הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים

Shuyuan Wang; Haiyan Xiong; Qiyuan Chang; Xudong Zhuang; Yaochen Wu; Xinrui Wang; Congxian Wu; Zhifei Fu

doi:10.3791/66141

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66141

⸱

12 בינואר 2024

Shuyuan Wang^*¹ , Haiyan Xiong^*¹^,² , Qiyuan Chang^*¹^,³ , Xudong Zhuang^*⁴^,⁵^,⁶ , Yaochen Wu¹^,³ , Xinrui Wang⁴^,⁵^,⁶ , Congxian Wu¹ , Zhifei Fu¹^,⁷^,⁸

¹Public Technology Service Center, Fujian Medical University, ²The School of Pharmacy, Fujian Medical University, ³The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, ⁴College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, ⁵Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁶NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁷Institute of Neuroscience, Fujian Medical University, ⁸Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופ אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הטבעה של Epon באמצעות חלבון פלואורסצנטי הנקרא mScarlet. שיטה זו יכולה לשמור על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. טכניקה זו מקובלת על מגוון רחב של יישומים ביולוגיים.

תקציר

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM) הוא מיקרוסקופ מקיף המשלב את מידע הלוקליזציה המסופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM) ואת ההקשר של אולטרה-מבנה תאי שנרכש על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). CLEM הוא פשרה בין פלואורסצנטיות לאולטרה-מבנה, ובדרך כלל, אולטרה-מבנה פוגע בפלואורסצנטיות. בהשוואה לשרפים הידרופיליים אחרים, כגון גליצידיל מתקרילט, HM20 או K4M, Epon מעולה בתכונות שימור וחיתוך אולטרה-מבנה. בעבר, הוכחנו כי mEosEM יכול לשרוד קיבוע אוסמיום טטרוקסיד והטבעה של אפון. באמצעות mEosEM השגנו לראשונה הטמעת גבי Epon CLEM, השומרת על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. כאן, אנו מספקים פרטים שלב אחר שלב על הכנת דגימת EM, הדמיית FM, הדמיית EM ויישור התמונה. אנו גם משפרים את ההליכים לזיהוי אותו תא שצולם על ידי הדמיית FM במהלך הדמיית EM ומפרטים את הרישום בין תמונות FM ו- EM. אנו מאמינים שניתן להשיג בקלות הטמעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר Epon בעקבות פרוטוקול חדש זה במתקני EM מסורתיים.

מבוא

ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM) כדי להשיג לוקליזציה והפצה של חלבון היעד. עם זאת, ההקשר המקיף את חלבון המטרה הולך לאיבוד, וזה חיוני לחקירה יסודית של חלבון המטרה. למיקרוסקופ אלקטרונים (EM) יש את רזולוציית ההדמיה הגבוהה ביותר, והוא מספק מספר פרטים תת-תאיים. עם זאת, EM חסר תיוג מטרה. על ידי מיזוג מדויק של התמונה הפלואורסצנטית שצולמה על ידי FM עם התמונה האפורה שנרכשה על ידי EM, אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM) יכול לשלב את המידע המתקבל על ידי שני מצבי הדמיה אלה 1,2,3,4.

CLEM הוא פשרה בין פלואורסצנטיות לבין ultrastructure¹. בגלל המגבלות של חלבונים פלואורסצנטיים הנוכחיים ונהלי הכנת דגימות EM מסורתיים, במיוחד השימוש בחומצה אוסמית (OsO₄) ושרפים הידרופוביים כגון אפון, מבנה העל תמיד פוגע בפלואורסצנטיות⁵. OsO₄ הוא מגיב חיוני בהכנת מדגם EM, המשמש לשיפור הניגודיות של תמונות EM. בהשוואה לשרפים מוטמעים אחרים, Epon מעולה בתכונות שימור וחיתוך אולטרה-מבנה⁵. עם זאת, אין חלבונים פלואורסצנטיים שיכולים לשמור על האות הפלואורסצנטי לאחר הטיפול ב-OsO₄ ובהטבעה של Epon⁶. כדי להתגבר על מגבלות החלבונים הפלואורסצנטיים, פותחה הטמעה מוקדמת של LEM, שבה מתבצעת הדמיית FM לפני הכנת דגימת EM⁶. עם זאת, החיסרון של הטמעה מראש CLEM הוא הרישום הלא מדויק בין FM לבין תמונות EM⁵.

להיפך, שיטת CLEM לאחר הטבעה מבצעת את הדמיית FM לאחר הכנת דגימת EM, שדיוק הרישום שלה יכול להגיע ל 6-7 ננומטר ^5,6. כדי לשמור על הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים, נעשה שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של OsO₄ (0.001%)³ ^{או בשיטות} ההכנה של EM בלחץ גבוה (HPF) והחלפת הקפאה (FS) ^4,7 על חשבון מבנה העל שנפרץ או הניגודיות של תמונת ה- EM. הפיתוח של mEos4b מקדם מאוד את ההתקדמות של לאחר הטבעה CLEM, אם כי glycidyl methacrylate משמש שרף הטבעה⁵. עם הפיתוח של mEosEM, אשר יכול לשרוד את צביעת OsO₄ והטבעה Epon, Epon פוסט הטבעה CLEM סופר רזולוציה הושגה בפעם הראשונה, שמירה על פלואורסצנטיות ו ultrastructure בו זמנית⁶. לאחר mEosEM, מספר חלבונים פלואורסצנטיים שיכולים לשרוד את צביעת OsO₄ואת הטבעה Epon פותחו 8,9,10,11. זה מאוד מקדם את הפיתוח של CLEM.

ישנם שלושה היבטים עיקריים ל- Epon לאחר הטמעת CLEM. הראשון הוא חלבון פלואורסצנטי, אשר אמור לשמור על האות הפלואורסצנטי לאחר הכנת דגימת EM. על פי הניסיון שלנו, mScarlet עדיף על חלבונים פלואורסצנטיים אחרים שדווחו. השני הוא כיצד למצוא את אותו תא שצולם על ידי דימות FM בדימות EM. כדי לפתור בעיה זו, אנו משפרים את ההליך עבור שלב זה, כך שניתן למצוא בקלות את תא היעד. האחרון הוא השיטה ליישר את תמונת FM עם תמונת EM. כאן, אנו מפרטים את הרישום בין FM לבין תמונות EM. בפרוטוקול זה, אנו מבטאים mScarlet בתאי עצב VGLUT2 ומדגימים כי mScarlet יכול להתמקד בליזוזומים משניים באמצעות Epon לאחר הטבעה CLEM. אנו מספקים פרטים שלב אחר שלב עבור Epon לאחר הטמעת CLEM, מבלי להתפשר על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

גידול בעלי חיים וניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי האוניברסיטאי הרפואי פוג'יאן. זרימת העבודה שלב אחר שלב של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1.

1. הכנת מדגם

מוח עכבר
1. רכשו עכברים טרנסגניים (ראו טבלת חומרים) ופריימרים אוליגונוקלאוטידים (ראו טבלת חומרים) לגנוטיפ עכברים אלה.
2. לנקב ולהסיר את המוח השלם מקמרון הגולגולת בהתאם לפרוטוקול^12,13 שפורסם בעבר.
3. תקן את מוח העכבר באמצעות 10 מ"ל של תמיסה מקובעת (ראה טבלת חומרים) ב 4 ° C במשך הלילה.
4. שטפו את תמיסת הקיבוע במשך 3 x 10 דקות עם חיץ פוספט באורך 0.1 מ' (PB).
5. חתכו את מוח העכבר למקטעים בעובי 500 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום מתנדנד (ראו טבלת חומרים).
6. חתכו את האזורים הפלואורסצנטיים לגושים קטנים בעזרת אזמל באמצעות סטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים).
  הערה: נפח הבלוקים הקטנים לא יכול להיות גדול מ- 1 מ"מ³.
תאים בתרבית
1. זרעו תאי HeLa לתוך צלחות תרבית תאים בקוטר 6 ס"מ ושמרו עליהם במדיום גדילה (גלוקוז נמוך של Eagle medium [DMEM] של Dulbecco, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי [FBS]).
2. ביום המחרת, העבירו את הפלסמידים המכילים mScarlet לתאים באמצעות מגיב טרנספקציה של DNA (ראו טבלת חומרים) בהתאם לספר ההוראות של ערכת הטרנספקציה.
3. ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, טריפסינזציה של התאים הנגועים וצנטריפוגה אותם כדי לקבל כדורי תאים ב 1,000 × גרם. כדורי התא נקראים בלוקים לדוגמה.

2. הכנת דגימת EM

קיבוע
1. תקן את הבלוקים לדוגמה באמצעות פתרון קיבוע (ראה טבלת חומרים) ב- 4 ° C למשך הלילה.
2. הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף את תמיסת הקיבוע במשך 3 x 10 דקות עם PB 0.1 M מאבני הדגימה.
צביעת אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄)
1. תקן את בלוקי הדגימה עם תמיסת OsO₄ (ראה טבלת חומרים) ב- 4 ° C למשך שעה אחת.
2. הסר את תמיסת OsO₄ ושטוף את תמיסת OsO₄ 3 x 10 דקות עם ddH₂O מאבני הדגימה.
צביעת אורניל אצטט (UA)
1. צבעו את גושי הדגימה באמצעות תמיסת UA 2% (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת.
2. הסר את תמיסת UA ושטוף את בלוקי הדגימה עם ddH₂O במשך 3 x 10 דקות.
התייבשות הדרגתית
1. יש לייבש את גושי הדגימה באתנול הדרגתי באופן הבא: 50% למשך 10 דקות, 70% למשך 10 דקות, 80% למשך 10 דקות, 90% למשך 10 דקות ו-2 x 10 דקות באתנול 100%.
2. יש לייבש את גושי הדגימה עם אצטון נטול מים למשך 3 x 10 דקות.
חדירת שרף
1. הסתננו לגושי הדגימה עם שרף הדרגתי (ראה טבלת חומרים): אצטון לשרף 3:1 למשך שעה אחת, אצטון לשרף 1:1 למשך שעתיים, אצטון לשרף 1:3 למשך 3 שעות.
2. החלף עם שרף טהור במשך 3 x 12 שעות.
שיבוץ שרף
1. העבירו קוביות דגימה לכמוסות (ראו טבלת חומרים) באמצעות קיסם.
2. מוסיפים שרף טהור לקפסולה המכילה את גוש הדגימה ומפילמרים את השרף בתנור ב-60°C למשך 14-16 שעות.

3. ציפוי הזכוכית בננו-חלקיקי זהב

ניקוי זכוכית כיסוי
1. שטפו את כוסות הכיסוי עם חיץ ניקוי (ראו טבלת חומרים) למשך שעתיים בטמפרטורה של 142°C.
2. יש לשטוף את מאגר הניקוי 3 x 10 דקות עם ddH₂O.
3. מעבירים את משקפי הכיסוי בזהירות לתוך המכילה אלכוהול אתילי נטול מים ודגרים למשך הלילה.
4. יבשו באוויר את הכיסויים על ספסל נקי למשך מספר דקות.
צפו את משקפי הכיסוי בננו-חלקיקי זהב.
1. תקן שקופית זכוכית במרכז הסיבוב של צנטריפוגה שולחנית (ראה טבלת חומרים) באמצעות מלט זכוכית.
2. הרכיבו זכוכית במרכז מגלשת הזכוכית באמצעות פתקים דביקים.
3. יש להוסיף 75 μL של 1% pioloform (ראו טבלת חומרים) על זכוכית הכיסוי.
  הערה: בדקנו גם את Formvar (ראה טבלת חומרים) והוא עובד היטב.
4. הסתובבו במשך 3 דקות במהירות של 1,360 × גרם (איור 2A) כדי ליצור שכבה דקה של פיולופורם על פני השטח של זכוכית הכיסוי.
5. דגרו על משטח הזכוכית עם 250 מיקרוליטר של 0.1% פולי-L-ליזין (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 2B).
6. יש לשטוף עם ddH₂O ולייבש את הכוס באוויר למשך מספר דקות.
7. לדלל ננו-חלקיקי זהב בגודל 80 ננומטר (ראה טבלת חומרים) עם ddH₂O עד 25% (v/v, OD₆₀₀ = 0.07) (ראה טבלת חומרים) וסוניקט במשך 15 דקות.
8. דגרו על משטח הזכוכית עם ננו-חלקיקי הזהב המדוללים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 2C).
9. יש לשטוף עם ddH₂O ולייבש את הכוס באוויר למשך מספר דקות.
  הערה: זה עובד היטב 2 שבועות לאחר מצופה pioloform ו ננו חלקיקי זהב. אך אנו ממליצים להשתמש בו מיד לאחר הציפוי.

4. חתך דק במיוחד

חתכו את פני השטח של גוש הדגימה לטרפז ישר זווית. חותכים חתכים בעובי של 100 ננומטר באמצעות סכין יהלום (ראו טבלת חומרים) עם אולטרה-מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). הפרד קטע אחד מרצועת הקטע וצף את החלק היחיד באמבט המים.
הוסיפו טיפה של ddH₂O למרכז זכוכית הכיסוי המצופה בננו-חלקיקי זהב. הרימו קטע באמצעות לולאת דגימה והפכו את לולאת הדגימה על פני השטח של טיפת המים. הסר את לולאת הדגימה, והשאיר את החלק על פני השטח של טיפת המים.
יבשו את הכוס באוויר למשך מספר דקות. ציירו טבעת מסביב לחלק בצד הנגדי של זכוכית הכיסוי באמצעות עט טוש.

5. הדמיית מיקרוסקופ אור

התאוששות פלואורסצנטית
הערה: זרימת העבודה מוצגת באיור 3A.
1. הוסף 10 μL של חיץ הרכבה (ראה טבלה של חומרים) לחלק הדק במיוחד על זכוכית הכיסוי. הניחו זכוכית כיסוי נקייה חדשה על מאגר ההרכבה.
  הערה: רכיב המפתח של מאגר ההרכבה הוא DABCO, המשמש לשחזור הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים. זה חשוב מאוד להתאוששות פלואורסצנטית.
2. הכניסו את שני משקפי הכיסוי הללו יחד עם החלק האולטרה-דק לתוך תא הדמיה (ראו טבלת חומרים). ודא שהכיסוי עם הטבעת המצוירת נמצא בחלק העליון.
אסוף את מפת הניווט.
1. מצא את המקטע באמצעות הטבעת המשורטטת כסמן במצב הדמיה בשדה בהיר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (ראה טבלת חומרים). מעבר לפינה אחת של המקטע. הפעל את האור הלבן וצלם את תמונת שדה הבהירות.
2. כבו את האור הלבן. הפעל את הלייזר (561 ננומטר) וצלם תמונות פלורסנט של אותו שדה ראייה (FOV).
3. כבה את הלייזר. עבור ל- FOV הסמוך, וודא שלשני FOV אלה יש חפיפה של 10%. צלם את תמונת השדה הבהיר ואת התמונה הפלואורסצנטית של ה- FOV השני.
4. חזור על פעולה זו עד שכל המקטע מכוסה. הקלט את נתיב ההדמיה שניתן להשתמש בו כדי לתפור את ה- FOV.
  הערה: לקבלת איכות גבוהה יותר של התמונה, אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי.
תאי תמונה מעניינים.
1. השתמש במפת הניווט כדי למקד בקלות תאים מעניינים. הפעל את הלייזר (561 ננומטר) וצלם 300 מסגרות של תמונות ניאון של התא המעניין. כבה את הלייזר.
2. הפעל את האור הלבן וצלם תמונות שדה בהיר רציפות (~ 100 מסגרות).
3. מעבר לתא אחר של עניין.

6. הכנה להדמיית EM

הערה: זרימת העבודה מוצגת באיור 3B.

העבר את המקטע הדק במיוחד לרשת החריץ.
1. ממלאים צנצנת זכוכית ב-ddH₂O.
2. הוציאו את משקפי הכיסוי מהחדר והפרידו את שני הכיסויים בעזרת פינצטה. הדקו את זכוכית הכיסוי שעליה ממוקם המקטע, שטפו את חיץ ההרכבה וייבשו באוויר.
3. ציון # סביב החלק הדק במיוחד באמצעות להב חד צדדי ולשחרר 10 μL של 12% חומצה הידרופלואורית (ראה טבלת חומרים) בכל פינה של #. הכניסו את הכוס באיטיות למים.
  הערה: חומצה הידרופלואורית מגיבה עם זכוכית, מה שמקל על הסרת סרט הפיופורם מזכוכית הכיסוי. חומצה הידרופלואורית היא רעילה. השתמש בו במכסה מנוע כימי עם כפפות. מגע עם העור מחייב טיפול רפואי מיידי.
4. לצוף את הסרט pioloform ואת החלק דק במיוחד על פני המים יחד. מקם רשת חריץ לא מצופה במקטע כדי ללכוד את המקטע במרכז הרשת.
5. כסו שקופית זכוכית בפרפילם (ראו טבלת חומרים) והרימו את הרשת בעזרת סרט הפיופורם. יש לייבש את הרשת באוויר בטמפרטורת החדר.
צביעת סעיף
1. הכתימו את הקטע עם 2% UA ויתרון משולש של סאטו. לקבלת פרטים נוספים, עיין בפרוטוקול² שפורסם בעבר.

7. ניתוח תמונות

תפר את מפת הניווט.
1. מצא את המיקום של הנתונים הגולמיים. פתח את התוכנה ImageJ (ראה טבלת חומרים) כדי לתפור את מפת הניווט.
2. לחץ על תוספים | תפירה | תפירת רשת/איסוף | (סוג) רשת: נחש לפי עמוד | (סדר) למעלה ומשמאל (לפי רצף ירי) | הגדרת גודל פרוסה | בחר נתיב נתונים | הגדרת שם קובץ | בדוק מיזוג תצוגה. שימו לב לתוצאה, שהיא מפת ניווט המורכבת ממספר תמונות שדה בהיר של FOV שונים.
3. השתמש באותה שיטה כדי לתפור מפת ניווט פלואורסצנטית.
מזג את תמונות שדה הבהירות עם תמונות הפלואורסצנטיות.
1. בתוכנה ImageJ, לחץ על קובץ | ייבוא | 'רצף תמונות ' לייבוא תמונות שדה בהיר רציפות של התא המעניין.
2. לחץ על תמונה | ערימות | הקרנת Z | סכום פרוסות לקבלת תמונת הקרנת עוצמת סכום (SIP) של תמונות שדה בהיר רציפות.
3. לחץ על עריכה | הפוך כדי להפוך את תמונת ה- SIP של שדה הבהיר כך שהאותות של חלקיקי הזהב יהפכו לנקודות לבנות בוהקות.
4. ב-ImageJ, לחץ על File | ייבוא | 'רצף תמונות ' לייבוא תמונות FM רציפות.
5. לחץ על תמונה | ערימות | הקרנת Z | סכום פרוסות לקבלת תמונת SIP של תמונות FM רציפות.
6. לחץ על תמונה | צבע | מזג ערוצים כדי למזג את תמונת שדה הברייטפילד של SIP עם תמונת SIP FM כתמונה ללא הפרדות צבע.
7. חלקיקי הזהב ירוקים, והחלבון הפלואורסצנטי אדום. לחץ על תמונה | סוג | צבע RGB להמרת תבנית התמונה ללא הפרדות צבע ל- RGB.

8. הדמיית EM

העבר את הרשת להחזקת הדגימה, תוך שמירה על צד המקטע של הרשת כלפי מעלה.
השתמש במפת הניווט כדי לזהות בערך את מיקום התאים המתאימים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים דרך ארבעה מרחקים יחסיים לארבע הפינות השונות של הטרפז הימני של החלק האולטרה-דק.
אשר את התאים באמצעות ננו-חלקיקי הזהב.
צלם תמונות EM בהגדלות שונות (4,200x, 6,000x או 8,200x) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) (ראה טבלת חומרים).

9. רישום תמונת FM עם תמונת EM

פתח את תוכנת הרישום (ראה טבלת חומרים). הקלד easyCLEMv0¹⁴בחלון החיפוש. לחץ על easyCLEMv0 כדי לפתוח את easyCLEMv0. לחץ על תמונה/רצף | פתח כדי לייבא את תמונת ה- EM ואת התמונה המורכבת ללוח התוכנה.
בחלון EasyCLEMv0, לחץ על 2D (x,y,[T]) כדי לבחור לא קשיח (2D או 3D) כמצב היישור.
בחלון EasyCLEMv0, לחץ על התיבה הנפתחת משמאל לתמונה בחר שתשתנה וגודלה ישתנה (ככל הנראה FM) כדי לבחור Composite (RGB)color.tif. לאחר מכן, לחץ על התיבה הנפתחת משמאל לתמונה בחר שלא תשתנה (ככל הנראה EM) כדי לבחור EMimage. tif.
לחץ על התחל כדי להתחיל את ההרשמה.
בחלון תמונת EM בשם EMimage. tif, לחץ על ננו-חלקיק זהב אחד כדי לשים את נקודה 1 על ננו-חלקיק הזהב. בחלון תמונת FM בשם Composite (RGB)color.tif, לחץ על ננו-חלקיק הזהב המתאים כדי לשים את נקודה 1 על ננו-חלקיק הזהב.
לחץ על עדכון טרנספורמציה כדי לאשר את אות LM עם אות EM של ננו-חלקיקי הזהב.
חזור על הפעולה לעיל בחלון תמונת EM בשם EMimage. tif והתאם את אות LM לאות EM של אותו ננו-חלקיק זהב בזה אחר זה.
לחץ על עצור כדי לסיים את ההרשמה.
לאחר יישור התמונה, לחצו על Overlayed image ולחצו על Image/Sequence | שמירה בשם לייצוא אוסף תמונות הכולל תמונות בנות ארבעה ערוצים (אדום, ירוק, כחול, אפור).
פתח את ImageJ ולחץ על קובץ | פתח כדי לייבא את תמונת השכבת-על . לחץ על תמונה | ערימות | ערמו לתמונות כדי להפריד את התמונה בשכבת-על לתמונות בנות ארבעה ערוצים.
לחץ על תמונה | צבע | מזג ערוצים למיזוג תמונות משלושה ערוצים (אדום, ירוק ואפור) לתמונה ללא הפרדות צבע.
לחץ על תמונה | סוג | צבע RGB להמרת התמונה ללא הפרדות צבע לתמונת CLEM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דיווחים קודמים הראו כי mScarlet יכול להתמקד בליזוזום¹⁵. בפרוטוקול זה, AAV המבטא mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) הוזרק לתוך M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) של מוח העכבר Vglut2-ires-cre באמצעות מכשירים סטריאוטקסיים. בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל, התמונה המתואמת הסופית מוצגת באיור 4A. תמונת FM יכולה להיות מיושרת במדויק עם תמונת EM באמצעות ננו-חלקיקי זהב (הנקודות הירוקות) כסמנים פידוקיאליים. כפי שניתן לראות בתמונת EM (איור 4C,F...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן הוא שיטת הדמיה רב-תכליתית, היכולה לשלב את מידע הלוקליזציה של חלבון המטרה ממיקרוסקופ אור (LM) ואת ההקשר סביב חלבון המטרה ממיקרוסקופ אלקטרונים (EM)⁶. עם המגבלות של חלבונים פלואורסצנטיים הנוכחיים, השיטה הנפוצה היא טרום הטבעה של אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM), מה שאומר שהדמיית LM נעשית לפני הכנת דגימת EM. כמעט כל החלבונים הפלואורסצנטיים הקיימים ניתנים לבדיקה ב-CLEM טרום הטבעה. עם זאת, בגלל העיוותים וההתכווצויות הבלתי נמנעים, יישור מדויק של התמונה הסופית אינו אפשרי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

פרויקט זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32201235 לז'יפיי פו), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (2022J01287 לז'יפיי פו), קרן המחקר לכישרונות מתקדמים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן, סין (XRCZX2021013 לז'יפיי פו), הקרן הפיננסית למדע מיוחד של מחוז פוג'יאן, סין (22SCZZX002 לז'יפיי פו), קרן מעבדת המפתח של NHC להערכה טכנית של ויסות פוריות עבור פרימאט לא אנושי, ובית החולים ליולדות ובריאות הילד פוג'יאן (2022-NHP-04 לז'יפיי פו). אנו מודים לליניינג ג'ואו, מינשיה וו, שי לין ויאן הו במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על התמיכה בהכנת דגימות EM והדמיית EM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 מ' מאגר פוספט (PB)			NaH2PO₄· 2H2O+Na₂HPO₄· 12H₂O
0.2 מ' Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	כימיקל מסוכן
Abbelight 3D	Nanolnsights
אצטון	SCR	10000418
אמוניום הידרוקסיד	J& K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
מאגר ניקוי של כוסות			50 מ"ל אמוניום הידרוקסיד, 50 מ"ל מי חמצן, 250 מ"ל H₂O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	כימיקל מסוכן
DDSA	SPI חברת	GS02827	מסוכנים
צנטריפוגה שולחנית	WIGGENS	MINICEN 10E
סכין יהלום	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI חברה	GS02823
ריאגנט העברת DNA	Thermo Fisher	2696953	ליפופקטמין 3000 ערכת טרנספקציה
Epon 812	חברת SPI	GS02659	כימיקל מסוכן
אתנול	SCR	10009218
פיג'י תמונה J	המכונים הלאומיים לבריאות
פתרון קיבוע			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
גליצרול	SCR	10010618
ננו-חלקיקי זהב	Corpuscular	790120-010
שרף			אצטון לשרף 3:1, 1:1, 1:3
חומצה הידרופלואורית	SCR	10011118
מי חמצן	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0
תוסף תא הדמיה	תרמו פישר	A7816
כמוסות ג'לטין גדולות	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	70117
מאגר			Mowiol 4-88, גליצרול, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO₄ ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO₄ ž2H2O	SCR	20040718
חברת NMA	SPI	GS02828
פריימרים כימיים מסוכנים אוליגונוקלאוטידים	Takara Biomedical Technology (בייג'ינג)		שלושה פריימרים אוליגונוקלאוטידים שימשו לאיתור Vglut2-ires-Cre וסוג בר בו זמנית. הפריימרים 5^,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3^, ו-5^,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^, נועדו לזהות Vglut2-ires-Cre. הפריימרים 5^,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^, ו-5^,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3^, שמטרתם לזהות סוג פראי.
מיקרוטום מתנודד	Leica	VT1000S
אוסמיום טטרוקסיד	SCR	L01210302	כימיקל מסוכן
OsO<תת>4 תמיסה			1% אוסמיום טטרוקסיד + 1.5% K<תת>4Fe (CN)<תת>6· 3H₂O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618
מאגר			4% PFA+0.1 M
PB Pioloform	Sigma	63148-65-2	כימיקל מסוכן
פולי-L-ליזין	Sigma	25986-63-0
אשלגן פרוציאניד (K₄Fe (CN)₆· 3 שעות<תת>2O)	להבי אזמל SCR	10016818
	Merck	S2771
ידיות אזמל	Merck	S2896-1EA
סטריאומיקרוסקופ	OLYMPUS	MVX10
עכברים טרנסגניים		ג'קסון	Vglut2-ires-Cre (זן: 129S6/SvEvTac) שוכנו בתנאים סטנדרטיים (25 מעלות; C, מחזור אור/חושך של 12 שעות, עם מים ומזון הניתנים אד ליביטום. עכברים זכרים ונקבות שימשו ב-2– בן 3 חודשים, טווח משקל 20-30 גרם
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)	FEI		TECNAL G2
תמיסת UA (2% UA)			תמיסה מימית
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
אורניל אצטט (UA)	TED PELLA	19481	כימיקל מסוכן

כיסוי כימיקלים כימי מסוכן שיפוע הרכבה זלוף כימי מסוכן עכברי מעבדת

מקורות

de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583(2015).
Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077(2022).
Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871(2020).
Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314(2020).
MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246(2023).
Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24(2023).
Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257(2017).
Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741(2008).
Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17(2023).
Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרוסקופיה של אור קורלטיבית שיכוב ב-Epon שימור פלואורסצנציה הכנת דגימה רקמת מוח של עכבר חיתוך דק מאוד רישום תמונות ננו-חלקיקי זהב דימות פלואורסצנטי