Method Article

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3. בנוסף לתמיכה ב-HSCs נורמליים, מיקרו-סביבה של מח העצם יכולה גם למלא תפקיד בהתפתחות של הפרעות תאי גזע המטופויטיים כגון MDS ו-AML 7,8,9,10,11. מוטציות בתאי אוסטאו-שושלת הוכחו כמקדמות התפתחות של MDS, AML וגידולים מיאלופרוליפרטיביים אחרים 10,12,13,14.

תסמונות מיאלודיספלסטיות הן קבוצה של הפרעות טרום לוקמיות הנובעות ממוטציות בתאי גזע המטופויטיים. MDS קשור לעתים קרובות עם בלוק בהתמיינות HSC וייצור של תאים דיספלסטיים, אשר לעתים קרובות יכול להוביל לאי ספיקת מח עצם. MDS הוא הניאופלזמה המיאלואידית המאובחנת הנפוצה ביותר בארצות הברית והוא קשור לשיעור הישרדות של 3 שנים של 35%-45%15. MDS קשור לעתים קרובות עם סיכון גבוה של טרנספורמציה לוקמיה מיאלואידית חריפה. זה יכול להיות סיבוך קטלני, שכן AML נגזר MDS עמיד לרוב הטיפולים וסביר להניח להישנות. AML המתעורר דה נובו עקב טרנסלוקציות או מוטציות בגזע hematopoietic ואבות הוא גם עמיד לעתים קרובות כימותרפיה סטנדרטית16,17. מכיוון ש- MDS ו- AML הן בעיקר מחלות של קשישים, כאשר רובם מאובחנים מעל גיל 60 שנה, רוב החולים אינם כשירים להשתלת מח עצם מרפאת. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. מכיוון שהמיקרו-סביבה של מח העצם יכולה לספק תמיכה לתאים ממאירים14, הגדרת שינויים בנישת מח העצם עם התקדמות המחלה עשויה להוביל לזיהוי טיפולים חדשניים שמטרתם לעכב עיצוב מחדש של נישת הגידול. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. לשם כך, קריטי לזהות ולאפיין שינויים באוכלוסיית תאי הסטרומה של מח העצם שעשויים לספק תמיכה לתאים הממאירים.

מספר מודלים של AML ו- MDS נוצרו וניתן להשתמש בהם כדי לחקור שינויים במיקרו-סביבה של מח העצם במהלך התחלת המחלה והתקדמותה 6,1,19,20,21,22. כאן, מתוארים פרוטוקולים לזיהוי שינויים באוכלוסיית תאי סטרומה של מח העצם באמצעות מודלים מורינים של AML 6,20 המושרה רטרו-ויראלית, כמו גם מודל Nup98-HoxD13 (NHD13) הזמין מסחרית של MDS בסיכון גבוה לשינוי AML19. עכברים שהושתלו בהם תאי AML דה נובו נכנעים למחלה תוך 20-30 יום6. עכברי NHD13 מפתחים ציטופניה ודיספלסיה של מח עצם בסביבות 15-20 שבועות, אשר בסופו של דבר הופכת ל-AML, וכמעט 75% מהעכברים נכנעים למחלה בסביבות 32 שבועות. כדי לנתח את אוכלוסיות המיקרו-סביבה של מח עצם מודל מורין, עצמות נקצרות, מח עצם וקוצים עצם מתעכלים באמצעות עיכול אנזימטי, ולאחר מכן התאים מועשרים עבור CD45-/Ter119- אוכלוסיות שאינן המטופויטיות על ידי מיון מגנטי. בעוד שניתוחים דומים תוארו בעבר 11,13,22,23,24,25, הם מתמקדים לעתים קרובות במח העצם או בעצם ואינם משלבים תאים משני המקורות בניתוחים שלהם. האפיון המשולב של האוכלוסיות האלה, בשילוב עם ניתוחי ביטוי גנים, יכול לספק הבנה מקיפה של האופן שבו המיקרו-סביבה ההמטופויטית התאית מספקת תמיכה להתחלת מחלות והתקדמותן (איור 1). בעוד שהפרוטוקול המתואר להלן מתמקד במודל AML המושרה רטרו-ויראלית ובמודל MDS גנטי, ניתן להתאים אסטרטגיות אלה בקלות לחקר שינויים בנישת מח העצם של כל מודל מורין מעניין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברים גודלו והוחזקו במתקני הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי למדל MDS בסיכון גבוה, נעשה שימוש בדגם NHD13 murine19 הזמין מסחרית. במודל זה, תאי סטרומה של מח עצם מנותחים בנקבות עכברי NHD13 בגיל 8 שבועות, לפני הופעת המחלה. דה נובו AML נוצרכמתואר קודם 6,11,20. האונקוגנים המשמשים להשראת AML, כגון MLL-AF9 ו-NRas, מתויגים ב-GFP או YFP, ומאפשרים ניתוח של אוכלוסיות מח עצם GFP שאינן לוקמיות באמצעות ציטומטריית זרימה. בקצרה, נקבות עכברי C57BL/6J בנות 10 שבועות מושתלות עם תאי AML מורין GFP/YFP+, ומח העצם נקצר שבועיים לאחר ההשתלה. בעוד נקבות עכברים משמשות במחקר זה למטרות הדגמה, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם עכברים זכרים או נקבות. זה יכול להתבצע גם באמצעות עצם הירך אחת או כל העצמות הארוכות.

1. קצירת מח עצם

הערה: לפרטים על פרוטוקול נתיחת בעלי חיים, עיין בתיקון ואח' 26.

  1. נקו את הטיט והמזיק באתנול 70%, שטפו אותם עם חיץ FACS צונן (טבלה 1), והניחו אותם על קרח לקירור לפני תחילת הקציר. כמו כן, מקם חיץ MACs (טבלה 1) על הספסל כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
  2. יש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
  3. על הספסל, ריססו היטב את העכבר באתנול 70% עד שפרוותו רטובה. בעזרת מלקחיים ומספריים מעוקלים, מרימים את העור על הבטן ומבצעים שני חתכים באורך של כ-0.5 מ"מ משני צידי העכבר, לרוחב מהבטן. לאחר מכן, לבצע חתך 0.5 מ"מ דיסטלי מן הבטן. משוך מטה כדי להסיר את העור והפרווה מרגלי העכבר.
  4. מניחים מספריים בניצב לאגן, לוחצים כלפי מטה תוך משיכה למעלה על עצם הירך עם מלקחיים. ראש עצם הירך צריך להתנתק מהאגן. להפריד את עצם הירך ואת השוקה במפרק patellofemoral. מניחים את העצמות בחיץ FACS בצלחת של 6 בארות על קרח.
  5. הסר רקמות מהעצמות באמצעות רקמה ברמת מעבדה והנח את העצמות המנוקות בצלחת חדשה בת 6 בארות עם חיץ FACS טרי על קרח.
  6. הכניסו את כל העצמות למכתש עם 2-5 מ"ל של חיץ FACS כך שכל העצמות יהיו שקועות במאגר (התאימו את נפח החיץ בהתאם למספר העצמות שאתם מעבדים). מרסקים וטוחנים את העצמות באמצעות המזיק בתנועה סיבובית עד שרקמת מח העצם משתחררת.
  7. באמצעות מזרק 3 מ"ל, הומוגניזציה של מח העצם על ידי משיכה למעלה ושטיפה למטה את הנוזל מן המליטה.
  8. באמצעות מזרק 3 מ"ל, למשוך את הנוזל מן המליטה ולסנן אותו דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל על קרח. שטפו את גושי העצם/רקמה מהמסנן בחזרה למכתש עם חיץ FACS וחזרו לשלב 1.7 כדי ליצור הומוגניות ולסנן פעם נוספת. זה מהווה את חלק מח העצם.
  9. שטפו את חתיכות העצם הנותרות (קוצים) בחזרה למכתש עם חיץ FACS ושטפו אותן לתוך צינור של 15 מ"ל באמצעות מאגר FACS כדי להבטיח תפוקת תאים מרבית. זהו שבר קוצי העצם.

2. עיכול מח עצם

  1. צנטריפוגה את מח העצם ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. דקאנט והשליך את הסופר-נטנט.
  2. השהה מחדש את מח העצם ב-2 מ"ל של תערובת עיכול מח העצם (טבלה 1) והעבר אותו לצינור של 15 מ"ל. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 45 דקות על מסובב.
  3. הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סנן את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.
  4. מזלפים את התערובת ב 400 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. השהה מחדש את גלולת מח העצם ב 1 מ"ל של חיץ ליזה RBC (ראה טבלת חומרים). דוגרים במשך 4 דקות על קרח.
  6. הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את הליזיס. סנן את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.
  7. מזלפים את התערובת ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של חיץ FACS.

3. עיכול של קוצים עצם

  1. מערבלים את קוצי העצם משלב 1.9 ומאפשרים להם להתיישב. דקרו את הסופרנאטנט ושמרו על העצם בתחתית.
  2. השהה מחדש את קוצי העצם ב-1 מ"ל של תערובת העיכול המתובלת של העצם (טבלה 1).
  3. הניחו את הצינורות על מסובב צינור למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  4. הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סננו את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל המכיל מח עצם מעוכל ומעוכל RBC.

4. צביעה

  1. מערבבים בעדינות את קוצי העצם ואת תרחיף תאי מח העצם.
  2. השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את מספר התא החי על המוציטומטר באמצעות צביעה על בסיס כחול טריפאן 0.4%, כמתואר בפרוטוקוליםשפורסמו 27. אסוף 50,000 תאים לבקרה לא מוכתמת מהשעיית התא.
  3. צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend אותם ב 100 μL של מאגר FACS.
    הערה: נוגדנים יכולים להיות titrated כדי לקבוע את דילול אידיאלי. בחירת נוגדנים (אפיטופים ופלואורוכרומים) ניתנת להתאמה אישית.
  4. לצביעה עם נוגדנים לדלדול מגנטי, הוסף בלוק FC (1 μL לכל 25 x 106 תאים), CD45-APC (10 μL לכל 25 x 106 תאים) ו- Ter119-APC (4 μL לכל 25 x 106 תאים) (ראה טבלת חומרים).
  5. דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS, להסיר 50,000 תאים (~ 50 μL) עבור הבקרה המוכתמת APC, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, והשהיה מחדש ב 100 μL של מאגר FACS.
  6. לצביעת תרחיף התא במיקרו-כדוריות לדלדול מגנטי, הוסף mIgG (8 μL לכל 25 x 106 תאים) ומיקרו-כדוריות נגד APC (20 μL לכל 25 x 106 תאים) (ראה טבלת חומרים).
  7. דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS של 10 מ"ל, צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.

5. דלדול הדגימה על ידי מיון מגנטי

הערה: שלב זה מתבצע באמצעות מפריד מגנטי ידני הזמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן. ניתן לבצע שלב זה גם באמצעות מפריד אוטומטי (ראה טבלת חומרים).

  1. הכן את עמודת LD על-ידי שטיפתה עם 2 מ"ל של מאגר MACs (טבלה 1). יש להשליך את הקולחים ולהחליף את צינור האיסוף.
  2. השהה מחדש עד 1 x 108 תאים במאגר MACs וסנן אותם דרך מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.
  3. הניחו את עמוד ה-LD על מעמד המפריד המגנטי. מקם מבחנה של 5 מ"ל מתחת לעמודה כדי לאסוף את הפולט.
  4. הוסף את מתלה התא לעמודת LD המוכנה. אפשר לחלק השלילי לזרום דרך צינור האיסוף. לשטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר MACs, איסוף eluate באותו צינור. זהו החלק השלילי המשמש בשלב 5.6 להלן.
  5. הסר את עמוד LD מהמעמד המפריד המגנטי והנח אותו על מבחנה חדשה של 5 מ"ל. השתמש פיפטה כדי לחלק 3 מ"ל של מאגר לתוך העמודה כדי לשטוף החוצה תאים שסומנו באופן חיובי, באמצעות בוכנה עמודה.
  6. צנטריפוגה את השברים השליליים והחיוביים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השהה אותם מחדש ב- 100 μL של מאגר FACS.
  7. ספירת 10 μL של השברים השליליים והחיוביים עם 0.4% כחול טריפאן. הנפחים עבור ניתוח אוסטאו-אנליזה/צביעת פאנל אנדותל להלן יתבססו על ספירת תאים זו.
  8. השתמש ב- 50,000 תאים חיים מהחלק החיובי עבור בקרות gating ציטומטריית זרימה.

6. ניתוח אוסטאו/כתם בלוח האנדותל

הערה: יש לבצע את הפיצוי בהתאם לפרוטוקולי ציטומטריית זרימה סטנדרטיים, כולל כל בקרות הצביעה והגטינג המתאימות.

  1. עבור צביעה של החלק השלילי CD45 / Ter119 (1 μL של כל נוגדן לכל 1 x 106 תאים), להוסיף CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE ו- CD140a-PE-Cy5 (ראה טבלת חומרים).
  2. דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם 2 מ"ל של מאגר FACS, ולאחר מכן לצנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
  3. הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS ודילול 1:1000 של PI עבור צביעה חיה/מתה, ולאחר מכן סנן את הדגימה דרך מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.
  4. נתח את התאים בציטומטר זרימה מרובה צבעים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם, כגון תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים, ממודלים של MDS ולוקמיה מורין (איור 1). איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating לזיהוי אוכלוסיות מעניינות, החל מבחירת התאים (P1) במקטע המעוכל והמדולדל CD45/Ter119 דרך פרופיל פיזור קדימה וצדדית. תאים לדוגמה בדגימת לוקמיה מוצגים ב-P1 (איור 2A). סינגלים נבחרים וכפילים אינם נכללים בניתוח הזה, P2 (איו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.

לפני קבלת נתונים ציטומטריים של זרימה מדגימות ניסיוניות, חשוב לפצות בזהירות על חפיפה פלואורסצנטית. כמו כן, חיוני לכלול את כל בקרות הצביעה והצביעה המתאימות. צעדים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג'יי.בי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
קצות פיפטה 1 מ"ל ג'נסי סיינטיפיק 24-165RL
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהAVANTL211511-CS
10 ומיקרו; L טיפים פיפטהGenesee Scientific 24-140RL
10 מ"ל עטוף בנפרד פיפטות סרולוגיות סטריליותגלובוס מדעי1760
1000 מ"ל בקבוק סינון ואקוםNEST344021
צינור צנטריפוגה 15 מ"לVWR10026-076
2 מ"ל פיפטה שואבתNEST325011
200 ומיקרו; L טיפים פיפטהGenesee Scientific 24-150-RL
25 מ"ל עטוף בנפרד פיפטות סרולוגיות סטריליותגלובוס מדעי1780
5 מ"ל עטוף בנפרד פיפטות סרולוגיות סטריליותגלובוס מדעי1740
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול  12 x 75 מ"מ סגנוןפלקון352054
5 מ"ל פוליסטירן צינור עגול תחתון עם מכסה מסננת תאים 12 x 75 מ"מ סגנוןפלקון
352235 צינור צנטריפוגה 50 מ"לNEST602052
6 בארות, תחתית שטוחה עם מכסה אידוי נמוךפלקון353046
רפידות תחתונות סופגות עם מחסום לחות עמיד למיםVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro מפרידMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc Block)BDBiosciences5531410.5 מ"ג/מ"ל 
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ' A790666.000 גרם/מול
סגול מבריק 421 נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) נוגדן (D7)Invitrogen404-59810.2 מ"ג/מ"ל
C57BL/6J עכבריםמעבדת ג'קסון 664
מיכל גז פחמן דו חמצניAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) נוגדן חד שבטי (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820.2 מ"ג/מ"ל
CD45 נוגדן חד שבטי (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820.2 מ"ג/מ"ל
מסננת תאים 70 ומיקרו; מ ניילון Falcon352350
Cole-Parmer Essentials מרגמה ועלי; אגת, 125 מ"לקול-פארמרEW-63100-62
קולגנאז מClostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
קולגנאז מסוגI STEMCELL7415
קורנינג מיני צנטריפוגהקורנינג6770
קורנינג סטריפטור אולטרה פיפטבקר קורנינג4099
Deoxyribonuclease I מלבלב בקרSigma-AldrichD4513
Dispase II, אבקהGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
אתנול אבסולוטי, KOPTEC, עומד במפרט האנליטי של BP, Ph. Eur., USP (200 הוכחה)VWR89125-174
מספריים עדינים - חדיםFine Science Tools14061-10
Foundation B סרום בקר עובריGeminiBio900-208
Gilson  PIPETMAN L ערכות התחלה לפיפטהFisherScientific 
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) 10xgibco14185-052
המוציטומטרפישר02-671-10
אינקובטור קלסרC150-UL
Kimwipes KIMTECHK222101
LABGARD Class II, סוג A2 ארון בטיחות ביולוגיNuaireNU-425-400
עמודות LDMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
מערבולת LSE מערבולתCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
מק מעמד מרובה Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
מסובב צינור MACsmix Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10 מ"ג2 מ"ג/מ"ל 
Nup98-HoxD13 (NHD13) מעבדת עכבריםג'קסון 
010505 PE נגד עכבר CD51 נוגדן (RMV-7)Biolegend1041060.2 מ"ג/מ"ל
PE/ציאנין5 נגד עכבר CD140a נוגדן (RUO)Biolegend 1359200.2 מ"ג/מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין Gibco1514012210,000 U/mL
Plastipak 3 מ"ל מזרקBecton, Dickinson and Company309657
Propidium Iodide - תמיסה של 1.0 מ"ג/מ"ל במיםThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  מפריד Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus סדרת צנטריפוגהתרמו מדעית 
TER-119 נוגדן חד-שבטי (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820.2 מ"ג/מ"ל
תמיסת טריפן כחולה 0.4%גיבקו15-250-061
אולטרה-טהור 0.5 מ' EDTA, pH 8.0 Invitrogen15575-038
F167370G75009521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
  5. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  6. Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
  7. Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
  8. Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
  9. Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
  10. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  11. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  12. Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  13. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  14. Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).
  15. Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
  16. Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
  17. Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
  18. Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
  19. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  20. Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
  21. Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
  22. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  23. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
  24. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  25. Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
  26. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936(2016).
  27. JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
  28. Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662(2016).
  29. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449(2018).
  30. Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
  31. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
  32. Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow MicroenvironmentMyelodysplastic SyndromeAcute Myeloid LeukemiaMesenchymal Stromal CellsFlow CytometryMagnetic SeparationEndothelial CellsOsteolineage CellsHematopoietic Stem CellsCell Population Isolation

Related Articles