הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Immunoassay נייד מבוסס נייר בשילוב עם יישום הטלפון החכם לזיהוי Colorimetric וכמותי של אנטיגן Dengue NS1

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66130

⸱

26 בינואר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

במאמר זה

סיכום

מענה לצרכים דחופים לאבחון דנגי, כאן אנו מציגים מכשיר אנליטי מבוסס נייר דנגי NS1 משולב באפליקציית סמארטפון (DEN-NS1-PAD) לכימות ריכוז האנטיגן של דנגי NS1 בדגימות סרום / דם קליניות. חדשנות זו משפרת את ניהול הדנגה על ידי סיוע בקבלת החלטות קליניות במסגרות בריאות שונות, אפילו מוגבלות במשאבים.

תקציר

זיהום בנגיף דנגי (DENV), המועבר על ידי יתושי אדס , הוא דאגה מרכזית לבריאות הציבור במדינות טרופיות וסובטרופיות. עם שכיחות שנתית של כ-10 מיליון מקרים ו-20,000-25,000 מקרי מוות, במיוחד בקרב ילדים, יש צורך דחוף בכלי אבחון מעשיים. נוכחותו של חלבון לא מבני של דנגי 1 (NS1) במהלך זיהום מוקדם נקשרה לשחרור ציטוקינים, דליפת כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל, מה שהופך אותו לסמן פוטנציאלי לדנגה חמורה.

בדיקות חיסוניות מבוססות נייר כגון מבחני זרימה לרוחב (LFAs) והתקנים אנליטיים מבוססי נייר מיקרופלואידים (PADs) צברו פופולריות כבדיקות אבחון בשל פשטותן, מהירותן, זולותן, ספציפיות וקלות הפרשנות שלהן. עם זאת, בדיקות חיסוניות קונבנציונליות מבוססות נייר לזיהוי דנגי NS1 מסתמכות בדרך כלל על בדיקה חזותית, ומניבות תוצאות איכותיות בלבד. כדי להתמודד עם מגבלה זו ולשפר את הרגישות, הצענו בדיקת זיהוי דנגי NS1 ניידת ביותר במכשיר אנליטי מבוסס נייר (PAD), כלומר, DEN-NS1-PAD, המשלב יישום סמארטפון כקורא צבעוני וכמותי. מערכת הפיתוח מאפשרת כימות ישיר של ריכוזי NS1 בדגימות קליניות.

דגימות סרום ודם שהתקבלו מחולים שימשו להדגמת ביצועי אב הטיפוס של המערכת. התוצאות התקבלו באופן מיידי וניתן להשתמש בהן להערכה קלינית, הן במתקני בריאות מאובזרים היטב והן במסגרות מוגבלות במשאבים. שילוב חדשני זה של בדיקה חיסונית מבוססת נייר עם יישום טלפון חכם מציע גישה מבטיחה לזיהוי וכימות משופרים של אנטיגן דנגי NS1. על ידי הגברת הרגישות מעבר ליכולות של עין בלתי, מערכת זו טומנת בחובה פוטנציאל גדול לשיפור קבלת ההחלטות הקליניות בניהול דנגי, במיוחד באזורים מרוחקים או מוחלשים.

מבוא

זיהום בנגיף דנגי (DENV) הוא המחלה המועברת על ידי יתושים המתפשטת במהירות הגבוהה ביותר1, ויותר מ -390 מיליון אנשים נגועים ב -96 מיליון זיהומים סימפטומטיים, 2 מיליון מקרים של מחלה קשה, ויותר מ -25,000 מקרי מוות בשנה מתרחשים בעולם 1,2. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -3.9 מיליארד אנשים נמצאים בסיכון לדנגה; ~70% חיים במדינות אסיה פסיפיק ובעיקר בדרום מזרח אסיה3. בשנת 2019, מספר מקרי הדנגה שדווחו לארגון הבריאות העולמי היה 4.2 מיליון, ותאילנד תרמה לפחות 136,000 מקרי דנגי ו -144 מקרי מוות מזיהום דנגי4. התפרצות הדנגה בתאילנד מתרחשת בעונה הגשומה, מאפריל עד דצמבר, באזורים עירוניים וכפריים כאחד, במיוחד באזור הצפון-מזרחי.

לזיהומים ב- DENV יש ביטויים קליניים שונים החל מתסמינים תת-קליניים, קדחת דנגי קלה (DF) ועד קדחת דימומית חמורה של דנגה (DHF). המאפיין העיקרי של מצב DHF חמור הוא חדירות כלי דם מוגברת ואחריה הלם ותפקוד לקוי של איברים1. הבנת המסלול המולקולרי שיכול לגרום לדליפת כלי הדם חשובה מאוד בפיתוח טיפולי דנגי יעילים. דנגי חלבון לא מבני 1 (NS1) הוא גליקופרוטאין מופרש במהלך זיהום מוקדםבנגיף 5,6, והוא מתפקד כקופקטור לשכפול RNA נגיפי7. NS1 יכול לגרום לשחרור ציטוקינים ולתרום לדליפה וסקולרית על ידי קשירה לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4) וגליקוקליקסאנדותל 8,9. מחקרי מבחנה הראו כי NS1 מקיים אינטראקציה עם תאי אנדותל וגורם לאפופטוזיס. מצב זה יכול לתרום לתפקוד לקוי של האנדותל ולדליפת כלי דם10. רמות האנטיגן NS1, בקורלציה עם רמות אינטרלוקין בסרום (IL)-10, עלו באופן משמעותי בחולים עם מחלה קלינית קשה11. דנגי NS1 תורם גם לפתוגנזה של מחלות על ידי גרימת IL-10 ודיכוי תגובות תאי T ספציפיות ל- DENV12,13. בנוסף, חלבון דנגי NS1 היה קשור למחלה קלינית קשה, והריכוז של NS1 > 600 ng mL-1 בשלושת הימים הראשונים של המחלה היה קשור להתפתחות של DHF14.

ההתמדה של אנטיגן דנגי NS1 בחולים עם DHF יכול לשמש סמן של דנגיחמור 6. ישנן מספר שיטות לזיהוי NS1 בדגימות קליניות כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) והבדיקה המהירה15. תקן הזהב למדידת ריכוז חלבוני NS1 במסגרת קלינית הוא שיטת ELISA. עם זאת, שיטת ELISA היא יקרה ודורשת כוח אדם מיומן, ומתקני מעבדה16. לכן, פיתוח הטכנולוגיה לגילוי וכימות חלבוני NS1 במבחן נקודת הטיפול (POCT) עדיין נמשך. בעשור האחרון, בדיקות חיסוניות מבוססות נייר כגון מבחני זרימה צידית (LFAs) והתקנים אנליטיים מבוססי נייר מיקרופלואידים (μPADs) הפכו פופולריים כבדיקות אבחון בגלל הפשטות, המהירות, הזולות והספציפיות שלהם 17,18,19. במערכת חיסונית מבוססת נייר, מספר תוויות שימשו ליצירת אותות, כגון ננו-חלקיקי זהב (AuNPs)20, ננו-חלקיקים מגנטיים21,22, נקודות קוונטיות23 וחומרים פלואורסצנטיים24,25. AuNPs הן התוויות הנפוצות ביותר המשמשות בבדיקות חיסוניות מבוססות נייר בשל עלות הייצור הזולה שלהן, קלות הייצור, היציבות והקריאה הפשוטה שלהן. נכון לעכשיו, בדיקות זרימה לרוחב (LFAs) עבור דנגי NS1 משמשים המפורסם בסביבה הקלינית26,27. עם זאת, זיהוי תוויות LFA קונבנציונלי משתמש בדרך כלל בעין בלתי ומספק רק תוצאות איכותיות.

בעשור האחרון, יותר מ -5 מיליארד טלפונים חכמים היו בשימוש נרחב ברחבי העולם, ויש פוטנציאל לפיתוח זיהוי נייד28,29. לסמארטפונים יש יכולות רב-תכליתיות כגון חיישנים פיזיים מובנים, מעבדים מרובי ליבות, מצלמות דיגיטליות, יציאות USB, יציאות שמע, אלחוט ותוכנות יישומים, מה שהופך אותם למתאימים לשימוש בפלטפורמות ביו-חיישנים שונות30. בנוסף, טכנולוגיות אלחוטיות מאפשרות שליחת נתונים במהירות וניתן להשתמש בהן לניטור בזמן אמת ובאתר הלקוח31. Mudanyali et al. שילבו את החיסון מבוסס הנייר ואת הסמארטפונים כדי לפתח פלטפורמת POCT ניידת, ללא ציוד, מהירה, בעלות נמוכה וידידותית למשתמש עבור מלריה, שחפת ו- HIV32. לינג ועמיתיו דיווחו על בדיקת זרימה רוחבית בשילוב עם מצלמת סמארטפון כדי לזהות פעילות פוספטאז אלקליין בחלב באופן כמותי33. Hou et al. פיתחו גם מערכת הדמיה דו-מודאלית מבוססת סמארטפון עבור אותות כמותיים מצבע או פלואורסצנטיות בבדיקת הזרימה הצידית34. בנוסף, שימוש בסמארטפון כקורא קולורימטרי וכמותי יכול לשפר את הרגישות בעוד שהעין הבלתי אינה יכולה לדווח בביטחון על נוכחות המטרה35.

מציג פריצת דרך באבחון דנגי, DEN-NS1-PAD 36,37,38 (המכונה המכשיר להלן) מציע פתרון נייד ויעיל. באמצעות טכנולוגיה מבוססת נייר מיקרופלואידי המודפס בשעווה, התקן זה מכמת את NS1 עם רגישות גבוהה וספציפיות באמצעות עיבוד תמונה. כדי לשפר עוד יותר את השירות שלה, פיתחנו אפליקציית סמארטפון ידידותית למשתמש לקריאה צבעונית וכמותית. תיקוף קליני באמצעות דגימות מטופלים מבתי חולים תאילנדיים מדגיש את השפעתו המיידית על הערכת המטופלים בזמן אמת. החדשנות שלנו מסמנת התקדמות מרכזית בניהול יעיל של נקודות טיפול, ומבטיחה לחולל מהפכה בתחום האבחון בנופים של שירותי בריאות מוגבלים במשאבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה של ועדת הביקורת המוסדית, המחלקה הרפואית של הצבא המלכותי התאילנדי, בית החולים Phramongkutklao, בנגקוק, תאילנד (IRBRTA 1218/2562) נתנה אישור. בביצוע מחקר זה, עמדנו בכל התקנות האתיות הדרושות.

1. ייצור מכשיר של Immunoassay מבוסס נייר

הערה: מכשיר החיסון מבוסס הנייר יוצר על פי שיטותשנקבעו בעבר 36,37, ובקשת פטנט תאילנדית מס '19010081638.

  1. עיצוב ושרטוט תבניות: עצבו את המכשיר האנליטי מנייר (איור 1A,B) עם 18 תבניות שעווה של PAD במחשב.
    הערה: העיצוב ספציפי ומיועד לנייר בגודל A5. מספר PADs קשור לגודל הנייר, כפי שהמשתמש דורש.
  2. הדפס את התבנית המעוצבת על נייר התאית באמצעות מדפסת שעווה (Table of Materials).
  3. המיסו את הנייר המודפס בשעווה בתנור מעבדה למשך 75 שניות ב-150°C. לאחר מכן, אחסנו אותו בקופסת סיליקה עד שיהיה צורך בשלבים הבאים.
  4. יש למרוח 0.5 μL של 0.025% פולי-L-ליזין (PLL) הן על אזורי הבדיקה והן על אזורי הבקרה. דוגרים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 דקות בקופסת סיליקה ולאחר מכן מחממים בתנור ב-65°C למשך 5 דקות.
  5. יש למרוח 0.5 μL של 1 מיקרוגרם μL-1 של נוגדן IgG נגד עכבר עיזים על אזור הבקרה ו-0.5 μL של 1 מיקרוגרם μL-1 של נוגדן הלכידה על אזור הבדיקה. הניחו לטיפות להתייבש בקופסת ג'ל סיליקה ב-RT למשך 30 דקות.
  6. יש למרוח 2 μL של המאגר החוסם על אזור הדגימה, 3 μL על האזור המצומד ו-2 μL על אזור האיתור. הניחו לטיפות להתייבש ב-RT בקופסת ג'ל סיליקה למשך 30 דקות.
  7. יש למרוח 2 μL של תמיסת ננו-חלקיקים-נוגדנים מוזהבים (AuNPs-Ab) על האזור המצומד ולאפשר לו להתייבש בקופסת ג'ל סיליקה ב-RT למשך 30 דקות.

2. הרכבת Immunoassay מבוסס נייר

  1. הסר בזהירות את סרט המגן בצד האחורי של כרטיס הגיבוי מפלסטיק הדבק כדי לחשוף את הדבק.
  2. יישרו את נייר התאית המטופל עם כרטיס הגיבוי מפלסטיק דביק ולחצו בחוזקה את שתי השכבות זו לזו.
    הערה: הימנע מלגעת בשדה ההידרופילי כדי למזער את הסיכון לזיהום או נזק למכשיר.
  3. מרחו סרט פלסטיק כדי לצפות את הנייר ולחצו אותם יחד.
  4. גזור את חתיכת המכשירים הרצויה באמצעות מספריים מגיליונות של מכשירים התאספו לחלוטין.
  5. ה-DEN-NS1-PADs (איור 1C) מוכנים כעת לשימוש. ליציבות ארוכת טווח, אחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C.

3. הכנת הצמידות AuNPs-Ab

הערה: AuNPs-Ab הוכן כפי שתואר קודם לכן על ידי Prabowo et al.36.

  1. ערבבו 10 μL של נוגדן 1 מ"ג mL−1 נגד NS1 ב-PBS, 1 מ"ל של קולואיד AuNPs 40 ננומטר ו-0.1 מ"ל של חיץ בוראט 0.1 M (pH 8.5).
  2. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך 60 דקות ודגרו ב-RT.
  3. יש למרוח 0.1 מ"ל של 10 מ"ג מ"ל−1 BSA ב-BBS, לסובב ב-50 סל"ד ולדגור ב-RT למשך 15 דקות.
  4. צנטריפוגה את התמיסה ב 20,187 × גרם ו 4 ° C במשך 30 דקות.
  5. בזהירות פיפטה ולהפריד את supernatant מן auNPs-Ab המואץ.
  6. השהה מחדש את AuNPs-Ab ב- 500 μL של BBS ופזר אותו באמצעות סוניקציה.
  7. יש לחזור על פעולת הצנטריפוגה בטמפרטורה של 20,187 × גרם ו-4°C למשך 30 דקות.
    הערה: חזור על תהליכי הפיזור והצנטריפוגה 3x.
  8. הוסף 50 μL של המאגר המצומד למתלים, מה שהופך אותו מוכן ליישום על האזור המצומד.

4. פיתוח אפליקציות מובייל

  1. עיבוד תמונה ופיתוח למידת מכונה
    1. אסוף ערכת נתונים עבור מודל תמונה מפוקח על-ידי איסוף למעלה מ-900 תמונות עם מיקוד אוטומטי של DEN-NS1-PADs, לכידת תנאים שונים כגון ריכוזים שונים, מותגי מצלמה (12-13 מגה-פיקסל), סיבובים (90° ו-180°) והגדרות תאורה. כוונו ל-30 תמונות בכל תנאי ספציפי.
    2. תייגו את האמת הקרקעית על ידי זיהוי וביאור שני תחומי עניין כאזורי הבחינה והבקרה בתוך התמונות שנאספו ללמידה מפוקחת.
    3. עצב אלגוריתם לזיהוי רצועת הרקע. אתר את קו האמצע בין אזורי הבדיקה והביקורת, חשב את נקודת האמצע שלו וקבע אזור ריבועי פרופורציונלי לגודל הממוצע של שני האזורים העיקריים תוך שמירה על אותו כיוון סיבוב.
    4. צור מודל פילוח תמונות באמצעות מערך הנתונים ותוויות האמת הקרקעיות משלבים 4.1.1 ו- 4.1.2 כדי לאמן מודל פילוח תמונה לזיהוי אזורי העניין.
  2. אלגוריתם יישום
    1. החל את מודל פילוח התמונות המיומן על תמונות חדשות כדי לאתר את אזורי הבדיקה, הבקרה והרקע באופן אוטומטי.
    2. השתמש בטכניקות עיבוד תמונה בסיסיות כדי לקבל ערך עוצמה יחיד לכל אחד משלושת אזורי העניין (בדיקה, בקרה ורקע).
    3. המר את התמונה לייצוג מערך תלת-ממדי (y, x ערוצים) כדי לגשת לערכי פיקסלים.
    4. המירו את התמונה לגווני אפור באמצעות ממוצע ערכי RGB והחילו היפוך עם הנוסחה (255x).
    5. נרמל את ערכי אזור הבדיקה והבקרה על-ידי הפחתת ערך אזור הרקע.
    6. השתמש בעקומת הכיול שנקבעה מראש כדי לחשב את הריכוז של NS1.
    7. סווג את התוצאות כחיוביות או שליליות בהתבסס על ערך חיתוך של 0.1103 הנגזר מעוצמות גווני האפור המנורמלות37.

5. עקומת כיול ורגישויות

  1. הכינו דגימת NS1 בסרום אנושי לכיול בריכוזים של 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ו-1.0 מיקרוגרם מ"ל-1.
  2. זרוק 50 μL מכל ריכוז על אזור הדגימה ובצע מדידות במשולש.
  3. אפשר את הדגימות לפתל לחלוטין לתוך המכשיר, אשר עשוי לקחת 20-30 דקות כדי לקבל תוצאות.
  4. צלם תמונות של המכשיר באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות של דגירה.
  5. נתח את אזורי הבדיקה והבקרה באמצעות ImageJ ויישום נייד מותאם אישית.
  6. בנה את עקומת הכיול בהתבסס על נתונים מ- ImageJ ומהיישום הנייד.
  7. חשב את הגבול של ריק (LOB), את גבול הזיהוי (LOD) ואת גבול הכימות (LOQ) באמצעות משוואות (1-3) להלן:
    LOB = ממוצע הנתונים הריקים + 1:645* ð (סטיית תקן של נתונים ריקים) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (סטיית תקן של נתוני הריכוז הנמוכים ביותר) (2)
    LOQ = ממוצע של נתונים ריקים + 10*ð (סטיית תקן של נתונים ריקים) (3)

6. ביצוע Immunoassay מבוסס נייר עם דגימות קליניות

  1. לאסוף ולעבד 300 μL של דם היקפי מ -30 חולים ביום הראשון של האשפוז לתוך צינורות EDTA העליון סגול, בעקבות שיטות קליניות טובות.
  2. צנטריפוגה את הדם ב 2,884 × גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות.
  3. מעבירים את הרכיב הנוזלי (פלזמה) לצינור פוליפרופילן נקי באמצעות פיפטה.
  4. אחסנו את הפלזמה במקפיא מיד בטמפרטורה של -20°C לניתוח לאחר מכן.
  5. החל 20 μL של פלזמה על אזור הדגימה על גבי המכשיר. לאחר מכן, הוסף 30 μL של חיץ כביסה (0.05% v/v Tween 20 ב 1x פוספט חוצץ מלוחים).
  6. תנו לדגימה להתפתל לחלוטין לתוך המכשיר, מה שעשוי לקחת 20-30 דקות כדי לקבל את התוצאות.
  7. צלם תמונות של המכשיר באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם לאחר 5 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.
  8. נתח את אזורי הבדיקה והבקרה באמצעות ImageJ ויישום נייד מותאם אישית.

7. כימות עם יישום נייד

הערה: העוצמה של בדיקה חיסונית מבוססת נייר מנותחת ביישום הנייד (איור 2).

  1. פתח את היישום הנייד שפותח בטלפון החכם.
  2. בחר השתמש במצלמה או העלה מהגלריה כדי לבחור או להעלות את מקור הנתונים. עשה זאת באמצעות לכידת מצלמה או על-ידי בחירת תמונה מגלריית המכשיר.
  3. נווט אל המקטע האנליטי וגע בלחצן נתח על המסך.
  4. המתן עד שהיישום ינתח את הנתונים ויציג את התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בחירת שיטת ייצור היא חיונית כדי להבטיח ביצועי בדיקה הניתנים לשחזור במכשירי בדיקה מבוססי נייר. במחקר שלנו, בחנו תהליכי ייצור וחומרים שונים בהקשר של הדגמת אימונואסייה מבוססת נייר. השיטה שבחרנו משתמשת במערכת הדפסת שעווה ליצירת מחסומים הידרופוביים בתוך התקנים מיקרופלואידים מבוססי נייר. גישה זו בולטת בשל פשטותה, מהירותה ותוצאותיה העקביות. יש לציין כי הוא מציע את היתרון של הימנעות משימוש בכימיקלים פוטו-עמידים, שיש להם פוטנציאל להפריע לספיחת חלבונים ולהגביר את ההידרופוביות של נייר תאית. יתר על כן, הדפסת שעווה מבטיחה ממדים עקביי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אחד הפרמטרים החשובים לתכנון עבור מערכת קוראים מבוססת סמארטפון הוא היכולת לספק עיבוד הדמיה ניתן לשחזור של דגימות. במחקר זה, לשם פשטות ונוחות, התמונות צולמו משלושה מותגי סמארטפונים שונים עם מצלמות 12-13 מגה פיקסל ללא שימוש בקופסת הדמיה או אביזרים. תנאים משתנים של לכידת תמונה, כגון רזולוציית המצלמה, זמן לכידת תמונה, תנאי תאורה וסביבה, יכולים להשפיע על עוצמת הצבע של נקודות הבדיקה והבקרה במכשיר. ההשפעה של זמני לכידת תמונות שונים על התאורה והייבוש של PAD על עוצמות האות של המכשירים צומצמה על ידי שימוש בעוצמות האות המנורמלות, שנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

M.H.P. מודה בהכרת תודה לקרן המחקר של Universitas Islam Indonesia (UII). המחברים מודים למר Nutchanon Ninyawee על מומחיותו רבת הערך וסיועו בפיתוח האפליקציה הניידת ותרומתו לכתב היד. יתר על כן, המחברים מעריכים את התמיכה הכספית הניתנת על ידי תאילנד מדע מחקר וחדשנות (TSRI), קרן מחקר בסיסית: שנת הכספים 2023 (פרויקט מס '. FRB660073/0164) במסגרת תוכנית בריאות חכמה של האוניברסיטה הטכנולוגית של המלך מונגקוט תונבורי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
0.1 M תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.2) 
BBS מכיל 0.1% טווין 20, 10% סוכרוז ו-1% קזאין   הטיפול באזור המצומד וחסימת המאגר
בוראט חוצץ מלח (BBS) (25 מ"מ נתרן בוראט ו-150 מ"מ נתרן כלורי ב-pH 8.2) בתוספת 1% BSA מאגר הכביסה בתהליך ההצמדה AuNPs עם הנוגדן
חומצה בוריתMerck10043-35-3
בקר סרום אלבומין שבר V (BSA)   PAA Lab GmbH (גרמניה)K41-001 
קזאיןמרק9005-46-3
נייר כרומטוגרפיה כיתה 2 GE Healthcare3002-911 
סרט למינציה שקוף3M (חנויות נייר מכתבים)
דיסודיום מימן פוספטMerck7558-79-4
סרט כפול צדחנויות
עז נגד עכבר נוגדן IgG MyBiosource (ארה"ב)MBS435013
ננו-חלקיקי זהב (40 ננומטר)   Serve Science Co., Ltd. (תאילנד)
נוגדן רב-שבטי IgG אנושי   MerckAG711-M
עכבר דנגי NS1 נוגדן חד שבטי MyBiosource (ארה"ב)MBS834415
נוגדן חד שבטי של עכבר דנגי NS1 MyBiosource (ארה"ב)MBS834236
NS1 אנטיגנים סרוטיפ 2MyBiosource (ארה"ב)MBS 568697
PBS 1X המכיל 0.1% Tween 20 שימשכמאגר פליטה
גיבוי מפלסטיק 10x30 ס"מPacific Biotech Co., Ltd. (תאילנד)
פולי-L-ליזין (PLL)Sigma AldrichP4832
אשלגן כלוריMerck104936
אשלגן מונופוספטMerck104877
נתרן כלוריMerck7647-14-5
נתרן טטרבוראט Sigma Aldrich1303-96-4
סוכרוזMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode readerBioTek
טלפונים ניידיםHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
סורק תמונותEpson Perfection V30
תנורMemmert
 Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection DocumentationGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software
נייר מכתביםכרטיס מדפסת שעווה

מקורות

  1. Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
  2. World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
  3. WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
  4. Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
  5. Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
  6. Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570(2014).
  7. Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
  8. Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102(2015).
  9. Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673(2017).
  10. Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
  11. Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
  12. Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409(2013).
  13. Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341(2013).
  14. Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
  15. World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
  16. Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
  17. Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
  18. Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
  19. Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V. Immunochromatographic methods in food analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 55, 81-93 (2014).
  20. Hu, J., et al. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosensors and Bioelectronics. 54 (4), 585-597 (2014).
  21. Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
  22. Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
  23. Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
  24. He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
  25. Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
  26. Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104(2018).
  27. Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
  28. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
  29. Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D. Biosensing with cell phones. Trends in Biotechnology. 32 (7), 351-355 (2014).
  30. Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1(2015).
  31. Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
  32. Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678(2012).
  33. Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
  34. Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291(2017).
  35. You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
  36. Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
  37. Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
  38. Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. , 1901000816 (2019).
  39. Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
  40. Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800(2020).
  41. Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
  42. Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203(2017).
  43. Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84(2017).
  44. Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
  45. Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7(2019).
  46. Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
  47. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391(2018).
  48. Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
  49. Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
  50. Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
  51. Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
  52. Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
  53. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376(2014).
  54. Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
  55. Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
  56. Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
  57. Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
  58. Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
  59. Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

זיהוי Dengue NS1זיהוי קולורימטריהתקן נייר מיקרופלואידינשוא ננו-חלקיקי זהבניתוח דגימות דםבדיקת זרימה צדיתניתוח תמונות
Immunoassay נייד מבוסס נייר בשילוב עם יישום הטלפון החכם לזיהוי Colorimetric וכמותי של אנטיגן Dengue NS1
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.