Method Article

אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת משתתפים

DOI:

10.3791/66136

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 2Department of Gastroenterology, Wu Han NO.1 Hospital, 3Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 4Departments of Biomedical Research Center, The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University & The First Hospital of Kunming, 5School of Medical, Yunnan University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונוהיסטוכימיה מחזורית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי באתרו של סמנים מרובים בו זמנית באמצעות דגירה חוזרת של נוגדני אנטיגן, סריקת תמונה ויישור תמונה ואינטגרציה. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הפעולה לזיהוי מצעי תאי מערכת החיסון בטכנולוגיה זו בסרטן ריאות ובדגימות גרורות מוחיות זוגיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיקרו-סביבה של הגידול כוללת אינטראקציות בין תאים מארחים, תאי גידול, תאי חיסון, תאי סטרומה וכלי דם. אפיון וארגון מרחבי של תת-קבוצות תאי חיסון וחלבוני מטרה חיוניים למטרות פרוגנוסטיות וטיפוליות. זה הוביל לפיתוח של שיטות צביעה immunohistochemistry multiplexed. אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים מרובים, מה שמקל על הבנה מקיפה של תפקוד התא ואינטראקציות בין-תאיות. במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה עבור בדיקת אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת מחזורים ויישומה בניתוח הכימות של תת-קבוצות לימפוציטים. צביעת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית המחזורית המרובבת עוקבת אחר שלבים וריאגנטים דומים לאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית, וכוללת שליפת אנטיגן, דגירה מחזורית של נוגדנים וצביעה על שקופית רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין (FFPE). במהלך תגובת האנטיגן-נוגדנים מכינים תערובת של נוגדנים ממינים שונים. תנאים, כגון זמן אחזור אנטיגן וריכוז נוגדנים, ממוטבים ומאומתים כדי להגדיל את יחס האות לרעש. טכניקה זו ניתנת לשחזור ומשמשת כלי רב ערך למחקר אימונותרפיה וליישומים קליניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות במוח (BM) מייצגות את הגידולים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתרחשים בכמעט מחצית ממקרי סרטן הריאה של תאים לא קטנים (NSCLC), עם פרוגנוזה גרועה1. על פי הערכות, ל-10%-20% מחולי NSCLC כבר יש BM בזמן האבחנה הראשונית, וכ-40% ממקרי NSCLC יפתחו BM במהלך הטיפול2. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) קשורה קשר הדוק עם התרחשות NSCLC ו-BM, כולל רכיבים שונים, כגון כלי דם, פיברובלסטים, מקרופאגים, מטריצה חוץ-תאית (ECM), לימפואיד, תאים חיסוניים שמקורם במח עצם ומולקולות איתות 3,4. תאי חיסון מיקרו-סביבתיים ממלאים תפקיד מכריע בהשפעה על גדילה והתפתחות של תאים סרטניים. גרורות במוח מציגות מטרות טיפול פוטנציאליות רבות המאופיינות במיקרו-סביבות אימונולוגיות מורכבות ובתהליכי איתות. לדוגמה, מעכבי PD-1 הראו יעילות קלינית עבור חולים עם גרורות במוח של סרטן ריאות (LCBM) כמעכב מחסום חיסוני (ICI). עם זאת, תדירות התגובות לטיפול ב-PD-1 משתנה בין NSCLC ראשוני ל-LCBM5, מה שמרמז על כך שהמיקרו-סביבה החיסונית של הגידול פועלת כמווסת ICI קריטי.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא כלי רב ערך בתחומי הביולוגיה, רפואת היסוד והפתולוגיה6. שיטת זיהוי זו ממחישה ביטוי אנטיגן באמצעות אינטראקציה של נוגדן אנטיגן על שקופיתרקמה 7. IHC משמש לאבחון סמנים מנבאים, הערכת סמנים פרוגנוסטיים, הנחיית טיפולים ממוקדים וחקירת התפקודים הביולוגיים של תאי גידול8. עם זאת, שיטת IHC המסורתית יכולה לזהות רק סמן ביולוגי אחד בכל פעם. כדי להתמודד עם מגבלה זו, החדשנות של הטכנולוגיה האימונוהיסטוכימית הובילה לפיתוח אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת משתתפים (mfIHC), המאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים חלבוניים מרובים על אותה שקופית רקמה, הן בשדה בהיר והן בשדה פלואורסצנטי9. התקדמות זו מספקת ניתוח מדויק של הרכב התאים והאינטראקציות המולקולריות בין תאי סטרומה, תאי מערכת החיסון ותאי סרטן בתוך TME.

במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה מחזורית מרובת משתתפים לניתוח ההתפלגות המרחבית של תאי מערכת החיסון. שני נוגדנים ראשוניים ממינים שונים, כגון ארנב וחולדה, נבחרים לדגירת דגירה בו זמנית, ולאחר מכן נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנטיות. שליפת אנטיגן מתבצעת לאחר כל סבב של תגובת אנטיגן-נוגדנים. אוטופלואורסצנטיות חסומה, ו-4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) משמש להכתמת הגרעינים. הפאנל כולל זיהוי רציף של CD3, CD8, CD20 ו- CK, תאים מסווגים לפי הסמנים: תאי גידול (CK+), תאי T בוגרים (CD3+), תאי T ציטוטוקסיים (CD3+CD8+), תאי B (CD20+)10,11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים לסרטן יונאן/בית החולים המסונף השלישי של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג. כל הנבדקים/אפוטרופוסים חתמו על הסכמה מדעת.

1. הכנת שקופיות

  1. חתכו מקטעים של גושי פרפין זוגיים המכילים גידול ריאתי ראשוני או סרטן ריאות במוח שולח גרורות לתאים בעובי של 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום. מוציאים חלקים למים ומפרידים עם פינצטה, בוחרים את הטוב ביותר ומדביקים אותו על המגלשה המצופה פוליליזין.
  2. הכניסו את מגלשות הרקמות לתנור בטמפרטורה של 65°C למשך 30 דקות כדי לשפר את הידבקות הרקמות.
  3. סחפו את השקופיות בקסילן באמצעות שלושה שינויים, שכל אחד מהם נמשך 10 דקות.
  4. הפחיתו בהדרגה את ריכוז האלכוהול ודגרו על מגלשות ב-100% אתנול למשך 5 דקות, 90% אתנול למשך 5 דקות, 75% אתנול למשך 5 דקות ובמים נטולי יונים, למשך 3 דקות.

2. אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER)

  1. לדלל 100x נתרן ציטראט תמיסת חיץ (pH 6.0) ל 1x (10 mM) במים deionized, הכנת מספיק תמיסת חיץ כדי לטבול לחלוטין את המגלשות.
  2. הניחו את המגלשות בסיר לחץ, וחשפו אותן לחום גבוה (100 מעלות צלזיוס) ולחץ (~ 30 psi) למשך 2 דקות. לאחר החימום, מניחים למגלשות להתקרר לטמפרטורת החדר במים מזוקקים למשך 3 דקות.
  3. יש להמיס שקיק אחד של 52 גרם של מלח חוצץ פוספט (PBS; אבקה) ב-5 ליטר מים נטולי יונים, להכנת תמיסת חיץ PBS (pH 7.0). מקם את השקופיות בתמיסת חיץ PBS למשך 5 דקות, עם 3 שינויים.

3. חסימת פרוקסידז

  1. מכסים את החלקים במי חמצן 3% ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המגלשות ב-PBS, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
  2. השתמש בנייר מסנן כדי לספוג עודפי מים הרחק מהיקף הרקמה. בינתיים, ודא כי הרקמה לחה.

4. דגירה ראשונית של נוגדנים לסיבוב ראשון

  1. הכינו תערובת עבודה של הנוגדנים הראשוניים עבור CD8 (נוגדן חד שבטי ארנב, שיבוט SP16) ו- CD20 (נוגדן חד שבטי עכבר, שיבוט L26), מדולל 1:50 בדילול נוגדנים ראשוני של בונד.
  2. מוסיפים את קומפלקס הנוגדנים לחלקים ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו תמיסה של 0.1% תמיסת מלח חוצצת טווין/פוספט: 1 מ"ל של טווין ב-1 ליטר של תמיסת חיץ PBS.
  4. שטפו את החלקים במי מלח חוצצים ב-0.1% טווין/פוספט, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. השתמש בנייר סינון כדי למשוך עודפי מים מהיקף הרקמה, בינתיים, ודא שהרקמה לחה.

5. דגירה משנית של נוגדנים לסיבוב ראשון

  1. הכינו תערובת של נוגדן עז נגד ארנבים (Excitation) עם תווית פלואורסצנטית (Excitation): 495 ננומטר) ונוגדן נגד עכבר עיזים (לדוגמה: 578 ננומטר), מדולל 1:50 במי מלח של חיץ פוספט. נוגדן נגד ארנב עיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CD8, והנוגדן נגד עכבר עיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CD20.
  2. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית בטיפה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

6. שליפת אפיטופים כתוצאה מחום וחסימת פרוקסידז

  1. לדלל 100x נתרן ציטראט (pH 6.0) ל 1x (10 mM) במים deionized, הכנת מספיק תמיסת חיץ כדי לטבול לחלוטין את המגלשות.
  2. הניחו את המגלשות בסיר לחץ וחשפו אותן לחום גבוה (100°C) ולחץ (~30 psi) למשך דקה אחת. לאחר החימום, הניחו את המגלשות במים מזוקקים להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  3. בצע חסימת פרוקסידז כמתואר בשלב 3.

7. דגירה ראשונית של נוגדנים לסיבוב שני

  1. הכינו תערובת עבודה של הנוגדנים הראשוניים עבור CD3 (נוגדן חד שבטי ארנב, שיבוט SP7) ו- CK (נוגדן חד שבטי עכבר, MX005), מדולל 1:50 בדילול נוגדנים ראשוני.
  2. מוסיפים את קומפלקס הנוגדנים לחלקים ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. יש לשטוף עם 0.1% מלח טווין/חוצץ פוספט, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. השתמש בנייר סינון כדי למשוך עודפי מים מהיקף הרקמה, בינתיים, ודא שהרקמה לחה.

8. דגירה שניונית של נוגדנים לסיבוב שני

  1. הכינו תערובת נגד ארנב עיזים (לדוגמה: 652 ננומטר) ונוגדנים נגד עכברים (לדוגמה: 590 ננומטר), דילול 1:50 במי מלח חיץ פוספט. הנוגדן נגד ארנב העיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CD3, והנוגדן נגד עכבר העיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CK.
  2. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית בטיפת חלב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. יש לשטוף עם 0.1% מלח טווין/חוצץ פוספט, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד.

9. מרווה אוטופלואורסצנטית וצביעה DAPI

  1. הוסף מגיב (0.15 M/L KMnO4) למקטע הרקמה למשך דקה אחת. יש לשטוף במים זורמים במשך 5 דקות.
    אזהרה: KMnO4 רעיל ומזיק לעור. הקפידו ללבוש כפפות בעת הטיפול במגלשות. אם הנוזל מטפטף על העור, נגבו אותו במהירות עם מפיות נקיות ושטפו אותו במים זורמים.
  2. יבש את המגלשה עם ריכוזים הולכים וגדלים של אלכוהול (70%, 90%, 100%), במשך 3 דקות בכל ריכוז.
  3. הוסף DAPI ו- coverslip להדמיה מולטיספקטרלית. כמות DAPI תלויה בגודל הרקמה. ודא שהרקמה מכוסה לחלוטין על ידי DAPI לאחר הוספת הכיסוי.

10. סריקת שקופיות

  1. הניחו את המגלשות על מגש ודחפו עד שלא ניתן לדחוף אותן הלאה.
  2. כדי להפעיל את התוכנית, לחץ פעמיים על סמל התוכנית בשולחן העבודה. במהלך ההפעלה, מוצג חלון בחירת המצב. חלון הבחירה מציג שני מצבי שדה בהיר ומצב פלואורסצנטי: מצב אוטומטי ומצב ידני. במצב סריקה פלואורסצנטית, לחץ על מצב אוטומטי.
  3. העבר את סמן העכבר ? כדי להציג את המידע אודות ההגדרות. לחצו על 'הגדרת מסנן' > 'ערוץ מסנן ' כדי לבחור את 'מספר ערוץ' > 'צבע מדומה'. הגדר את הצבע ושמור.
  4. לחץ על עבודה שגרתית > מצב סריקה > אוטומטי מלא. לחץ על עבודה שגרתית > שם שקופית כדי להגדיר שם שקופית עבור פלט. לחץ על עבודה שגרתית > הגדרות ערוץ כדי לבחור מסננים.
  5. לחץ על Routine Work > Scan Options כדי לקבוע את האיכות ומיקום האחסון המתקבלים של השקופית הווירטואלית.
  6. לחץ על תצוגה מקדימה להגדרת סף ולבחירת הטווח לסריקה.
  7. לחץ על מסנני > חומרה > Live > מיקוד אוטומטי > חשיפה אוטומטית > רווח דיגיטלי > Tick השתמש בזמן חשיפה ידני > Tick המגביל את הטווח > הגדרת הנוכחי.
  8. לחץ על עבודה שגרתית > התחל סריקה. בחר רמת הגדלה כ- 20x או 40x. בחר 20x עבור גדלי קבצים מתאימים. הרחבת MRXS מוגדרת על ידי סורק 3D Pannoramic MIDI. ניתן גם לשנות את סיומת התמונה לתמונת TIFF.
  9. לחץ/י על ״מציג השקופיות״ >-Multiview Toolbox כדי לבחור את התמונה עבור confocal, ולאחר מכן יישרו ושלבו את התמונה.

11. הערכה כמותית של צפיפות תאים

  1. כמת אחוזים של תאי חיסון חיוביים (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) באזורי גידול וסטרומה באמצעות תוכנת סורק Halo 10. אימות צביעת CK כדי להגדיר רקמת גידול.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אנטיגן מחזורי באמצעות פלואורסצנטיות מרובת 5 צבעים בשקופית אחת. באמצעות האופטימיזציה שלנו של הבדיקה, אנו מאפשרים דגירה של שני נוגדנים ממינים שונים (איור 1). המכשירים הדרושים להליך הניסוי כוללים סיר לחץ וקופסת צביעה חיסונית (איור 2A).

לאחר השלמת הבדיקה, אנו מגדירים צבע מדומה של ארבעת הסמנים לפני סריקת השקפים. הצבעים המדומים של CD3, CD8, CD20 ו- CK הם צהוב, אדום, ירוק וציאן, בהתאמה. הגרעינים מסומנים ב-DAPI. אזורים מייצגים של גידול וסטרומה נבחרים לניתוח. ספקטרום פלואורסצנטי של 495 ננומטר, 578 ננומטר, 652 ננומטר ו-590 ננומטר נלכד באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי אוטומטי תלת-ממדי. תמונת מחסנית מייצגת ותמונות עם תווית אחת ברקמת גרורות במוח של סרטן ריאות מוצגות באיור 2B. בהתבסס על תמונות המכילות אות פלואורסצנטי של סמן יחיד, תוכנת הסורק חילצה מאפייני פנוטיפ של תאים בהתבסס על צבע מדומה. נספרו גם המספרים המקבילים של תאי חיסון חיוביים וסך תאי החיסון. כל רמות חלבון מוכתמות ברקמות שזוהו על ידי חישוב ציון H12. לאחר הליכים אלה, נספרים ומנותחים מספר כל סוג לימפוציטים חודרי גידול וחלקו של כל סוג תא במספר הכולל של תאי היעד. החלק היחסי של כל סוג תא חיסוני מציג את האחוז היעיל של לימפוציטים חודרי גידול. אחוז תאי T CD3+, CD3+CD8+ ותאי CD20+ B נותח בגרורות במוח של סרטן ריאות בהשוואה לחתכים ראשוניים של סרטן ריאות. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 3. צפיפות תאי החיסון (תאי T CD3+, תאי T CD3+ CD8+) נמוכה יותר בגרורות במוח של סרטן ריאות מאשר סרטן ריאות ראשוני. תאי CD20+ B גבוהים יותר בקבוצת גרורות במוח מאשר בקבוצת סרטן הריאה הראשונית. עם זאת, התוצאות אינן שונות באופן משמעותי בין שתי קבוצות אלה עבור המדגמים המוגבלים.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מחזורית מרובה. החתכים בגודל 4 מיקרומטר נחתכים ומודבקים על שקופית דבק. מבוצעים שלבי הפעולה הבאים: דה-פראפיניזציה והתייבשות, שליפת אנטיגן, שליפת אנטיגן, חסימת אנטיגן, דגירה ראשונית של תערובת נוגדנים, דגירה שניונית של נוגדנים, ולאחר מכן חזרה על שלבי שליפת האנטיגן, חסימת אנטיגן, דגירה ראשונית של תערובת נוגדנים ודגירה שניונית של נוגדנים, ולאחר מכן הפחתת אוטופלואורסצנציה, בחירת המסנן המתאים לסריקת שקופיות וניתוח התוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שיטות פעולה של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מרובה. הטיפול באנטיגן מתבצע על ידי חימום חלקים בסיר לחץ. (A) סיר הלחץ משמש לשליפת אפיטופים המושרה על ידי חום. בתהליך של דגירה נוגדנים, שקופיות ממוקמים בתיבת immunostaining. (B) תמונות מרוכבות ויחידות מייצגות עבור הפאנל המשמש ברקמת גרורות במוח של סרטן ריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: פרופורציה של תאי מערכת החיסון בתוך סרטן ריאות ראשוני וגרורות במוח של סרטן ריאות. CD3+, CD3+CD8+, CD20+ פרופורציות תאי החיסון בארבע גרורות מוח של סרטן ריאות נמוכות יותר מרקמות סרטן ריאה ראשוניות מזווגות: פסי שגיאה: סטיית תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיארנו את התהליך של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מחזורית מרובה. בחירת הנוגדנים הראשונית היא היבט מכריע של בדיקת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית, ונוגדנים חד-שבטיים מומלצים לספציפיות וחזרתיות טובות יותר. כדי לייעל את ריכוז העבודה של הנוגדן הראשוני, סדרה של דילולים נבדקו באמצעות ניסויים אימונוהיסטוכימיים. הן בקרות חיוביות (להערכת ביטוי אנטיגן מטרה) והן בקרות שליליות (ללא דגירה ראשונית של נוגדנים) חיוניות ויש להגדיר אותן.

בפרוטוקול זה, הנוגדנים הראשוניים מדוללים ומוכנים לתערובת ממינים שונים. הנוגדנים המשניים המסומנים בפלואורסצנטיות נאספים גם הם ומודגרים באותו אופן, ומקורם במינים שונים. לכן, השלב הקריטי הוא בחירת הזנים לנוגדנים ראשוניים שונים המבוססים על האנטיגנים, והנוגדן החד שבטי מועדף על פני נוגדן רב שבטי. אלה יכולים להבטיח כי השילוב בין נוגדן ראשוני נוגדן משני הוא ספציפי. הנוזל המעורב אמור להשיג את ריכוז העבודה עבור שני הנוגדנים הראשוניים ותגובתיות צולבת לא צריכה להתקיים בין שני הנוגדנים בו זמנית. אם הנוגדנים הראשוניים הם מאותו מין, נוגדן משני אחד מודגר ראשון, ואז השני. בעת קביעת רצף דגירה ראשונית של נוגדנים בפאנל, יש לתת עדיפות לנוגדנים הרגישים לתגובת האנטיגן-נוגדנים, עבור האנטיגנים בעלי הביטוי הנמוך, העוצמה תתחזק במהלך שליפת אפיטופ שני. לפני הסבב השני של דגירה נוגדנים, שליפת אנטיגן חוזרת אורכת פחות זמן (דקה) בהשוואה לניתוח הראשון (2 דקות). עוצמת הפלואורסצנטיות מהכתמים המחזוריים הקודמים לא תפחת למרות שהקטעים עוברים שליפה מחום פעמיים. כדי להימנע מתגובתיות חיסונית לא ספציפית, תנאי הדגירה צריכים להיות אופטימליים, כולל ריכוז פעולת הנוגדנים, זמן הדגירה וטמפרטורת הסביבה.

שיטות שונות לשליפת אפיטופים פותחו בעשורים האחרונים, בעיקר בחלוקה לאחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER) ואחזור אפיטופ המושרה על ידי פרוטאז (PIER). חימום הוא שיטת שליפת אנטיגן יעילה החושפת אפיטופים של אנטיגן, מה שהופך אותם למזוהים בצורה יעילה יותר על ידי נוגדנים13. שתי האפשרויות העיקריות לשליפת אנטיגן מבוססות על חיץ ציטראט ומאגר EDTA בעל pH גבוה14. מצב השליפה האופטימלי מזוהה בהתאם לאנטיגן המטרה.

אוטופלואורסצנטיות יכולה להפריע לדימות פלואורסצנטי על מקטעים הנגרמים על ידי פלואורופורים אנדוגניים וריאגנטים המשמשים לעיבוד רקמות15. השימוש במגיב משויך נדרש להדבקה. פלואורופורים נבחרים עם שיאי פליטה הנמנעים משיאי אוטופלואורסצנטיות (סביב 490 ננומטר)16,17. סודן Black B ו- NaBH4 דווחו להרוות אוטופלואורסנציהשל רקמות 18,19. השילוב של סודן בלאק B ו-NaBH4 הפחית את הרקע הפלואורסצנטי ברקמה ממוקדת משובצת פרפין מקובעת פורמלין20. בפרוטוקול זה, הטיפול ברקמה של KMnO4 בריכוז של 0.15 M/L חוסך זמן למשך דקה אחת. KMnO4 מכסה שכבה על הרקמה להגנה על פלואורסצנטיות ספונטנית ומפחית פלואורסצנטיות רקע, הצביעה הספציפית של חלבון שזוהה היא ויזואלית יותר.

כל השקופיות נסרקות בארבעה ערוצי מסננים שונים, ניתוח יישור תמונה הוא הכרחי, זה אתגר גדול ליישר את הלוקליזציה של מבנים חד-תאיים ותת-תאיים. עבור תמונות מולטיספקטרליות מטכניקה זו, יש צורך בציוד הדמיה מקצועי של אור ובתוכנת ניתוח כמותי כדי להימנע משיחות צולבות ספקטרליות. העלות היקרה של המכשיר מגבילה את היישום שלה. דגירה משותפת של שני נוגדנים חוסכת זמן, במיוחד כאשר מדובר בלוח 6 סמנים, הדורש 3 מחזורי דגירה. טכניקה זו משמשת כדי לדמיין אפיון מפורט יותר של תאים חיסוניים במיקרו-סביבות חיסוניות של גידולים. בעתיד, השיטה תיושם לניתוח כמותי של מבנים לימפואידים שלישוניים הקשורים לגידול.

לסיכום, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת קומות מאפשרת לצבוע מטרות מרובות על ידי פלואורופורים המסומנים בנפרד בשקופית אחת. בדיקה זו מספקת הבנה משופרת של הפיזור המרחבי של תאים במיקרו-סביבה החיסונית של הגידול, והקרבה המרחבית של תאים חיסוניים לגידול תורמת לסינון חולים שיפיקו תועלת מאימונותרפיה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NO.81860413, 81960455), קרן מחלקת המדע והטכנולוגיה של יונאן (202001AY070001-080), קרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2019J1274).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.15 מול/ליטר KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x נתרן ציטראט Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% מי חמצןMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Bond מדלל נוגדנים ראשוניLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdkit-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd.  kit-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
אתנולסינופארם קבוצה מגיב כימי ושות', בע"מ10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS (אבקה)Maixin ביוטכנולוגיה ושות', בע"מPBS-0061
שקופיות viwer 3D histech בע"מ
קסילןסינופארם קבוצה מגיב כימי ושות', בע"מ10023418

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755(2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
  3. Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067(2020).
  4. Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746(2023).
  5. Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
  6. Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
  7. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
  8. Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
  9. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
  10. Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
  11. Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2(2021).
  12. Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
  13. Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
  14. McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
  15. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  16. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  17. Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
  18. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  19. Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
  20. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex ImmunohistochemistryFluorescent ImmunohistochemistryTumor MicroenvironmentLymphocyte SubsetsAntigen RetrievalFormalin Fixed TissueBrain MetastasisTumor Infiltrating LymphocytesMulti Spectral ImagingAntibody Incubation

Related Articles