התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים

מודלים תלת-ממדיים של תרביות חוץ גופיות, המספקים יותר מאפיינים מבניים ומורפולוגיים דמויי vivo בהשוואה למודלים קונבנציונליים של תרביות דו-ממדיות, הוכרו כמערכות מבטיחות ביישומים ביו-רפואיים שונים כגון הנדסת רקמות, מידול מחלות וסינון תרופות ^1,2,3. כסוג אחד של מודל תרבית תלת-ממדי, ספרואידים של תאים מתייחסים בדרך כלל לצבירת תאים, ויוצרים מבנים ספרואידים תלת-ממדיים המאופיינים באינטראקציות משופרות בין תא לתא ולמטריצה התאית ^4,5,6. לכן, ייצור ספרואידים של תאים הפך לכלי רב עוצמה המאפשר מחקרים ביולוגיים מגוונים.

טכניקות שונות, כולל טיפה תלויה⁷, לוחות לא דביקים⁸, או מכשירי מיקרווול⁹, פותחו כדי להשיג ספרואידים. באופן עקרוני, שיטות אלה בדרך כלל מקלות על הרכבת תאים על ידי ניצול כוחות פיזיקליים כגון כוח כבידה תוך מזעור אינטראקציות בין התאים למצע. עם זאת, לעתים קרובות הם כרוכים בתהליכים עתירי עבודה, בעלי פרודוקטיביות נמוכה, ומציבים אתגרים לשליטה בגודל^{הספרואיד 10,11}. חשוב לציין, ייצור ספרואידים בגודל ובאחידות הרצויים בכמות מספקת הוא בעל חשיבות עליונה כדי לספק יישומים ביולוגיים ספציפיים. בניגוד לשיטות שהוזכרו לעיל, גלים אקוסטיים, כסוג אחד של טכניקה מונעת כוח חיצוני 12,13,14, הראו פוטנציאל לייצור המוני של ספרואידים תאים באיכות ובתפוקה גבוהות, בהתבסס על העיקרון של שיפור צבירת תאים באמצעות כוחות חיצוניים 15,16,17,18. שלא כמו כוחות אלקטרומגנטיים או מגנטיים, טכניקות מניפולציה של תאים מבוססות אקוסטיקה אינן פולשניות ונטולות תוויות, ומאפשרות היווצרות ספרואידים עם תאימות ביולוגית מצוינת^19,20.

בדרך כלל, התקנים מבוססי גלים אקוסטיים של משטח עומד (SAWs) וגלים אקוסטיים בתפזורת (BAWs) פותחו כדי ליצור ספרואידים, תוך ניצול הצמתים האקוסטיים (ANs) המיוצרים על ידי שדות אקוסטיים עומדים תואמים 21,22,23. במיוחד, התקני הרכבה אקוסטית המבוססים על BAWs, עם היתרונות של ייצור נוח, הפעלה קלה ומדרגיות מעולה, זכו לתשומת לב לייצור ספרואידים תא^24,25. לאחרונה פיתחנו מכשיר הרכבה אקוסטית מבוסס BAWs עם היכולת לייצר ספרואידים עם תפוקה גבוהה²⁶. המכשיר המוצע מורכב מתא פולימתיל מתקרילט ריבועי (PMMA) עם שלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT) המסודרים בהתאמה במישור X/Y/Z. סידור זה מאפשר יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מורחפים (LANs) להנעת הרכבת תאים. בהשוואה להתקנים מבוססי BAW או SAWs שדווחו בעבר, אשר יכולים ליצור רק מערך 1D או 2D של ANs 27,28,29, המכשיר הנוכחי מאפשר מערך נקודות תלת-ממדי של רשתות LAN ליצירת צבירת תאים מהירה בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA). לאחר מכן, צברי תאים הבשילו לספרואידים עם כדאיות גבוהה בתוך פיגומי GelMA פוטוריפו לאחר שלושה ימים של גידול. לבסוף, מספר רב של ספרואידים בגודל אחיד הושגו בקלות מפיגומים GelMA עבור יישומים במורד הזרם.

1. ייצור התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית

1. התחל על ידי הכנת ארבע יריעות PMMA בעובי 1 מ"מ באמצעות חיתוך לייזר³⁰, ולאחר מכן להמשיך להדביק אותם יחד כדי ליצור תא מרובע עם רוחב פנימי של 21 מ"מ וגובה של 10 מ"מ.
2. לאחר מכן, חברו יריעת PMMA נוספת בעובי 1 מ"מ לתחתית התא כדי לשמש כמחזיק לדיו הביולוגי.
3. הצמידו בזהירות שלושה מתמרי עופרת זירקונט טיטנאט (PZT) (כל אחד באורך 20 מ"מ, רוחב 10 מ"מ, עובי 0.7 מ"מ ובתדר תהודה ראשוני של 3 מגה-הרץ, ראו טבלת חומרים) לחלק החיצוני של שלושת הקירות האורתוגונליים של החדר, בהתאמה. ודא שמתמר PZT התחתון ממורכז מתחת לתא.
4. חוטי הלחמה לשני האזורים המוליכים של כל מתמר PZT.
5. לבסוף, אבטחו את המכשיר על בסיס חלול כדי למנוע מה-PZT התחתון לבוא במגע עם משטחי עבודה אחרים.

2. הקמת מערכת הרכבה אקוסטית

1. התחילו בהרכבת המכשיר האקוסטי על במת מיקרוסקופ, המאפשרת תצפית מלמעלה על פנים החדר.
2. מקם מיקרוסקופ דיגיטלי בצד המכשיר ללא מתמרי PZT, המאפשר תצפית צידית על פנים התא.
3. חבר באופן עצמאי את החוטים משלושת מתמרי PZT בסדרה לשלושה מגברי הספק ולשלושה ערוצי פלט של מחוללי פונקציות (ראה טבלת חומרים).
4. תכנת את ההגדרות על מחוללי הפונקציות עבור כל מתמר PZT, תוך ציון פרמטרים כגון צורת גל סינוסואידית, תדר ומשרעת.
5. כדי להבטיח עיקור, מלא את התא של המכשיר האקוסטי עם 75% אלכוהול במשך 5 דקות, ולאחר מכן ניקוי יסודי עם פתרון PBS סטרילי. לאחר מכן, להקרין את החדר עם אור UV בספסל נקי במשך מינימום של 1 שעות.

3. תרבית תאים והליך הקציר

1. התחל בגידול תאי C3A, קו תאי קרצינומה הפטוצלולרי אנושי, בבקבוק תרבית תאי T25 באמצעות מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים).
2. כאשר תאי C3A מגיעים למפגש של כ-80%, בצעו מעבר תאים באופן הבא: ראשית, שטפו את תחתית בקבוק התרבית פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק תרבית התאים ודגרו בטמפרטורה של 37°C כדי להקל על ניתוק התא. עצור את תהליך הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם.
3. העבר את תמיסת התא לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה התא.

4. הכנת הביו-דיו

1. הכינו תמיסת GelMA 6% (w/v) המכילה 0.5% (w/v) ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) על ידי המסת 0.3 גרם GelMA ו-0.025 גרם LAP (ראו טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של תמיסת חיץ פוספט (PBS). הניחו לתערובת לשבת באמבט מים בטמפרטורה של 47°C למשך שעה אחת.
2. לפני ערבוב עם תאים, להעביר את תמיסת GelMA דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) לעיקור.
3. השהה מחדש את גלולת התא שהוזכרה לעיל (שלב 3.3) בתווך תרבית התא. צבעו נפח קטן של תאים בתמיסת טריפאן כחולה של 0.4% ולאחר מכן השתמשו בהמוציטומטר נקי לספירת תאים.
4. ערבבו כמות מתאימה של תאי C3A, המחושבת על בסיס צפיפות התאים שהתקבלה לעיל, עם תמיסת GelMA מעוקרת להכנת הביודיו עם צפיפות תאים של 2 × 10⁶ תאים / מ"ל.
5. להדמיה של כדורי התאים שהורכבו, הכתימו מראש את תאי C3A על ידי דגירה שלהם עם מעקב תאים של 2 מיקרומטר (צבע DiO, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים המסומנים בתרבית תאים טרייה שלוש פעמים לפני השימוש.

5. הרכבת כדורי התא באמצעות המכשיר האקוסטי

1. פיפטה יותר מ 1 מ"ל של bioink לתוך החדר מעוקר. ודא שהמרחק פנים אל פנים בין פני השטח הנוזליים לתחתית התא הוא כפולה שלמה של מחצית מאורך הגל האקוסטי.
   הערה: ניתן לשלוט במרחק זה על-ידי התאמת נפח הדיו הביולוגי שנוסף. ניתן להעריך את אורך הגל האקוסטי (λ) באמצעות הנוסחה λ = c/f, כאשר c מייצג את מהירות הקול בתווך, ו- f הוא התדר של מתמר PZT.
2. הפעל את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח כדי להתחיל את ההפעלה של כל מתמר PZT.
   הערה: מומלץ להפעיל תחילה בנפרד כל מתמר PZT כדי להשיג את התבנית התאית האופטימלית של קו מקבילי. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע טאטוא תדרים בגודל צעד של 0.001 מגה-הרץ ליד תדר התהודה העיקרי עבור כל מתמר PZT. לאחר מכן, יישמו בו זמנית את האותות האופטימליים האלה על כל שלושת מתמרי PZT כדי לקבל את התבנית התאית הצפויה של נקודות תלת-ממדיות. לפני החלת כל אות קלט, ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בדיו הביולוגי על ידי תסיסה עדינה.
3. הצליבו את הדיו הביולוגי באמצעות אור כחול (405 ננומטר, 60 mW/cm², 30 שניות) ליצירת פיגום הידרוג'ל תלת-ממדי העוטף את אגרגטי התאים שהורכבו אקוסטית. לאחר מכן, כבה את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח.
4. העבירו בזהירות את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי מהחדר לצלחת פטרי וחתכו אותו לחתיכות קטנות (למשל, 2 מ"מ × 2 מ"מ × 2 מ"מ) באמצעות סכין גילוח נקי.
5. הוסף מדיום תרבית תאים לטיפוח.
   הערה: זכור לשנות את מדיום התרבות מדי יום.

6. אחזור ספרואידים של תאים

1. התחילו בהתבוננות בהיווצרות ספרואידים בשכבות שונות של הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
2. לאחר 3 ימי תרבית, הסירו את מדיום התרבית ושטפו היטב את פיגומי ההידרוג'ל פעמיים עם PBS.
3. לדגור על הפיגומים עם יותר מ 2 מ"ל של חיץ ליזה GelMA בדילול 1: 200 עם מדיום תרבית תאים במשך 30 דקות באינקובטור התא. צעד זה נועד להמיס את פיגומי ההידרוג'ל.
4. להעביר את התמיסה מן השלב הקודם לתוך צינור ולאחר מכן צנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את גלולת הספרואיד התא.
5. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיום תרבית טרי ליישומים במורד הזרם.

7. ניתוח כדאיות ספרואידית

1. הערך את הכדאיות של כדורי תאים בתוך פיגומי ההידרוג'ל או בתוך הספרואידים שאוחזרו באמצעות ערכת צביעה חיה/מתה (ראה טבלת חומרים).
2. לדגור על הדגימות בנקודות זמן תרבית שונות עם 1 מ"ל של תמיסת PBS המכילה 1 μL של Calcein-AM ו 2 μL של Propidium יודיד (PI) במשך 15 דקות ב 37 ° C.
3. עבור דגימות בתוך פיגומים הידרוג'ל, לשטוף אותם ישירות עם PBS פעמיים. עבור ספרואידים שהוחזרו, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה ספרואידית, ולשטוף אותו פעמיים לפני התצפית.
4. התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכוד את התמונות הפלואורסצנטיות.
5. חשב את היחס בין האזור המוכתם ב- Calcein-AM לשטח הכולל המוכתם הן ב- Calcein-AM והן ב- PI באמצעות ImageJ כדי לקבוע את הכדאיות הספרואידית.

מחקר זה תכנן התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית לייצור המוני של ספרואידים תאיים. המכשיר האקוסטי כלל תא מרובע עם שני מתמרי PZT המחוברים למישור X ולמישור Y על פני השטח החיצוניים של התא ומתמר PZT אחד בתחתית התא (איור 1A,B). שלושה ערוצי פלט משני מחוללי פונקציות חוברו לשלושה מגברי כוח כדי ליצור שלושה אותות סינוסואידים עצמאיים להפעלת מתמרי PZT (איור 1C).

תדרי התהודה האופטימליים ששימשו להפעלת שלושת מתמרי PZT המחוברים למישורי X/Y/Z של התא היו 3.209 MHz, 3.283 MHz ו-3.215 MHz, בהתאמה. המשרעת האופטימלית עבור כל שלושת מתמרי PZT הייתה 10 מתח יציאה משיא לשיא (Vpp), שנמדד על ידי אוסצילוסקופ. איור 2A מדגים את מנגנון העבודה של צברי תאים שנוצרו באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית. כאשר האות מוחל, תאים מונעים לצמתים האקוסטיים תחת השפעת כוח קרינה אקוסטית (ARF). כדי להמחיש ספרואידים של תאים, התאים הוכתמו מראש עם 2 μM DiO (פלואורסצנטיות ירוקה). לאחר הרכבת תאים אקוסטיים, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצפות בצברי התאים התלת-ממדיים שהורכבו אקוסטית. צברי התאים האלה נצפו מסודרים בתבנית רגילה של מערך נקודות תלת-ממדיות עם אותות פלואורסצנטיים ירוקים אחידים (איור 2B). תצוגות עליונות שונות של תמונות עם שדות בהירים הראו גם שהאגרגטים שנוצרו בכל שכבה היו מסודרים בתבנית מערך של נקודות דו-ממדיות (איור 2C).

נצפתה צמיחה של אגרגטים של תאים בתוך ההידרוג'ל בנקודות זמן שונות. התוצאות הראו שהאגרגטים שהורכבו השתלבו בהדרגה ויצרו ספרואידים הדוקים עד היום השלישי, מלווה בעלייה בקוטר הספרואיד (איור 3A,B). צביעה חיה/מתה בוצעה כדי להעריך את הכדאיות של כדורי התא. כדאיות תאים טובה (>90%) הושגה לפני היום השלישי, בעוד שהכדאיות ירדה מעט לאחר שבוע של תרבית (איור 3C,D).

לצורך שליפת ספרואידים, נעשה שימוש במאגר GelMA lysis כדי לנתק את פיגומי ההידרוג'ל, ולשחרר את ספרואידים של תאים עטופים (איור 4A). כתוצאה מכך, לאחר שלושה ימי גידול, החתיכות הקטנות של פיגומי הידרוג'ל טופלו בחיץ GelMA lysis בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הספרואידים ששוחררו שמרו על מורפולוגיה כדורית טובה עם התפלגות גודל צרה, יחד עם ביטוי אלבומין ויכולת קיום רצויה (איור 4B-D).

איור 1: התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית. (A) תרשים סכמטי המתאר את התצוגה העליונה של התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית, המורכב מתא PMMA המחובר לשלושה מתמרי PZT. (B) תצלום המציג את התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית בפועל. (C) תצלום המראה את התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית המחובר לשני גנרטורים פונקציונליים ולשלושה מגברי הספק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אגרגטים של תאים שהורכבו באופן אקוסטי . (A) סכמטי המדגים את מנגנון העבודה של צברי תאים הנוצרים על-ידי התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדי, שבו תאים מונעים לצמתים האקוסטיים על-ידי כוח קרינה אקוסטית. (B) תמונות קונפוקליות המציגות את צברי התאים המורכבים אקוסטית בתלת-ממד מנקודות מבט שונות. (C) תמונות שדה בהיר המציגות את צברי התאים שנוצרו בשכבות שונות בתוך פיגום ההידרוג'ל. סרגל קנה המידה מייצג 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: גדילה של צברי תאים לספרואידים בתוך פיגום GelMA. (A) תמונות שדה בהיר המראות היווצרות של כדורי תאים קומפקטיים לאחר תקופת תרבית של 3 ימים. (B) כימות של גדלי הספרואידים. (C) כתמים חיים/מתים של ספרואידים בתוך פיגום ההידרוג'ל לאחר שבוע של תרבית. (D) כימות הכדאיות של כדורי התא. סרגל קנה המידה מייצג 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אחזור של ספרואידים של תאים מיוצרים אקוסטית. (A) איור המתאר את השלבים לאחזור ספרואידים של תאים שנוצרו באופן אקוסטי. (B) תמונות עם שדה בהיר המציגות את הספרואידים שאוחזרו בהגדלות שונות. סרגל קנה המידה מייצג 250 מיקרומטר. (C) ניתוח הכדאיות והפונקציונליות של הספרואידים שאוחזרו. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (D) התפלגות הגודל של הספרואידים לאחר השליפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.