שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

סיכום

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

תקציר

הובלה דו-כיוונית של מטענים לאורך האקסון חיונית לשמירה על סינפסות תפקודיות, קישוריות עצבית ותאי עצב בריאים. ההובלה האקסונלית משובשת במחלות נוירודגנרטיביות מרובות, ונוירוני הקרנה פגיעים במיוחד בגלל הצורך להעביר חומרים תאיים למרחקים ארוכים ולשמור על מסה אקסונלית משמעותית. שינויים פתולוגיים של מספר חלבונים הקשורים למחלות משפיעים לרעה על התחבורה, כולל טאו, עמילואיד-β, α-סינוקלאין, סופראוקסיד דיסמוטאז והנטינגטין, ומספקים מנגנון משותף פוטנציאלי שבאמצעותו חלבונים פתולוגיים מפעילים רעילות במחלות. שיטות לחקור מנגנונים רעילים אלה נחוצים כדי להבין הפרעות נוירודגנרטיביות ולזהות התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

כאן, נוירוני היפוקמפוס ראשוניים של מכרסמים בתרבית נגועים יחד עם פלסמידים מרובים כדי לחקור את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על הובלה אקסונלית מהירה באמצעות הדמיה קונפוקלית של תאים חיים של חלבוני מטען מתויגים פלואורסצנטית. אנו מתחילים עם הקציר, הדיסוציאציה והטיפוח של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ממכרסמים. לאחר מכן, אנו מבצעים טרנספורמציה משותפת של תאי העצב עם מבני דנ"א פלסמידים כדי לבטא חלבון מטען מתויג פלואורסצנטי וטאו פראי או מוטנטי (המשמש כדוגמה לחלבונים פתולוגיים). אקסונים מזוהים בתאים חיים באמצעות נוגדן הקושר תחום חוץ-תאי של נוירופאשין, חלבון מקטע ראשוני של אקסון, ואזור עניין אקסונלי מדומה למדידת הובלת מטענים פלואורסצנטיים.

באמצעות KymoAnalyzer, מאקרו ImageJ הזמין באופן חופשי, אנו מאפיינים בהרחבה את המהירות, תדירות ההשהיה וצפיפות המטען הכיוונית של הובלה אקסונלית, שכולם עשויים להיות מושפעים מנוכחותם של חלבונים פתולוגיים. באמצעות שיטה זו, אנו מזהים פנוטיפ של תדירות השהיית מטען מוגברת הקשורה לביטוי של חלבון טאו פתולוגי. בנוסף, ניתן להוסיף מבני shRNA להשתקת גנים לתמהיל הטרנספקציה כדי לבחון את תפקידם של חלבונים אחרים בתיווך שיבוש ההובלה. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לשימוש עם חלבונים אחרים הקשורים למחלות נוירודגנרטיביות והוא שיטה ניתנת לשחזור לחקר המנגנונים של האופן שבו חלבונים אלה משבשים את ההובלה האקסונלית.

מבוא

תאי עצב תלויים בהובלה דו-כיוונית של מטען לאורך האקסון כדי לשמור על סינפסות תפקודיות וקישוריות עצבית. ליקויים בהובלה אקסונלית נחשבים לתורמים קריטיים לפתוגנזה של מספר מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD) וטאואופתים אחרים, מחלת פרקינסון, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת הנטינגטון ^1,2,3. ואכן, שינויים פתולוגיים במספר חלבונים הקשורים למחלות משפיעים לרעה על התחבורה (נסקר ב ^-4). פיתוח שיטות לחקר המנגנונים שבאמצעותם חלבונים פתולוגיים מפעילים רעילות במחלות נחוץ כדי להבין הפרעות נוירודגנרטיביות ולזהות מטרות פוטנציאליות להתערבות טיפולית.

מספר תובנות חשובות על העברת אקסונים, כולל גילוי קינזין קונבנציונלי, מסלולים תלויי קינאז ופוספטאז המווסתים חלבונים מוטוריים, ומנגנונים שבאמצעותם חלבונים פתולוגיים משבשים את ויסות העברת האקסונים, נעשו באמצעות מודל אקסופלזמה של דיונון מבודד ^4,5. זילוח של אקסופלסמת דיונון עם צורות פתולוגיות של חלבון טאו מעכב הובלה אקסונלית מהירה אנטרוגרדית (FAT), השפעה התלויה בחשיפה של תחום הפעלת פוספטאז של טאו, אשר מפעיל את חלבון phosphatase 1 (PP1)^6,7,8. PP1 מפעיל גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3), אשר בתורו פוספורילטים קינזין שרשראות אור גורם לשחרור מטען. חלבון פתולוגי נוסף באלצהיימר הוא עמילואיד-β. צורות אוליגומריות של β עמילואיד מעכבות FAT דו-כיווני באמצעות קזאין קינאז 2, אשר פוספורילטים קינזין שרשראות אור⁹. יתר על כן, חלבון הנטינגטין פתולוגי בעל הרחבת פוליגלוטמין ומוטציה משפחתית SOD1 הקשורה ל-ALS משבשים כל אחד את ההובלה האקסונלית באקסופלזמה של דיונון דרך פעילות קינאז c-Jun N-terminal וחלבון קינאז p38 המופעל על ידי מיטוגן, בהתאמה^10,11.

בעוד מודל אקסופלזמה דיונון ממשיך להיות כלי רב ערך בהבנת ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית, גישה מוגבלת לציוד ולדגימות מונעת ממנו להיות בשימוש נרחב יותר. פיתחנו בדיקת הובלה באמצעות הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של תאים חיים של נוירונים ראשוניים של מכרסמים (עכבר וחולדה). מודל זה מייצג גישה מבוססת תאי עצב של יונקים הניתנת להתאמה ולמניפולציה בקלות באמצעות מקורות תאים זמינים באופן נרחב ומערכות מיקרוסקופיה. לדוגמה, מגוון חלבונים פתולוגיים (למשל, בעלי שינויים הקשורים למחלות) באים לידי ביטוי כדי לזהות כיצד שינויים ספציפיים של חלבונים אלה משפיעים על ההובלה באקסונים. באופן דומה, ניתן להשתמש במגוון חלבוני מטען בעלי תיוג פלואורסצנטי כדי לבחון שינויים ספציפיים למטען. יתר על כן, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים נחקרים בקלות יחסית על ידי מיקוד ביטוי (כלומר, הפלה או ביטוי יתר) של חלבונים נבחרים שעשויים לתווך השפעות אלה. שיטה זו גם מותאמת בקלות לתאי עצב ראשוניים שמקורם במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את בדיקת העברת האקסון החי ששימש בעבר בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי להראות כי חלבוני טאו מוטנטיים הקשורים לדמנציה של האונה הקדמית (FTLD; P301L או R5L tau) מגבירים את תדירות ההשהיה של חלבוני מטען בעלי תווית פלואורסצנטית דו-כיוונית¹². יתר על כן, הפלת האיזופורם PP1γ הצילה את השפעות ההשהיה¹². זה מספק תמיכה למודל של הפרעה פתולוגית הנגרמת על ידי טאו המתווכת באמצעות הפעלה חריגה של מסלול איתות ביוזמת PP1 כמתואר לעיל ^6,7,12. במחקר נפרד, הראינו כי פסאודו-פוספורילציה של טאו ב-S199/S202/T205 (הפוספואפיטופ AT8 הפתוגני הרלוונטי לטאופתיות) הגבירה את תדירות השהיית המטען ואת מהירות המקטע האנטרוגרד. השפעות אלה היו תלויות בתחום הפעלת הפוספטאז N-terminal של טאו¹³. דוגמאות אלה מדגישות את התועלת של מודל זה לזיהוי המנגנונים של האופן שבו חלבונים פתולוגיים משבשים את העברת האקסון בנוירונים של יונקים.

מאמר זה מספק תיאור מפורט של השיטה המתחילה בקציר, דיסוציאציה וטיפוח של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של עכברים, לאחר מכן טרנספקציה של תאי עצב עם חלבוני מטען המאוחים עם חלבון פלואורסצנטי, ולבסוף, גישת הדמיה וניתוח תמונה של תאים חיים. אנו מדגימים כיצד שיטה זו משמשת לחקר ההשפעות של טאו שונה על ההובלה הדו-כיוונית של החלבון הקשור לשלפוחית, סינפטופיזין, כדוגמה. עם זאת, קיימת גמישות בחלבון הפתוגני ובחלבון המטען התובלה, מה שהופך את זה לגישה רב-תכליתית לחקר הובלה אקסונלית.

פרוטוקול

פרוטוקולים אלה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. פרוטוקול זה יושם בהצלחה על עכברי Tau Knockout על רקע C57BL/6J וחולדות Sprague Dawley מסוג Wild. זנים אחרים צריכים להיות מקובלים גם כן.

1. קציר נוירונים ראשוני בהיפוקמפוס

1. צפו שקופית תא תחתון מזכוכית בעלת 4 בארות בפולי-די-ליזין מסונן במינון 0.5 מ"ג/מ"ל (PDL) במאגר בוראט (12.5 מ"מ נתרן בוראט דקהידראט ו-50 מ"מ חומצה בורית). מוסיפים 750 מיקרוליטר/באר ודגורים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
2. שטפו את שקופית התא 4x במים סטריליים נטולי יונים. יש לייבש באוויר לאחר הכביסה האחרונה ולשמור על טמפרטורה של 4°C לאחסון לטווח קצר (<1 שבוע).
   הערה: אין לאפשר ל-PDL להתייבש במגלשה לפני ובין השטיפות, שכן הדבר רעיל לתרביות. אנו מוצאים כי אחסון לטווח ארוך יותר של שקופיות מצופות PDL עשוי להשפיע על הבריאות העצבית וכי שמירה על מרווחים עקביים בין ציפוי לציפוי מפחיתה את השונות בין המסלולים בכדאיות התרבית.
3. השג עכבר או חולדה בהריון מתוזמן.
   הערה: ניתן להזמין בעלי חיים בהריון מתוזמן מחברות שונות או לגדל בבית. יום האפס העוברי מתייחס ליום שבו נמצא הפקק הנרתיקי, והייתה לנו הצלחה בטיפוח E16-18 עכבר נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח באמצעות גישה זו. נוירונים של חולדות נקצרים גם ביום העוברי ה-18.
4. ב-E18 יש להרדים את הנקבה ההרה בשיטה מאושרת. חותכים דרך דופן הבטן ומסירים את שתי קרני הרחם. העבירו אותם לצלחת פטרי המכילה 0.9% מלוחים קרים כקרח. יש לשטוף עד שהמלח נקי.
   הערה: אנו נותנים מנת יתר של נתרן pentobarbital (לפחות 100 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה intraperitoneal.
5. ערפו את ראשיהם של הגורים. מתחילים בפתח המגנום (הפתח בחלק האחורי של הגולגולת), משתמשים במספריים מיקרודיסקציה כדי לחתוך את העור והגולגולת לאורך קו האמצע, תוך זווית הקצה התחתון של המספריים כלפי מעלה לחלק הפנימי של הגולגולת כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
6. הסר את העור שמעל ובזהירות הסר את הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
7. השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את אזור הפה/אף ולסובב את הגולגולת כך שהמוח פונה כלפי מטה מעל צלחת פטרי מלאה במי מלח 0.9%. הפוך את המוח מתוך הגולגולת וחתך את העצבים ואת גזע המוח כדי לשחרר את המוח לתוך מלוחים.
8. הניחו את צלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ מנתח לדיסקציה של ההיפוקמפוס. הכניסו מספריים לקו האמצע של המוח, סובבו את המספריים כך שהלהב העליון ידחוף את אחת מהמיספרות המוח החוצה, וגזרו כדי להפריד את ההמיספרה מהאזורים התת-קליפתיים.
9. בצע חתך אנכי דרך קליפת המוח כך שקליפת המוח המצחית תהיה קדמית לאתר החיתוך, וההיפוקמפוס יהיה אחורי אליו. הכנס את הקצה התחתון של המספריים לתוך החור שנוצר וחתוך בזהירות לאורך קודקוד קליפת המוח ונעצר בקצה האחורי.
10. בעזרת המלקחיים, הניפו בזהירות את קליפת המוח וסיימו את החתך האחורי. ההיפוקמפוס צריך להידמות לצורת סהר. חתכו בזהירות את קליפת המוח הנותרת כך שההיפוקמפוס ישמור על צורתו המעוגלת והסהר.
11. בעזרת מלקחיים ומספריים, הסירו בעדינות את קרומי המוח מההיפוקמפוס.
    הערה: חשוב להסיר את כל קרומי המוח מהמוח כדי להפחית את מספר התאים הלא-עצביים שנאספים תוך הימנעות מפגיעה או קריעה של רקמת ההיפוקמפוס.
12. חתכו את ההיפוקמפוס לארבע חתיכות שוות והכניסו את הרקמה לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל המלא בחיץ קר כקרח נטול סידן ומגנזיום (CMF; PBS של Dulbecco עם 0.1% גלוקוז, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל Amphotericin B, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין).
    הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אספו את ההיפוקמפוס בין 5-10 גורים בכל דיסוציאציה. כל היפוקמפוס אמור לספק כ-300,000 תאים לעכברים ו-500,000 תאים לחולדות.

2. דיסוציאציה ראשונית של נוירון ההיפוקמפוס וציפוי

1. מוציאים את ה-CMF עם פיפטה של פסטר ושוטפים את הרקמה ב-CMF 4x קר טרי, תוך ערבול עדין בין השטיפות.
2. הסר את CMF והוסף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.125% מסוננת (לדלל 2.5% טריפסין ב-CMF מחומם מראש [37°C]). לדגור את הרקמה בדיוק 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; מערבלים בעדינות כל 5 דקות.
   הערה: יש להכין את תמיסת הטריפסין מיד לפני השימוש.
3. הכן 5 מ"ל של תמיסת השבתת טריפסין (TIS; תמיסת מלח מאוזנת של הנקס, 20% סרום עגל שזה עתה נולד ותמיסת DNase I 1x [מלאי פי 10: 5 מילימטר נתרן אצטט, 1 מיקרומטר סידן כלורי, 0.5 מ"ג/מ"ל DNase I]).
4. הסר את תמיסת הטריפסין ושטוף 2x עם CMF קר. הוסף 3 מ"ל של TIS קר.
5. נתק תאים באמצעות טריטורציה באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחטים בקוטר הולך וקטן יותר: triturate 30x באמצעות מחט 14 גרם, 30x באמצעות מחט 15 גרם, 20x באמצעות מחט 16 גרם, 20x באמצעות מחט 18 גרם, ו 15x באמצעות מחט 21 גרם. השתמש 2 s draws draws עם ארבע המחטים הראשונות ו 3 s draws draws עם מחט 21 G.
   הערה: ניתן להשתמש גם בשיטות אחרות של טריטורציה (למשל, פיפטות זכוכית מלוטשות אש^14,15). אנו מוצאים כי שימוש במחטי מזרק מתכת סטנדרטיות מפחית באופן מהותי את השונות בגושי התאים ובכדאיות.
6. בעזרת מחט 21 גרם, הניחו טיפה של תרחיף התא על מגלשת מיקרוסקופ ובדקו אם יש גושי תאים. אם נצפים מספר גושים, יש לשלש שלוש פעמים נוספות דרך מחט 22 גרם ולבדוק שוב. חזור על תהליך זה עד לקבלת תרחיף חד-תאי הומוגני, תוך הקפדה על טריטורציה עדינה לאורך כל התהליך.
7. סנן 5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) באמצעות מסנן מזרקים 0.22 מיקרומטר. שכב בעדינות את מתלה התא על FBS בצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים (200 × גרם ב 4 ° C) במשך 5 דקות.
8. הסר כמה שיותר FBS מבלי להפריע לכדור. יש להשהות מחדש ב-1 מ"ל של חומר נוירו-בסיסי חם (37°C) נטול אנטיביוטיקה (NBM; בתוספת 1x תחליף גלוטמין ו-1x B-27).
9. לדלל את תרחיף התא בכחול טריפאן (0.4%) ולקבל ספירת תאים.
   הערה: דילול 1:1 פועל היטב עבור מונה תאים אוטומטי ומשתמש בדילול 1:60 לספירה ידנית עם המאציטומטר. כדי להמשיך לציפוי התא, הכדאיות של תא העצב צריכה להיות גבוהה מ-90% בשלב זה. זה משפר באופן משמעותי את הסבירות של תרבית נוירונים בריאה לאחר דיסוציאציה.
10. לוחה את התאים בצפיפות של 175,000 תאים/באר (70,000 תאים/מ"^{מ 2}) בשקופית ארבע בארות מצופה PDL שחוממה מראש ב-750 מיקרוליטר של NBM ללא אנטיביוטיקה. בנוסף, צלחת 200,000 תאים/באר בארבע בארות של צלחת 24 בארות מצופת PDL ב-1.5 מ"ל של NBM ללא אנטיביוטיקה לשימוש כמדיום מותנה בטרנספקציה המתוארת בסעיף 3. יש לדגור על התאים בתא מבוקר לחות של 37°C ו-5%_CO2 .
    הערה: ניתן להתאים את צפיפות התאים בהתבסס על התוצאות. צפיפות גבוהה יכולה להקשות על דימוי הנוירונים, בעוד שצפיפויות נמוכות יכולות להשפיע לרעה על בריאות התרבות והישרדות הנוירונים. מניסיוננו, תאי עצב של חולדות יכולים להיות מצופים בצפיפות נמוכה יותר בהשוואה לתאי עצב של עכברים.

3. טרנספקציה נוירון

הערה: ניתן להדביק תאי עצב ב-DIV 7 או ב-DIV 8 ללא שינויים ניכרים ביעילות הטרנספקציה או בתוצאות ההובלה. נפחים אלה מיועדים לארבע בארות של שקופית תא זכוכית בעלת ארבע בארות בנפח/באר של 750 מיקרוליטר. פרוטוקול זה מתאר טרנספקציה באמצעות ריאגנטים טרנספקציה של שומנים. יש לאפשר למדיה ולריאגנטים להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

1. הכן מגיב מלאי transfection על ידי הוספת 4.4 μL של מגיב transfection ל 127.6 μL של מדיום סרום מופחת. רוקדים בעדינות ביד כדי לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
2. הכינו מלאי DNA במהלך הדגירה של טרנספקציית השומנים. הוסף 200 ננוגרם של דנ"א פלואורסצנטי (pFIN mApple-synaptophysin; 12,112 זוגות בסיסים) ו-200 ננוגרם של דנ"א כדי לבטא את החלבון המעניין (פלסמידים טאו ששימשו היו מבני pCMV tau-Flag; 5,036 זוגות בסיסים) לתווך מופחת בסרום או ללא סרום עד לנפח סופי של 32 μL¹². הוסף 0.8 μL של מגיב משפר transfection (2 μL לכל מיקרוגרם של DNA). מערבבים היטב ביד.
   הערה: אנו מוצאים כי נגזרת של RFP עובד הכי טוב (mApple או mCherry), אבל GFP יכול לשמש גם כן. בנוסף, ניתן לכלול מבנה דנ"א המבטא RNA קטן (shRNA) המשתיק גנים כדי לבחון מנגנונים של פנוטיפים שנצפו עם ביטוי החלבון המעניין. לשם כך, כלול 150 ננוגרם של כל אחד משלושת מבני הדנ"א בתמהיל הדנ"א והתאם את כמות מגיב משפר הטרנספקציה בהתאם. שינוי הפרמטרים של DNA או מגיב lipofection יכול להשפיע על יעילות transfection והוא יכול להיות מותאם על בסיס הצורך transfections יעיל פחות או יותר.
3. הוסף 32 μL של תערובת טרנספקציה שומנים לכל צינור של DNA. רוקדים בעדינות ביד כדי לערבב. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
4. הוסיפו לאט 64 μL של תערובת מגיב DNA/טרנספקציה לתאים על ידי הנחת קצה הפיפטה ממש מתחת לפני השטח של התווך ותנועה בתנועה סרפנטית ברחבי הבאר. נענעו בעדינות את המגלשה התאית ביד 3x לאחר הוספה לכל הבארות כדי לערבב עוד יותר ולמקם את המגלשה התאית באינקובטור. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך שעתיים.
   הערה: מזערו את משך הזמן שבו תאי עצב נמצאים מחוץ לאינקובטור מכיוון שהם רגישים מאוד לשינויים בטמפרטורה וב-pH, שיכולים להתרחש במהירות.
5. בצע שינוי חצי בינוני שעתיים לאחר הטרנספקציה עם מדיה מותנית + נוגדן נוירופשין. מיד לפני השינוי הבינוני, מאגר 1.5 מ"ל של NBM מותנה ללא אנטיביוטיקה מהתאים שגודלו בתרבית על צלחת 24 בארות. הוסף 0.75 μL של נוגדן Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/mL) למדיום המותנה.
   הערה: נוגדן NF-186 מזהה תחום חוץ-תאי של נוירופאשין המועשר במקטע הראשוני של האקסון (AIS) כדי לזהות בוודאות את האקסון לצורך הדמיה.
6. בצע שינוי בינוני מלא 18 שעות לאחר transfection עם מדיום מותנה המכיל את הנוגדן המשני. הוסף 1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז מצומד ל- AlexaFluor 647 עד 3 מ"ל של NBM מותנה (ללא אנטיביוטיקה) המצטבר מצלחת 24 הקידוחים. מערבבים היטב.

4. דימות נוירונים

1. התכוננו להדמיה יומיים לאחר ההעברה. חממו את חיבור תא התא החי למיקרוסקופ קונפוקלי ל-37°C (כולל 60x אובייקטיבי ושמן עדשה) ואזנו את התא ל-5%_CO2.
2. השתמש במטרה להגדלה גבוהה ובתא תא חי כדי לצלם את התאים.
   הערה: אנו משתמשים במטרה של 60x 1.40 NA במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, אך ניתן להשתמש גם במערכות מיקרוסקופיה קונפוקליות אחרות (למשל, דיסק מסתובב) או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה אם הן מסוגלות להשיג קצב פריימים גבוה של הדמיה.
3. זהה חזותית נוירונים נגועים בערוץ המכיל את חלבון המטען באמצעות העיניות. לאחר מכן, דמיינו את תאי העצב כדי לזהות את ה-AIS בערוץ Cy5 (איור 1).
4. הגדר את שדה הראייה לתיבה מלבנית של 32 פיקסלים על 128 פיקסלים והזז אותו לתמונה אזור של האקסון ~ 50-150 מיקרומטר דיסטלי ל- AIS. שים לב ורשום את כיווניות הובלת המטענים ואת כיוון החזר ההשקעה. הנקודות על הקופסה יופיעו בחלק העליון והימני, בהתאמה, של כל התמונות והסרטים הבאים. רשום איזה צד של התמונה הוא הקרוב ביותר לגוף התא ואיזה קרוב למסוף האקסון כך שניתן יהיה לצייר את פוליליין הקימוגרף בשלב 5.1 עם הכיוון הנכון.
   הערה: בשעת בחירת אזור העניין, האזור המצולם של אקסון מבודד צריך להיות ישר יחסית ולחצות את שדה הראייה בכל קצה. המקטע כולו צריך להיות באותו מישור מוקד. האזור צריך להציג בבירור הובלה פעילה של מטענים. נוירונים בהירים יתר על המידה בדרך כלל מבטאים את חלבון המטען ואת החלבונים המעניינים ברמות שסביר להניח שיהיו רעילות לנוירון ויש להימנע מהן.
5. הגדר את עוצמת הלייזר 561 ל - 1.40, את חור הסיכה ל- 7.8, את הגודל ל- 128 פיקסלים² ואת המהירות ל- 32 פריימים לשנייה. התאם את הרווח כדי לדמיין את ההובלה של שלפוחיות מטען בודדות מבלי שהוא יוסתר על ידי אות רקע (בדרך כלל בין 10 ל - 50 תוצאות בקימוגרפים באיכות גבוהה).
   הערה: עוצמת הלייזר הנמוכה במיוחד ניתנת להשגה הודות לגלאי GaAsP רגישים במיוחד ומונעת השפעות פוטוטוקסיות פוטנציאליות והלבנה של מטען נע. גודל חור הסיכה מוגדר רחב ככל האפשר כדי להגדיל את עומק המוקד כדי להבטיח שכל החזר ההשקעה יצולם מכיוון שייתכן שהאקסון לא ישכב שטוח לחלוטין על פני השטח של המגלשה.
6. הגדר את החזר ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות צייר החזר השקעה מלבני... מהתפריט הנפתח החזר השקעה . צייר את החזר ההשקעה כך שיכסה את כל שדה הראייה. לחץ לחיצה ימנית על החזר ההשקעה ובחר השתמש כגירוי ROI: S1.
7. הכן את הגדרת ND על-ידי הכללת השלבים הבאים בכרטיסיה הגדרת ND.
   הערה: זהו פרוטוקול רכישה בן חמישה שלבים המוגדר פעם אחת ולאחר מכן יבוצע על-ידי התוכנה בכל פעם שהסרטים נאספים.
   1. רכוש תמונה כדי לאסוף את תמונת הייחוס לגירוי מקדים.
   2. גירוי; החזר השקעה: S1; מרווח: NoDelay; משך 1.64 שניות, לולאות: 7. שלב זה מלבין פלואורסצנטיות רקע עם מספר פולסים של הלייזר.
   3. רכוש תמונה. שלב זה אוסף תמונת הפניה לאחר גירוי.
   4. מחכה; ללא אקשן; 2 דקות שלב זה מספק תקופת התאוששות למטען פלואורסצנטי כדי לאכלס מחדש את החזר ההשקעה המולבן.
   5. רכישה; מרווח: NoDelay; משך הסרט 5 דקות, לולאות: 8,615. שלב זה אוסף תמונות בקצב המרבי למשך 5 דקות ההדמיה.
8. לאחר הגדרת פרוטוקול ND Setup, לחץ על הלחצן Apply Stimulation Settings בכרטיסייה ND Setup . לחץ על הפעל עכשיו כאשר אתה מוכן לצלם הובלת מטענים. פעולה זו תפעיל את פרוטוקול ND Acquisition משלב 4.7.
   הערה: למרות שקצב המסגרות מוגדר ל- 32 מסגרות לשנייה, קצב המסגרות המעשי עשוי להיות איטי יותר (~28.7 מסגרות לשנייה). יש לרשום ערך זה לצורך ניתוח קימוגרף מדויק בסעיף 5. באופן אידיאלי, הדמיה של הובלת תאים חיים נעשית בקצב הפריימים המהיר ביותר האפשרי (למשל, >25 פריימים לשנייה) כדי לפענח טוב יותר את תנועות המטען.
9. אפס את שדה הראייה לתמונה כולה; לאחר מכן, אסוף ושמור תמונה של תא העצב המלא בערוצים 561 ו- 647 עם תיבת החזר ההשקעה כלולה. רשום את קואורדינטות XY שבהן התמונה צולמה לאישור לאחר הקיבוע של ביטוי החלבון המעניין.
10. אספו סרטוני העברה משני תאי עצב לפחות לצורך ניתוח. ודא שכל שכפול בלתי תלוי מגיע מאמצעים של משתנים שנמדדו מקצירת נוירונים ראשונית בודדת (כלומר, לא נוירונים בודדים).
    הערה: עבור קציר נוירונים ראשוני נתון, אנו אוספים קטעי וידיאו מ-2-4 תאי עצב בכל מצב.
11. תקן את התאים על ידי הסרת המדיום ודגירה עם 4% paraformaldehyde שחומם מראש במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המאגר ושטוף תאים למשך 3 x 5 דקות כל אחד ב- TBS.
    הערה: עבור קיבוע paraformaldehyde, אנו משתמשים במאגר cytoskeleton, חיץ נפוץ השומר על מבנה cytoskeletal (10 mM 2-(N-morpholino)חומצה ethanesulfonic [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, ו 4 mM EGTA, pH 6.1). מאגרים אחרים (למשל, TBS, PBS) יכולים לשמש גם לקיבוע.
12. אשרו כי הנוירונים המנותחים מבטאים הן את החלבון המעניין והן את חלבון המטען המתויג באופן פלואורסצנטי באמצעות צביעה אימונוציטופלואורסצנטית. כתם לטאו אנושי (Tau12) כדי לאשר ביטוי טאו אקסוגני וטובולין β-III (Tuj1) כדי לוודא שהנוירונים נשארו בריאים לאורך כל תהליך ההדמיה.
    הערה: אנו צופים בביטוי משותף של שני מבני הדנ"א כמעט בכל התאים הנגועים בשיטות אלה.

5. צור ונתח קימוגרפים

הערה: ניתן ליצור ולנתח קימוגרפים באמצעות מגוון תוכניות שונות. אנו מתארים בקצרה את תוכנת KymoAnalyzer (v. 1.01) הזמינה באופן חופשי באמצעות שישה תוספי ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. תוספים אלה ניתן להוריד מהמפתחים באתר מעבדת Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). הוראות מפורטות יותר לשימוש בתוכנה זו ניתן למצוא באתר זה.

1. קבץ את הסרטים שנוצרו בשלב 4.9 בהתבסס על תנאי ניסוי ושוכפל. הפעל את המאקרו BatchKymographGeneration ובחר את התיקיה המתאימה. צייר פוליליין קימוגרף כדי לעקוב אחר האקסון המתחיל בקצה הפרוקסימלי בתמונה מסוימת זו. הקימוגרפים המתקבלים מאוחסנים בתיקייה שנבחרה (איור 2).
2. הקצה רצועות באופן ידני על-ידי הפעלת המאקרו 'מסלולים', בחירת תיקיית סרט בודדת, בחירה באפשרות כן כדי להוסיף רצועה ולאחר מכן לחיצה כדי לעקוב אחר המסלול של כל חלקיק. בצע את הלחיצה הראשונית בראש המסלול ולחץ שוב בכל נקודה שהחלקיק משנה מהירות או כיוון כך שהפוליליין מכסה את עקבות החלקיק בקימוגרף. לאחר הנחת קו פולי על כל המסילה, לחץ על אישור. חזור על הפעולה עד להקצאת כל הרצועות.
3. הפעל את פקודות המאקרו הנותרות, תוך הקצאת קצב פריימים וגודל פיקסלים בהתבסס על פרמטרי ההדמיה. ראשית, הפעל את CargoPopulation, לאחר מכן NetCargoPopulation, ולאחר מכן Segments. הזינו את גודל הפיקסלים ואת קצב הפריימים של הסרטים כשתתבקשו לעשות זאת (0.22 מיקרומטר ו-28.7 פריימים לשנייה, בהתאמה, בעזרת הגדרות אלה). לבסוף, הפעל את המאקרו poolData כדי לחשב ולאגד נתוני פרמטר תעבורה מכל הקימוגרפים בתיקיה שנבחרה.
4. שרטט את התוצאות מקבצי הנתונים והשווה את התנאים השונים עם הרפליקטים הבלתי תלויים המיוצגים על ידי הערכים הממוצעים של כל תאי העצב שנותחו בתנאי ניסוי עבור קצירת נוירונים בודדים.

תוצאות

באמצעות שיטות אלה, אפיינו הובלה אקסונלית בנוכחות צורות פראיות או הקשורות למחלות של חלבון טאו כדי לבחון מנגנונים פוטנציאליים של רעילות עצבית פתולוגית הנגרמת על ידי טאו במחלה^12,13. תוכנת KymoAnalyzer מחשבת ואוספת מגוון פרמטרים שונים מכל הקימוגרפים בתוך תיקייה נתונה. תעריפי ההובלה מחושבים רק כאשר המטען נמצא בתנועה (מהירות סגמנטאלית) וכן התעריף הכולל, כולל הפסקות (מהירות נטו). כמות המטען מחושבת כסך הכל, צפיפות (#tracks/μm) או שטף (#tracks∙^μm-1∙^s-1

דיון

ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שחלבונים פתולוגיים מרובים הקשורים למגוון הפרעות נוירודגנרטיביות משבשים את התחבורה האקסונלית המהירה בנוירונים. זה מייצג מנגנון משותף פוטנציאלי של רעילות עצבית על פני מחלות אלה. כדי להבין טוב יותר את התהליך שבו החלבונים האלה משבשים את השינוע, אנו זקוקים לכלים ולמודלים שיאפשרו לנו לענות על שאלות ספציפיות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת לבחון מנגנונים המופעלים על ידי חלבונים פתולוגיים כדי להשפיע לרעה על הובלת מטענים בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ממכרסמים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.4% טריפן כחול	גיבקו	15250-061
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	DOT	RN1700-GMT
2.5% טריפסין	גיבקו	15090-046
מזרק 3 מ"ל עם מחט 21 גרם	פישר	14-826-84
10 מ"ל מזרק פלסטיק	פישר	14-823-2A
14 גרם מחט	פישר	14-817-203
15 גרם	מחט Medline	SWD200029Z
16 גרם מחט	פישר	14-817-104
18 גרם מחט	פישר	14-840-97
22 גרם מחט	פישר	14-840-90
32% פרפורמלדהיד	פישר	50-980-495
AlexaFluor 647 עז אנטי ארנב IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
מלקחיים קפסולה מיקרו עובריים Arruga, מעוקלים; 4 אינץ'	Roboz	RS-5163	אוטוקלאב
B-27 תוסף תזונה (50x), ללא סרום	Gibco	A3582801
BioCoat 24 בארות פולי D ליזין	פישר	08-774-124
חומצה בורית	סיגמא	B6768-1KG
סידן כלורי	סיגמא	C7902
Castroviejo 3 1/2 אינץ' אורך 8 x 0.15 מ"מ מספריים חדים זווית	Roboz	RS-5658	מכשיר
ספירת			אוטומטי או ידני
מיקרוסקופ קונפוקלי עם חיבור	תא חי
			הדמיה קונפוקלית
D-(+)-גלוקוז	Sigma	G7528
DNase I (וורת'ינגטון)	פישר	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Sa	Salt Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus	Solution Vortech פרמצבטיקה בע"מ	NDC 0298-9373-68	נתרן פנטוברביטל; ניתן להשתמש בשיטות אחרות מאושרות להמתת חסד
סרום בקר עוברי	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	תחליף גלוטמין
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס	Gibco	24020-117
ImageJ גרסה 1.51n	ImageJ		Life-Line גרסה 2017 30 במאי: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (גרסה 1.01)	חבילת המעבדה		כוללת את כל 6 פקודות המאקרו: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	שימוש עם מגיב משפר טרנספקציה P3000
מגנזיום כלוריד	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
מספריים מיקרו חיתוך 3.5 "ישר חד / חד	Roboz	RS-5910	חיטוי
נוירובזאלי פלוס בינוני	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) עכבר IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; עובד בתאי עצב של חולדות, לא בנוירונים של עכברים
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; עובד בנוירונים של עכברים, לא בדקנו בנוירונים של חולדות
יילוד סרום	עגל Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
צלחת פטרי, זכוכית 100 x 10 מ"מ	פישר	08-748B	לדיסקציה;
צלחת פטרי חיטוי, זכוכית 100 x 20 מ"מ	פישר	08-748D	להכניס קרני רחם פנימה; אוטוקלאב
פולי-D-ליזין	סיגמא	P7886-100MG
צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן (15 מ"ל)	פישר	14-955-238
צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן (50 מ"ל)	פישר	14-955-238
אשלגן כלורי	פישר	P217-500
נתרן אצטט	סיגמא	S5636
נתרן בוראט דקהידראט	VWR	MK745706
מספריים הפעלה עם להב ישר קהה / חד	פישר	13-810-2
מסנני מזרק חיטוי, 0.22 ומיקרו; m	VWR	514-1263
מלקחיים להלבשת אגודל, משוננים, 4.5 אינץ'	Roboz	RS-8100	חיטוי
ומיקרו;-שקופית 4 באר זכוכית תחתונה	Ibidi	80427