הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66115

⸱

10 בנובמבר 2023

 ,  , 
1Keck School of Medicine, University of Southern California, 2The Vision Center, Department of Surgery, Children’s Hospital Los Angeles, 3The Saban Research Institute, Children’s Hospital Los Angeles, 4USC Roski Eye Institute, Department of Ophthalmology, Keck School of Medicine, University of Southern California, 5Eli and Edythe Broad CIRM Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of Southern California, 6Tina and Rick Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג קריוסקציות רשתית באיכות גבוהה בבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות. לאחר האינוקלציה, העין שקועה לזמן קצר בקיבוע. לאחר מכן, הקרנית והקשתית מוסרים והעין נשארת לילה לקיבוע נוסף ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, העדשה מוסרת. לאחר מכן מכניסים את העין לקריומולד וממלאים אותה במדיום הטבעה. על ידי הסרת העדשה, למדיום ההטבעה יש גישה טובה יותר לזגוגית ומוביל ליציבות רשתית טובה יותר. חשוב לציין, יש לדגור את העין בהטבעה בינונית למשך הלילה כדי לאפשר חדירה מלאה לכל הזגוגית. לאחר הדגירה בלילה, העין קפואה על קרח יבש ונחתכת. ניתן להשיג קטעי רשתית שלמים לשימוש באימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי צביעה סטנדרטיים כדי לחקור את הלוקליזציה של אנטיגנים ברקמת הרשתית. היצמדות לפרוטוקול זה מביאה לקריוסקציות רשתית באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהן בכל ניסוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

מבוא

הרשתית מורכבת מכמה שכבות של תאים מתמחים בתוך העין שיחד פועלים להמרת אור לאותות עצביים. מכיוון שהרשתית ממלאת תפקיד קריטי בראייה, הבנת המבנה והתפקוד שלה יכולה לספק תובנות חשובות לגבי כמה מהגורמים הנפוצים ביותר לאובדן ראייה כגון ניוון מקולרי ורטינופתיה סוכרתית, בין היתר.

ארנבים משמשים כמודל נוח לבעלי חיים במחקר רשתית מכיוון שהם מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים אחרים. עיני ארנב דומות יחסית באנטומיה לעיניים אנושיות 1,2. לדוגמה, לארנבים יש אזור של צפיפות פוטורצפטור מוגברת, המכונה פס חזותי אופקי, המקביל לגומה המרכזית בבני אדם. למודלים נפוצים אחרים של בעלי חיים, כגון מכרסמים, אין מקבילה אנטומית. בנוסף, בהשוואה למכרסמים, כלי הדם ברשתית בארנבים דומים למדי לאלה שבבני אדם. עיני ארנב גדולות יחסית גם כן. זה הופך אותם למתאימים במיוחד למחקרים הכוללים מתן תרופות או התערבות כירורגית בתוך הזגוגית או הרשתית שאחרת עשויים להיות קשים או בלתי אפשריים בעין קטנהיותר 3.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה נפוצה לחקר לוקליזציה של אנטיגנים בתוך רקמה ויש לה יישומים נרחבים במחקר רשתית 4,5,6. מכיוון שהרשתית היא מבנה עדין, השגת תוצאות שימושיות באמצעות IHC דורשת עיבוד רקמות זהיר. היפרדות רשתית וממצאים רקמתיים אחרים כגון שברים ברשתית או קפלים מתרחשים בדרך כלל במהלך העיבוד ועלולים להפריע לפרשנות התוצאות. עיבוד מוצלח תלוי במגוון גורמים, כולל מניפולציה של רקמות, סוג ומשך הקיבוע, סוג מדיה הטבעה וטכניקות חתך 7,8,9,10. למרות היתרונות של שימוש בארנבים כמודל לבעלי חיים במחקר רשתית, קיימים מעט מאוד פרוטוקולים המתארים עיבוד רקמות מוצלח של רשתית הארנבת. מאמר זה מתאר שיטה אמינה להשגת חתכי רשתית באיכות גבוהה מעיני ארנב שלמות לשימוש ב- IHC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בוצעו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קליפורניה. 14 (n = 14) ארנבים בעלי חגורה הולנדית בגילאי 4 עד 6 חודשים שימשו בפיתוח פרוטוקול זה. נעשה שימוש בבעלי חיים זכרים ונקבות כאחד. כל בעלי החיים שקלו בין 2.0 ל -2.5 ק"ג. כל בעלי החיים שוכנו ביחידות. רשימה של חומרים וציוד מומלצים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנה

  1. הכנה מקבעת.
    1. הכינו 4% פרפורמאלדהיד (PFA) במי מלח חוצצי פוספט (PBS). לכל הפחות, 50 מ"ל של קיבוע נדרש לכל עין.
  2. הכנת סוכן Cryoprotective.
    1. הכינו 30% משקל לפי נפח (w/v) סוכרוז ב-PBS. הניחו על שייקר למשך 15 דקות לפחות כדי לוודא שהסוכרוז מומס לחלוטין. לכל הפחות, 50 מ"ל של סוכן cryoprotective נדרש לכל עין.
  3. הכנת מכשיר דיסקציה.
    1. אספו שני זוגות מלקחיים, זוג מספריים מעוקלים, להב אזמל אחד וכלי דיסקציה בקוטר 100 מ"מ והניחו אותם ליד מיקרוסקופ דיסקציה. הגדרה לדוגמה מוצגת באיור 1A.

2. קיבוע ראשוני

  1. לאחר שאיבה טרנס-לחמית11, הניחו מיד את העין בלפחות 50 מ"ל של 4% PFA ב-PBS על קרח. ודא כי העין שקועה לחלוטין. אם בועות אוויר מצטברות על פני השטח החיצוניים של העין, הסירו אותן על ידי טלטול עדין.

3. הסרת קרנית וקשתית

  1. לאחר 15 דקות, הסירו את העין מ-4% PFA ב-PBS והניחו אותה בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ נתיחה. מלאו את המנה ב-PBS כדי למנוע מהעין להתייבש.
  2. הסר את הקרנית.
    1. התחילו ביצירת חתך עם להב כירורגי 1 מ"מ קדמי ללימבוס, במקביל למישור הקשתית כדי למנוע ניקוב בטעות של מבנים מתחתיו (איור 1B).
    2. יש להכניס מספריים מעוקלים לחתך הראשוני ולהמשיך לחתוך היקפית תוך שמירה על מרחק של 1 מ"מ מהלימבוס. השתמשו במלקחיים כדי לייצב את העין בזמן החיתוך (איור 1C).
    3. לאחר השלמת החתך ההיקפי, יש להסיר את הקרנית בעזרת מלקחיים ולנגב בעדינות עודפי PBS עם מגבון מעבדה. הניחו את הקרנית בתמיסת 30% סוכרוז בטמפרטורת החדר (RT) להגנה קריואקטיבית או להשלכה. Cryoprotection הוא שלם כאשר הקרנית שוקעת, אשר בדרך כלל לוקח פחות מ 1 שעה.
  3. הסר את הקשתית.
    1. התחל על ידי ביצוע חיתוך ראשוני עם מספריים מעוקלים דרך הקשתית. הפרידו לחלוטין את הקשתית משאר הרקמה על-ידי חיתוך דומה להסרת הקרנית (איור 1D).
    2. לאחר השלמת החתך ההיקפי, הסירו את הקשתית במלקחיים ונגבו בעדינות עודפי PBS עם מגבון מעבדה. הניחו את הקשתית בתמיסת 30% סוכרוז ב-RT להגנה קריואקטיבית או השליכו כאמור לעיל. הגנה מפני קרינה מלאה כאשר הקשתית שוקעת, פעולה שנמשכת בדרך כלל פחות מ-30 דקות.

4. השלמת הקיבוע

  1. לאחר הסרת הקרנית והקשתית, הניחו את העין בלפחות 50 מ"ל של 4% PFA טרי שהוכן ב-PBS והניחו אותו על שייקר לתסיסה עדינה. ודא שהעין נשארת שקועה במהלך אי שקט.
  2. שמור את העין ב 4% PFA ב PBS ב 4 °C (75 °F) למשך הלילה.
    הערה: מצאנו כי 4% PFA גורם לצביעת IHC מעולה אם משתמשים בו בין 16 שעות ל -24 שעות ב -4 מעלות צלזיוס, עם משכי קיבוע ארוכים יותר וכתוצאה מכך צביעת רקע לא ספציפית מוגברת ומיסוך אפיטופ.

5. הסרת עדשה

  1. למחרת בבוקר, להסיר את העין מ 4% PFA ב PBS ולהניח אותו בכלי דיסקציה 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. מלאו את המנה ב-PBS כדי למנוע מהעין להתייבש.
  2. הסירו את העדשה.
    1. התחל על ידי אחיזה זהירה של קפסולת העדשה הקדמית עם מלקחיים.
      הערה: היזהר מאוד לא לדחוף או למשוך בכוח את העדשה עם המלקחיים מכיוון שזה יכול ליצור היפרדות רשתית.
    2. הכניסו בזהירות את המספריים לחדר האחורי כשהלהבים מעוקלים אחורית לאורך העדשה. בצע חיתוך ראשוני דרך זונולי העדשה עם מספריים מעוקלים.
      הערה: היזהרו מאוד לא לדחוף או למשוך בכוח את הזונולים עם המספריים, שכן זה יכול ליצור היפרדות רשתית (איור 1E).
    3. המשיכו לבצע חתכים קטנים דרך זונולי העדשה בתבנית היקפית. בצע שלושה עד חמישה חיתוכים בכל שעת שעון.
    4. כדי לבדוק אם העדשה מופרדת משאר הרקמה, אחזו בעדינות בכמוסת העדשה הקדמית בעזרת מלקחיים ונסו להרים אותה בעדינות. אם העדשה אינה מתרוממת מיד, אל תנסה למשוך יותר מכיוון שהדבר עלול ליצור היפרדות רשתית. במקום זאת, בצע חתכים נוספים דרך זונולי העדשה הנותרים ונסה שוב.
    5. לאחר הפרדה משאר הרקמה, הניחו את העדשה בתמיסת 30% סוכרוז ב-RT להגנה קריו-פרוטקטורית או השליכו אותה כאמור לעיל. הגנה מפני קריוהגנה מלאה כאשר העדשה שוקעת, פעולה שנמשכת בדרך כלל מספר שעות.
  3. מקם את העין לפחות 50 מ"ל של 30% סוכרוז ב PBS ב 4 ° C עבור cryoprotection. Cryoprotection הוא שלם כאשר העין שוקעת, אשר בדרך כלל לוקח 24-48 שעות. כדי לזרז הגנה קריו-הגנה, החליפו את תמיסת הסוכרוז הראשונית בתמיסת סוכרוז טרייה לאחר 8-12 שעות ו/או שמרו על העין בתמיסת סוכרוז ב-RT.

6. הטבעה

  1. לאחר השלמת ההגנה מפני קריותרפיה, הסר את העין מתמיסת 30% סוכרוז והנח אותה בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. בזהירות להפוך את העין כך שהיא פונה כלפי מטה כדי להסיר תמיסת סוכרוז עודפת מהחלק הפנימי של העין.
    הערה: אין לנסות להסיר תמיסה עודפת מהחלק הפנימי של העין באמצעות מגבון מעבדה מכיוון שהמגבון עלול להידבק לגוף הזגוגית ולגרום להיפרדות רשתית.
  2. כשהעין פונה כלפי מטה, נגבו בעדינות את עודפי תמיסת הסוכרוז מהחלק החיצוני של העין באמצעות מגבון.
  3. ממלאים תבנית הטבעה חד פעמית בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לעומק של 0.5-1.0 ס"מ.
    הערה: בסיס זה מבטיח שהעין לא תיגע בתחתית התבנית, מה שמפריע להקפאה מאוחר יותר.
  4. מניחים את העין בתבנית ההטבעה החד פעמית הפונה כלפי מעלה. לאט למלא את החלק הפנימי של העין עם OCT תוך הקפדה מיוחדת על מנת למנוע היווצרות בועות בתוך העין. אם נוצרות בועות, הסירו אותן בזהירות או דחפו אותן לקצה התבנית בעזרת מלקחיים.
  5. סיימו למלא את תבנית ההטבעה החד פעמית ב-OCT. ודאו שהעין שקועה לחלוטין ב-OCT ואינה נוגעת במשטחים הפנימיים של התבנית או חשופה לאוויר. לעטוף את תבנית הטבעה חד פעמית המכילה את העין ב OCT ב parafilm; יש להניח על 4 °C (75 °F) למשך הלילה.
    הערה: מניסיוננו, תקופות דגירה קצרות יותר אינן מאפשרות ל-OCT לחדור לחלוטין לזגוגית. כתוצאה מכך, שכבה של סוכרוז נשארת לעתים קרובות בין הרשתית לבין OCT. כאשר זה קורה, הרשתית לעתים קרובות מתנתקת או נקרעת לחלוטין משאר הרקמה במהלך הקפאה מכיוון שסוכרוז קפוא ככל הנראה מספק פחות תמיכה מבנית מאשר OCT קפוא, מה שהופך חלקים באיכות גבוהה לקשים או אפילו בלתי אפשריים להשגה.
  6. למחרת בבוקר, מניחים את תבנית ההטבעה המכילה את העין ב-OCT בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. ודא שהקרום ההיאלואידי האחורי נראה מורם כלפי מעלה מהרשתית הפנימית.
    הערה: הרמה זו כלפי מעלה עלולה לטשטש את שדה הראייה של הרשתית, מה שמקשה על קביעת ההתמצאות.
  7. כדי לקבוע טוב יותר את כיוון העין, אחוז בזהירות את הקרום ההיאלואידי האחורי קדמית ונסה לקלף אותו עם מלקחיים כדי לחשוף את הרשתית הבסיסית בזמן OCT.
    הערה: לפעמים התעלה ההיאלואידית נראית לעין, אשר מתחברת לראש עצב הראייה ויכולה לשמש למטרות התמצאות מאחר שראש עצב הראייה ממוקם בחלק העליון של הרשתית (איור 2A). אין צורך להסיר לחלוטין את הקרום ההיאלואידי האחורי מאחר ש-OCT כבר חדר לגוף הזגוגית כדי לרפד את הרשתית הפנימית, וכל קרום שנותר לא ישפיע על הקפאה (איור 2B). יש להסיר את הקרום ההיאלואידי האחורי רק לצורך התמצאות, במידת הצורך. אפשרויות אחרות לקביעת כיוון כוללות הנחת תפר או סוג אחר של סימן לפני השאיבה.
  8. העבירו את העין לתבנית הטבעה חדשה עם OCT חדש במילוי לעומק של 0.5-1.0 ס"מ ולאחר מכן מלאו ב-OCT חדש כמו בשלבים 6.3-6.5 כדי להבטיח שאמצעי ההטבעה הסופי נקי מלכלוך ו/או פגמים אחרים שאולי הצטברו במהלך הלילה. אם אפשר, להסיר בעדינות OCT עם מגבון מתוך העין גם כן, אם כי זה לא הכרחי.
  9. תייגו את התבנית למטרות התמצאות (איור 2C). כיוון העין כשהעין פונה כלפי מעלה בתבנית הקריו מבטיח כי OCT ירפד את הרשתית הפנימית. התעלה ההיאלואידית, המתחברת לראש עצב הראייה, היא נקודת ציון חשובה לקביעת החלק העליון של העין (איור 2A).
  10. מניחים את תבנית ההטבעה המסומנת המכילה את העין ב-OCT על גבי קרח יבש. יש לוודא שהעין אינה נוגעת באף אחד מהמשטחים הפנימיים של העובש המוטבע או חשופה לאוויר. ודאו שהעובש נוגע ישירות בקרח היבש כדי להאיץ את תהליך ההקפאה (איור 2D).
  11. העבירו את העין המשובצת למקפיא בטמפרטורה של -80°C או ישירות להקפאה לצורך חתך (איור 2E).

7. Cryosectioning

  1. הרכיבו את הגוש כאשר החלק העליון של העין פונה למעלה והחלק התחתון של העין פונה בצורה נחותה, כאשר הקרנית והקשתית הנותרות פונות ימינה (כמו באיור 2E) או שמאלה (לא מוצגות). לחלופין, טען את הבלוק בכיוון שונה, לפי הצורך. במידת הצורך, שברו את התבנית כדי לגייס את הבלוק על ידי שבירה זהירה של כל צד של התבנית אחד בכל פעם וסימון הבלוק ישירות כדי לא לאבד את כיוון העין.
  2. לאפשר את הבלוק כדי לאזן את הטמפרטורה בתוך cryostat במשך 30-60 דקות; -20 °C היא נקודת התחלה טובה.
  3. לאחר ההרכבה, הניחו להב חדש בזווית הרצויה, בדרך כלל במקביל לציר האנכי של העין.
  4. הגדר את עובי המקטע כרצונך: חתכים בעובי 10-20 מיקרומטר הם נקודת התחלה טובה. דוגמה לחתך בעובי 14 מיקרומטר מודגמת באיור 3A-C.
    1. באופן איטי ומבוקר, התחילו לחתך דרך הבלוק. ודא שהלהב חותך את הבלוק במקביל לציר האנכי של העין. אם לא, התאימו בהתאם את זווית מגע הלהב עם הבלוק או כיוון הבמה.
    2. בעת חיתוך הבלוק יש למנוע קמטים או סלסולים של הקטע בעזרת מברשת. הפכו במהירות את החלק והפעילו לחץ עדין כלפי מטה בעזרת מברשת בעלת שיער ארוך כדי לשטח את המקטע ולמזער קמטים או סלסולים. עצבו מברשת נפרדת עם קצה מחודד כדי לסייע במניפולציה של המקטע.
  5. חבר את המקטע לשקופית זכוכית טעונה על-ידי הזזת השקופית באיטיות הפונה כלפי מטה לכיוון המקטע. מנעו מהמקטע להתקפל על עצמו או לעוות את עצמו בדרך אחרת במהלך החיבור על ידי גלגול עדין של מגלשת הזכוכית מעל המקטע.
    הערה: אל תרחף עם השקופית ישירות מעל המקטע ואל תלחץ עליה כנגד המקטע, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק או לעוות את המקטע.
  6. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה לפני העברתן למקפיא בטמפרטורה של -80°C או המשיכו ישירות לפרוטוקול אימונופלואורסנציה סטנדרטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר עיבוד רקמות, ניתן להשתמש בפרוטוקול אימונופלואורסנציה סטנדרטי כדי לחקור כל מספר של תהליכים ביולוגיים בתוך הרשתית. איור 3A-C ממחיש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתך רשתית המתקבל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. קטע הרשתית היה מוכתם חיסון על פי פרוטוקול12 שתואר קודם לכן.

מקטעי הרשתית המייצגים המוצגים באיור 3A-C קרובים לראש עצב הראייה ומכוונים או...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לפני יישום הפרוטוקול הנ"ל, נתקלנו באופן עקבי בקשיים בעיבוד רקמות של עיני ארנב עבור IHC. התאמנו כמה פרוטוקולים מעיניהם של בעלי חיים קטנים יותר, כגון עכברים, אך מצאנו שהם מובילים לקיבוע לקוי ולקושי בחיתוך רקמות. ישנם מספר שיקולים חשובים המאפשרים חלקים עקביים ואיכותיים של רשתית הארנבת.

שיקול אחד הוא גודלו הגדול של גלובוס הארנב בהשוואה למודלים נפוצים אחרים של בעלי חיים כגון מכרסמים. מכיוון שעין הארנב דומה בגודלה לעין האנושית, ניתן לבצע בקלות מחקרים תרגומיים המשתמשים בפרוצדורות עיניות הנעשות בדרך כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

תודה לרוזנה קלדרון, דומיניק שיילר ורוזה סיירה על הייעוץ הטכני. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים בבית הספר לרפואה של USC Keck ממחקר למניעת עיוורון (AN), NIH K08EY030924 (AN), קרן לאס מדרינאס בטיפולים ניסיוניים לרפואת עיניים (AN), פרס מחקר למניעת עיוורון לפיתוח קריירה (AN), קרן העיניים הטמפלרית (AN), וקרן הזיכרון ע"ש אדוארד נ' ודלה ל' ת'ום (AN, KG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית 100 מ"מקורנינג353025משמשת לדיסקציה (שלבים 1.3, 3 ו-5)
צינור 50 מ"לGenesee Scientific28-106לקיבוע והגנה מפני הקפאה (שלב 1)
CryostatLeicaCM1850להקפאה (שלב 7)
מספריים מעוקליםFine Science Tools91500-09משמש לדיסקציה (שלבים 1.3, 3 ו-5)
DAPIפישר סיינטיפיקD3571מדולל 1:1,000 במאגר חוסם
מיקרוסקופדיסקציה ZeissStemi 2000-Cמשמש לדיסקציה (שלבים 1.3, 3 ו-5)
חמור נגד עזים 488פישר סיינטיפיקA-11055מדולל 1:1,000 במאגר חסימה
חמור נגד עכבר 555פישר סיינטיפיקA-31570מדולל 1:1,000 במאגר
חסימהמלקחייםכלי מדע עדינים91150-20משמש לדיסקציה (שלבים 1.3, 3 ו-5)
כיסוי שקופיות זכוכיתVWR48404-453להקפאה (שלב 7)
עיזים אנטי-SOX2R& D SystemsAF2018מדולל 1:100 במאגר חסימה
להבי קריוסטט חד פעמיים בפרופיל גבוהLeica Microsystems Inc.14035838926להקפאה (שלב 7)
KimwipeFisher Scientific06-666-Aמשמש לניגוב עודפי PBS או OCT (שלבים 3 ו-6)
עכבר anti-RPE65Novus BioNB100-355SSמדולל 1:100 בחסימת מאגר
OmniPur SucroseMillipore167117משמש להקפאה (שלב 1.2)
Paraformaldehyde 20% תמיסהמיקרוסקופ אלקטרונים מדעים15713משמש כמקבע רקמות (מדולל ל-4% בשלב 1.1)
תבנית הטבעה חד פעמית מתקלפת (עומק 22x22x20 מ"מ)Polysciences, Inc.18646Aמשמש כתבנית הטבעה (שלב 6)
מלח חוצץ פוספט, 1xCorning21-030-CVמשמש להכנת קיבוע (שלב 1.1) וקריופרוטקטנט (שלב 1.2)
להב אזמל מס' 15נוצה08-916-5Dמשמש לדיסקציה (שלבים 1.3, 3 ו-5)
שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-550-15להקפאה (שלב 7)
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה4583משמשת כאמצעי הטבעה (שלב 6)

מקורות

  1. Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).
  2. Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
  3. Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  4. Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
  5. Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
  7. Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879(2021).
  8. Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
  9. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
  10. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
  11. Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
  12. Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119(2022).
  13. Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32(2020).
  14. Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
  15. Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חתך קפוא של עין ארנבתחתך קפוא של הרשתיתאימונוהיסטוכימיהאפיתל הרשתית הפיגמנטריקיבוע רקמהקריו-הגנההטמעה ב-OCTמורפולוגיה של הרשתיתמיקרוסקופ לדיסקציהעיבוד רקמת רשתית
השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.