגודיות פאזה וכל אות או מסיכה. גרעינים הוכתמו בצבע אדום (A) חדיר לקרום, והתוכנה זיהתה וספרה (B) גרעינים שסומנו בכחול בעוד שהגרעינים הוכתמו ב-(C) בצבע ירוק אטום לקרום והתוכנה סימנה אותם כ-(D) סגול. אם (E) חישת יתר או (F) תחת חישה מתרחשת, ייתכן שיהיה צורך לשנות את הפרמטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מהלך הזמן של אחוז הנויטרופילים יוצרי NET. נויטרופילים עוררו על ידי 25 ננומטר פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA) או 2.5 מיקרומטר סידן יונופור כדי לגרום ל-NETs או נותרו ללא גירוי בסל"ד. תוספת של מעכב AKT 30 מיקרומטר נעשתה כדי לחסום היווצרות NET. התמונות הושגו על ידי התוכנה כל 20 דקות במשך 6 שעות. אחוז התאים יוצרי NET חושב על ידי חלוקת ספירת העצמים הירוקים (= מספר התאים יוצרי NET) בספירת העצמים האדומים (= מספר כל הנויטרופילים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.