מאמר שיטה

יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

DOI:

10.3791/66077

⸱

11 באפריל 2025

 ,  , 
1Department of Life Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences, 2Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ככל שפרוטוקולים הקשורים לקריספר הופכים שימושיים ונגישים יותר ויותר, סיבוכים ומכשולים עדיין יכולים להיווצר בתנאי ניסוי ספציפיים. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של קו תאים אנושיים נוקאאוט של סרין/תראונין-חלבון קינאז 1 (RIPK1/RIP1) באמצעות CRISPR/Cas9 ומדגיש אתגרים פוטנציאליים בהם נתקלים במהלך תהליך זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר נוהל להשמדת הגן RIP1 באמצעות CRISPR/Cas9 בקו תאי המונוציטים האנושיים U937. השיטה משתמשת בפלסמידים ייעודיים של RNA מדריך ופלסמידים של אריזות לנטי-ויראליות כדי להשיג נוקאאוט של הגן RIP1. הפרוטוקול מתמודד עם אתגרים ושיפורים בשיטות הקריספר המסורתיות, ומאפשר את שכפולו למחקרי מוות תאי עתידיים. ניתן להשתמש בתאים המוטנטיים המתקבלים כדי לחקור שינויים מכניסטיים במוות תאי, כאשר חלבוני RIP1 פונקציונליים היו ממלאים תפקיד אחרת. מבחני כדאיות הראו ירידה משמעותית במוות התאים בתאי נוקאאוט לאחר השראת נקרופטוזיס. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חשפה ירידה ניכרת במיני חמצן תגובתי מיטוכונדריאלי (ROS) בתאי נוקאאוט באותם תנאים. יחד, מבחנים פונקציונליים אלה מאשרים את אובדן חלבון RIP1. מותאם לשימוש עם מונוציטים אנושיים U937, הליך זה עשוי להיות מותאם גם כדי להתמקד בווסתי מוות תאים מרכזיים אחרים, ולהניב מוטציות פונקציונליות ולא קטלניות. מלכודות פוטנציאליות מטופלות לאורך כל הדרך כדי לספק תובנות לגבי אתגרים שעלולים להתעורר במהלך יצירת מוטאנטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנים CRISPR/Cas9 מתפתח במהירות מאז גילויה 1,2,3. היכולת לדפוק או להפיל גנים בתוך קווי תאים או חיידקים היא בעלת ערך רב להעברת מחקר והבנת מנגנונים תוך-תאיים 1,2,3,4,5,6. מערכת CRISPR-Cas9 משפרת את שיטות עריכת הגנים הקודמות, כגון נוקלאז אפקטור דמוי מפעיל שעתוק (TALEN), על ידי פישוט הנדסת הספציפיות של הגנים. הליך זה כולל שני מרכיבים בסיסיים: RNA מנחה (gRNA) המשמש לאיתור יעד הגן המיועד, ו-Cas9, שהוא אנדונוקלאז המשנה את מיקום הגנום המיועד עם שבירת DNA דו-גדילית 3,4. ה-gRNA ישמש כמדריך לאנדונוקלאז Cas9 לאתר וליזום את השבירה הדו-גדילית ברצף הגנטי המיועד באמצעות זיווג בסיסי ווטסון-קריק. התהליך המלא של עריכת הגנום על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כולל מכונות תאיות המתקנות את השברים הדו-גדיליים הללו ב-DNA באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) או רקומבינציה הומולוגית 3,7. סביר יותר ש-NHEJ יתרחש, ולמעשה ייצור מוטציה בגנום שתביא לאובדן ביטוי לגן המטרה 3,4.

מקורות מסחריים הצליחו ליצור ספריות של מטרות gRNA שניתן לבטא באמצעות גידול ובידוד חיידקים, מה שמשפר משמעותית את קלות השימוש בהם. עם זאת, המגבלה העיקרית של מערכת CRISPR/Cas9 היא הקושי להעביר את קומפלקס ה-gRNA וה-Cas9 לשורות תאי המטרה. מגבלות אלו מתעוררות בקווי תאי השעיה, מכיוון שהם מכונים בדרך כללקשים להעברה 8. שיטות טרנספקציה טיפוסיות אינן יעילות בדרך כלל בהעברת מערכת CRISPR/Cas9 לתאי תרחיף, וזו הסיבה ששיטות העברה ויראליות כמו טרנספקציה וטרנסדוקציה לנטי-ויראליות מתאימות יותר לסוג זה של קו תאים 8,9.

סוג זה של טרנספקציה דורש וקטור לנטי-ויראלי המקודד את ה-gRNA ואנדונוקלאז Cas9 יחד עם תוספת פלסמידים של אריזות לנטי-ויראליות, המועברות לקו תאים המסוגל לייצר חלקיקים לנטי-ויראליים. קו תאים שנבחר בדרך כלל לתהליך זה הוא תאים HEK293T, מכיוון שהם קלים יותר להעברה ועובדים ביעילות רבה בהרכבה של gRNA ו-Cas9 9,10. חלקיקים אלה משתחררים לאחר מכן כ-lentiviruses לתוך ה-supernatant, שניתן להשתמש בהם כדי להמיר את ה-gRNA ו-Cas9 לקו תאי ההשעיה המיועד, כגון מונוציטים אנושיים U937. ככזה, ההליך המתואר כאן כולל את השינויים הבאים בהשוואה לשיטות מבוססות: (1) שיטת טרנספקציה חלופית עבור קווי תאים קשים לטרנספט; (2) אין צורך לרכז DNA פלסמיד CRISPR או להשתמש באולטרה-צנטריפוגה; ו-(3) זה מבטל את הצורך בשיבוט תא בודד.

המוקד הישיר של מאמר זה היה להפיל את הגן RIP1 במונוציטים אנושיים U937. הצורה הקאנונית של נקרופטוזיס מסלול מוות תאי דלקתי מאוד נשלטת על ידי RIP1, המשמש כמטרה מרכזית למחקרי מוות תאי. 11,12,13,14 כאשר RIP1 הופך לפעיל באמצעות אוטופוספורילציה, הוא מגייס וגורם לזרחון ישיר והפעלה של סרין/תראונין-חלבון קינאז 3 (RIPK3/RIP3) ופסאודוקינאז דמוי תחום קינאז (MLKL) ליצירת הנקרוזום. בעקבות היווצרות זו, הנקרוזום חופשי לנוע ברחבי התא כדי לקיים אינטראקציה עם אברונים כמו המיטוכונדריה12,13. במיטוכונדריה, RIP1 מגביר לולאת משוב חיובית עם חילוף החומרים התאי, ומשפיע ישירות על ייצור ROS מיטוכונדריאלי, אשר בתורו מקדם אוטופוספורילציה נוספת של RIP1, היווצרות נמקוזומים וביצוע במורד הזרם של נקרופטוזיס 11,12,13,14.

בעוד שקבוצת המחקר הנוכחית מתמקדת בתפקידו של RIP1 במוות תאי, סיבות אחרות לחקור את RIP1 כוללות את תפקידיו בדלקת וזיהום. עם הפעלה על ידי קולטני מוות כגון קולטני TNF, RIP1 מקדם את הפעלת מסלול האיתות NF-κB, המפעיל שעתוק של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כימוקינים ומולקולות אחרות החיוניות לגיוס תאי חיסון ולהגברת התגובה הדלקתית15. בנוסף להפעלת NF-κB, RIPK1 יכול גם להפעיל מסלולי איתות MAPK, מה שמגביר עוד יותר את הדלקת15,16. באשר לתפקידו בתגובות לזיהום, RIP1 פועל כמתווך מרכזי של התגובה הדלקתית של המארח, במיוחד בתגובה לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs) המזוהים על ידי קולטני זיהוי דפוסים (PRRs) כגון קולטנים דמויי אגרה (TLRs)17. יתר על כן, במהלך אלח דם, RIP1 מופעל על ידי איתות דרך קולטני מוות כגון קולטן TNF, מה שמוביל להתחלת מפלים פרו-דלקתיים. RIPK1 מתווך את הפעלת מסלולי NF-κB ו-MAPK, ומקדם ייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α, IL-1β ו-IL-6, שהם מניעי מפתח לתגובה הדלקתית המערכתית האופיינית לאלח דם18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצוג סכמטי של ההליך מסופק באיור 1. RNA מנחה (gRNA) ורצף היעד ניתנים בטבלה 1. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. קציר של וקטור ביטוי לנטי-ויראלי של CRISPR gRNA המכוון ל-RIP1 המכיל אנדונוקלאז Cas9 ועמידות לפורומיצין מ-Escherichia coli

  1. E. coli עם פס רבוע המכיל gRNA וקטורי לנטי-ויראליעל לוחות אגר LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
  2. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עד שמושבות בודדות נראות באזור המדולל ביותר בצלחת.
  3. בחר מושבה בודדת עם לולאה סטרילית והוסף בנפרד כל מושבה ל-5 מ"ל מרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. הקפד לפיפטה ביסודיות למעלה ולמטה לאחר הוספת המושבה הבודדת כדי להבטיח הומוגניזציה.
  4. אוורור והדביק את מכסה הצינור החרוטי בנפח 50 מ"ל ודגירה בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך 8 שעות.
  5. במהלך הדגירה של 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, הוסף 40 מ"ל של מרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין לכל אחד מארבעת צינורות חרוטיים נפרדים של 50 מ"ל.
  6. לאחר הדגירה של 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, יש ליטול 40 מיקרוליטר של מזרח מזרחי שגדל.תרבית קולי והוסף אותה לכל ארבעת הצינורות החרוטיים של 50 מ"ל.
  7. אוורור והדביק את המכסים של הצינורות החרוטיים בנפח 50 מ"ל ודגר אותם בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך 12-16 שעות.
  8. לאחר הדגירה הזו ב-37 מעלות צלזיוס, סובבו את כל הצינורות ב-3220 x גרם ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות כדי לגלול את חיידקי ה-E. coli הגדלים.
  9. שפכו סופרנטנטים לכוס פסולת, ואז שלבו את כל ארבעת הכדורים ב-10 מ"ל של מרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
  10. סובב שוב את הכדורים המשולבים במהירות מקסימלית ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות כדי לקבל כדור יחיד.
  11. השליכו כמה שיותר מהסופרנטנטים לכוס הפסולת, והמשיכו באחת מהאפשרויות הבאות: (1) הקפיאו את הכדור הרטוב בטמפרטורה של -80 מעלות למשך עד חודש. (2) המשך בטיהור פלסמיד וקטור לנטי-ויראלי.
    הערה: אם בוחרים באפשרות 1, ייתכן שהפרוטוקול יושהה כאן.

2. טרנספקציה של תאים HEK293T עם וקטור ביטוי לנטי-ויראלי מטוהר של CRISPR gRNA המכוון ל-RIP1

  1. זרע HEK293T תאים למשך הלילה בריכוז של 3 × 106 עד 5 × 106 תאים לצלחת בגודל 10 ס"מ המכילה DMEM עם 4.5 גרם / ליטר D-גלוקוז, L-גלוטמין, 110 מ"ג / ליטר נתרן פירובט ו- 10% FBS מומת חום.
  2. למחרת, ודא שללוחיות יש מפגש של כ-70%-90%, ולאחר מכן המשך עם הפרוטוקול.
  3. הגדר את הטרנספקציה של התאים עם יחס של 1:1:1:1:1 של פלסמידים (פלסמיד CRISPR ניסיוני: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) באמצעות מגיב הטרנספקציה ביחס של 3:1 (מגיב 3 חלקים: 1 חלק DNA פלסמיד), יחד עם מדיום סרום מופחת.
    הערה: החלק pLP1: pLP2: pLP/VSVG של היחס הוא תערובת אריזה לנטיויראלית.
    1. איזון מגיב הטרנספקציה, מדיום סרום מופחת, DNA פלסמיד CRISPR ותערובת אריזות לנטי-ויראליות לטמפרטורת החדר לפני הגדרת הטרנספקציה.
    2. מערבבים יחד 75 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה, 2500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ו-25 מיקרוגרם DNA כולל (חישוב מבוסס על ניתוח ספקטרופוטומטר עבור DNA פלסמיד CRISPR ויחס של 1:1:1:1 עם תערובת אריזה לנטיויראלית).
    3. הניחו לתערובת זו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. פיפטה בזהירות את כל נפח התערובת הזו ללוח התא HEK293T המפגש ישירות לתוך המדיה (אין צורך להחליף מדיה).
  4. סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח הומוגניזציה נאותה של תערובת הטרנספקציה ואמצעי הצלחת. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

3. התמרה לנטיוויראלית של תאי U937 או תאי מטרה

  1. לאחר השלמת הדגירה של 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס , העבירו את המדיה מלוח התא HEK293T היצרן לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה בנפח 800 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את כל תאי HEK293T שנותרו. הסר את כל הסופרנטנט המכיל נגיף, הקפד לא להפריע לתאי HEK293T הכדורים, ושמור אותו בצינור חרוטי נפרד של 15 מ"ל. לאחר מכן, יש לטהר ולהשליך את הצינור המכיל גלולה במיכל הפסולת הביולוגית המתאים.
    הערה: ניתן לאחסן סופרנטנטים מבוססי HIV בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס; עם זאת, פעולה זו טומנת בחובה סיכון של עד 55% אובדן יציבות הנגיף לאחר מחזור ההקפאה/הפשרה הראשון19.
  3. ספרו והשיגו כדור של 2 × 106 תאי U937 בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה בנפח מתאים ב-400 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושפכו את הסופרנטנט, והשאירו את כדור התא בצינור.
  4. השעו מחדש את כדור התא U937 עם כל הסופרנטנט המכיל וירוס ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב-290 x גרם למשך 60 דקות.
  5. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הכדור עם הסופרנטנט המכיל וירוס שכבר נמצא בצינורית.
  6. הנח את הצינור על מסובב קצה קצה (או מכשיר מסתובב דומה) למשך 60 דקות.
    1. לאחר הדגירה הזו, צנטריפוגה את הצינורות ב-400 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים.
    2. יש להשעות מחדש את גלולת התא עם תערובת מדיה ביחס של 1:1 של סופרנטנטים המכילים וירוסים ומדיה מלאה של RPMI-1640 בתוספת FBS מושבת חום של 10%.
  7. מעבירים את תערובת התאים לצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  8. לאחר הדגירה הזו, צנטריפוגה את תאי U937 ב-400 x g למשך 10 דקות והסר את הסופרנטנט.
    1. השעו מחדש את הגלולה עם מדיה מלאה של RPMI-1640 בתוספת 10% FBS מומת בחום ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של פורומיצין והעבירו את התאים לבקבוק T25.
    2. דגרו על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא מגע במשך 2-3 שבועות, והקפידו לבדוק אותם כל 1-2 ימים לאיתור סימני צמיחת תאים.
      הערה: ברגע שהתאים הופכים למתכנסים ויש להם זמן תחלופה בריא לאחר מעבר ראשוני, ניתן לבדוק את יעילות הפרוטוקול שהושלם.

4. בדיקת יעילות הפרוטוקול המושלם ביצירת תאים מוטנטיים RIP1 CRISPR באמצעות ניתוח כתמים מערביים

  1. ליצור ליזטים של חלבון תאי של מונוציטים U937 מסוג בר (WT), תאי CRISPR לא מכוונים (NTC) ותאי מוטציה RIP1 CRISPR 11,12,13.
  2. הפעל את הליזטים הללו על ג'ל SDS-PAGE והמשך בניתוח כתמים מערביים14.
    1. נרמל תחילה דגימות לחלבון משק בית.
    2. לאחר הנורמליזציה, נתח דגימות לרמות ביטוי חלבון RIP1 כדי לקבוע כראוי את ההצלחה של יצירת קו תאים מוטנטי RIP1 CRISPR14.
  3. בעקבות קונפורמציה של ניתוח כתמים מערביים, ניתן להשתמש בתאים למטרות ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות ייצור אוכלוסייה משולבת של תאי U937 מוטנטיים RIP1 CRISPR, בוצעו ניתוח SDS-PAGE וכתמים מערביים. ניתוח הכתם המערבי שימש לקביעת היצירה המוצלחת של קו תאים מוטנטי RIP1 CRISPR על ידי הערכת אובדן רמות ביטוי חלבון RIP1. קביעה זו נעשתה על סמך התוצאה ההשוואתית של מונוציטים WT U937 ותאי NTC. באיור 2, הביטוי של RIP1 לא זוהה עבור תאי המוטציה של 5 מיקרוגרם/מ"ל puromycin RIP1 CRISPR , אך זוהה הן עבור תאי WT U937 והן עבור תאי NTC. תוצאה זו מדגימה כי פרוטוקול זה הוא שיטה אמינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד לספק הדרכה מפורטת וניתוח של מלכודות פוטנציאליות ביעילות ובאמינות של טרנספקציה והתמרה לנטי-ויראלית ליצירת קו תאים נוקאאוט U937 של RIP1. למרות ששיטה זו של טרנספקציה והתמרה היא עתירת עבודה וזמן, היא נחשבת בדרך כלל לדרך יעילה לשלב את ה-gRNA והאנדונוקלאז Cas9 שנבחרו בשורות תאים קשות להעברה 8,9,20. כמו במקרה של מונוציטים כמו תאי U937 ותאי חיסון אחרים, קיים קושי מובנה בביצוע ט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), מענק מספר NIH 2R15-HL135675-02 ל-T.J.L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום DMEM מותאםג'יבקו11995-040
אמפיציליןסיגמאא 1593
ביסבנזמיד הוכסט 33342 טריהידרוכלורידסיגמאB2261
RPMI-1640 בינוני שלםסיגמא₪1,200
CRISPR NTC gRNA E.coli Strainטרנס-אומיקTELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli זןטרנס-אומיקתה-1162203
מסובב מקצה לקצהתרמו סיינטיפיק
מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS FLטכנולוגיות חיים
ערכת GenElute Plasmid MaxiprepסיגמאPLX15
נוגדן IgG נגד ארנב עיזים, (H+L) מצומד HRPסיגמאAP307P
HEK293T תאיםATCC
אינקובטור שייקרניו ברונסוויק סיינטיפיק
LB אגרב.ד.244520
מרק LBב.ד.244610
תערובת אריזות LV-MAX Lentiviralג'יבקוא43237
אדום MitoSOXMedChemExpressHY-D1055
ספקטרופוטומטר NanoDropתרמו סיינטיפיק
נקרוסטוטין-1MedChemExpressHY-14622א
אופטי-מםג'יבקו31985-062
פורומיציןסיגמאעמ' 7255
ארנב אנטי אנושי RIP1 mAbטכנולוגיית איתות תאים3493
ציוד SDS-PAGE ו-Western Blotביוראד
TNF ואלפא;MedChemExpressHY-P7058
U937 מונוציטים אנושייםATCC
מערכת בדיקת התפשטות תאים WST-1טקארהMK400
X-tremeGENE 9 מגיב טרנספקציה של DNAרוש דיאגנוסטיקס6365779001
z-VAD-FMKAPExBIOא1902

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gostimskaya, I. CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing. Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. What is CRISPR/Cas9. Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).
  5. Ebrahimi, S., et al. In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis. Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).
  6. Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization. Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).
  7. Lim, J. M., Kim, H. H. Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing. Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).
  8. Han, X., et al. CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation. Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).
  9. Sano, S., et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. (152), e59977(2019).
  10. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).
  11. Mccaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Dis. , 1-14 (2018).
  12. Deragon, M. A., et al. Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis. Cell Death Dis. 6 (1), (2020).
  13. Deragon, M. A., et al. Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis. Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).
  14. LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis. J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).
  15. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  16. Yang, Y., et al. A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage. Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).
  17. Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions. Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).
  18. Liu, X., et al. RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond. Front Immunol. 14, 1114103(2023).
  19. Kowolik, C. M., Yee, J. -K. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).
  20. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165(2021).
  21. Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. Transfecting Macrophages. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).
  22. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo. models. 159 (147), (2015).
  23. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).
  24. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).
  25. Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RIP1 KnockoutCRISPR Cas9U937 CellsGene KnockoutLentiviral PackagingGuide RNACell DeathNecroptosis InductionFluorescence MicroscopyReactive Oxygen Species

מאמרים קשורים