Method Article

יצירה וניתוח במורד הזרם של תעתיקים חד-תאיים וגרעינים בודדים באורגנואידים במוח

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשור האחרון, שעתוק חד-תאי התפתח באופן משמעותי והפך לשיטת מעבדה סטנדרטית לניתוח סימולטני של פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים, המאפשר ללכוד את המגוון התאי. על מנת להתגבר על המגבלות שמציבים סוגי תאים קשים לבידוד, ניתן להשתמש בגישה חלופית שמטרתה לשחזר גרעינים בודדים במקום תאים שלמים לריצוף, מה שהופך את פרופיל השעתוק של תאים בודדים ליישום אוניברסלי. טכניקות אלה הפכו לאבן פינה בחקר אורגנואידים במוח, וביססו אותם כמודלים של המוח האנושי המתפתח. תוך מינוף הפוטנציאל של שעתוק חד-תאי וחד-גרעין במחקר אורגנואידים במוח, פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב המקיף הליכים מרכזיים כגון דיסוציאציה אורגנואידית, בידוד תא בודד או גרעינים, הכנת ספרייה וריצוף. על ידי יישום גישות חלופיות אלה, חוקרים יכולים להשיג מערכי נתונים באיכות גבוהה, המאפשרים זיהוי של סוגי תאים עצביים ולא עצביים, פרופילי ביטוי גנים ומסלולי שושלת תאים. זה מאפשר חקירות מקיפות של תהליכים תאיים ומנגנונים מולקולריים המעצבים את התפתחות המוח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות אורגנואידים התגלו ככלי מבטיח לתרבית רקמות דמויות איברים 1,2,3. במיוחד עבור איברים שלא ניתן לגשת אליהם בקלות, כגון המוח האנושי, אורגנואידים מציעים הזדמנות לקבל תובנות לגבי התפתחות וביטוי מחלות4. ככאלה, אורגנואידים במוח נמצאים בשימוש נרחב כמודל ניסיוני לחקר הפרעות מוח אנושיות שונות, כולל מחלות התפתחותיות, פסיכיאטריות או אפילו נוירודגנרטיביות 4,5,6.

עם הופעתן של טכנולוגיות פרופיל שעתוק חד-תאי, רקמות אנושיות ראשוניות ומודלים מורכבים במבחנה יכלו להיחקר ברמת פירוט חסרת תקדים, לספק תובנות מכניסטיות לגבי שינויים בביטוי גנים ברמת תת-אוכלוסיות התא בבריאות ובמחלות וליידע על מטרות טיפוליות משוערות חדשות 7,8,9. תחום האורגנואידים התקדם על ידי שימוש בפרופיל שעתוק חד-תאי כדי להעריך את הרכב התא, יכולת השחזור והנאמנות של טכנולוגיות אורגנואידים במוח 10,11,12. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) איפשר סיווג תאים וזיהוי של חוסר ויסות גנטי באורגנואידים חולים13,14. חשוב לציין, המורכבות של רקמות אורגנואידים היא שמחייבת יישום של טכניקות המאפשרות פרופיל של תאים בודדים. אפיון אורגנואידים בשיטות כגון פרופיל שעתוק בתפזורת (ריצוף RNA בתפזורת) מוביל להטרוגניות תאית מוסווית ולפרופילי ביטוי גנים הממוצעים על פני כל סוגי התאים ברקמה המורכבת, ובסופו של דבר מגבילים את הבנתנו את התהליכים המתמשכים במהלך התפתחות אורגנואידים בבריאות ובמחלות 15,16,17 . ככל ששיטות scRNA-seq ממשיכות להתקדם, מספר גדל והולך של אטלסים נוצרים, כפי שמודגם על ידי משאבים כמו אטלס המוח אלן או אטלס התא היחיד של אורגנואידים במוח האנושי על ידי Uzquiano et al.18.

השגת scRNA-seq מוצלח מאורגנואידים במוח מסתמכת על בידוד יעיל ולכידת תאים שלמים. מכיוון שהדיסוציאציה של אורגנואידים במוח להשגת תאים בודדים מבוססת על עיכול אנזימטי, היא יכולה להשפיע על דפוסי ביטוי גנים על ידי גרימת מתח ונזק לתאים19,20. לפיכך, הדיסוציאציה של הרקמה לתאים בודדים היא הצעד המכריע ביותר. גישה חלופית היא ריצוף RNA חד-גרעין (snRNA-seq), המאפשר מיצוי ללא אנזימים של גרעינים מרקמה21,22 טרייה וקפואה. עם זאת, בידוד גרעינים מרקמה מציב אתגרים אחרים כגון העשרת סוגי תאים מעניינים ותכולת RNA נמוכה של גרעינים בהשוואה לתאים.

מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח נערכים בדרך כלל באמצעות scRNA-seq 10,18,23. עם זאת, בידוד של גרעינים בודדים עשוי לספק שיטה אורתוגונלית ומשלימה לחקור את הפרופיל התעתיק של אורגנואידים. כאן, אנו מציגים ארגז כלים עבור scRNA- ו- snRNA-seq עבור אורגנואידים במוח ודנים בנקודות הקריטיות להשגת נתוני ריצוף באיכות הטובה ביותר.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר מבוצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 1 של מרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית (מספר אישור: 138/08), בהתאם לדרישות ובהתאם לכללי האתיקה של האיחוד האירופי והמדינה במחקר.

1. גזירה של אורגנואידים במוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)

הערה: פרוטוקול זה נבדק עבור מספר קווי iPSC שונים שגודלו בתרבית במגוון מדיה של תאי גזע מחברות שונות (טבלה 1). הדור של אורגנואידים במוח הקדמי תלוי מאוד בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באיכות גבוהה ובמפגש של 60%-70% לפני תחילת הפרוטוקול. כאן השתמשנו בקו תאים זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).

  1. יום 0: היווצרות גוף עוברי
    1. לטיפול בצלחת 96 בארות עם תמיסה פלורונית, יש להוסיף 80 μL של תמיסה פלורונית מסוננת סטרילית 2% לכל באר של צלחת U-תחתונה 96 בארות. יש לדגור במשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר (RT) או 37°C.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות שטופלוניות בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים וניתן להשתמש בהן ישירות ללא שלבי שטיפה ליצירת גוף עובר.
    2. הסר תמיסה פלורונית מכל באר באמצעות שואב או פיפטה רב ערוצית לפני זריעת תאים.
    3. לפני שתתחיל, להכין את הריאגנטים הבאים עבור צלחת אחת 96 באר: 15 מ"ל צינור צנטריפוגה עם 5 מ"ל של DMEM מחומם מראש: F12 בינוני; 11 מ"ל של מדיום תאי גזע בתוספת 50 מיקרומטר Y-27632, צלחת שטופלה פלורונית (כמתואר לעיל).
    4. שאפו מדיה מבאר אחת של צלחת 6 בארות של 60-70% iPSCs מתמזגים. שטפו תאים פעם אחת עם PBS. הוסף 500 μL של מגיב מבוסס טריפסין ודגור במשך 2-6 דקות ב 37 ° C.
      הערה: זמן הדגירה לניתוק תקין של תאים עם מגיב מבוסס טריפסין תלוי בצפיפות התא ובתכונות דבק מטריצת התא של כל קו iPSC. כדי למנוע עיכול יתר, מומלץ לבחון את המורפולוגיה של התא לאחר 2 דקות של דגירה עם מגיב מבוסס טריפסין באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
    5. נתק תאים באמצעות פיפטה 1000 μL והעבר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל שהוכן בעבר עם מדיום DMEM:F12 כדי לעצור דיסוציאציה.
    6. תרחיף תאי צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 300 x גרם. שאפו סופרנאטנט ושמרו על כדורית התא. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום תאי גזע בתוספת 50 מיקרומטר Y-27632.
    7. ספור תאים באמצעות מונה תאים והוסף את מספר התאים הרצוי למצע תאי הגזע בתוספת 50 מיקרומטר Y-27632. יצירת גוף עוברי יחיד דורשת 3,000-12,000 תאים בהתאם לקו התא.
    8. העבר את תרחיף התא למאגר מגיב רב ערוצי באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. באמצעות פיפטה רב ערוצית, צלחת 100 μL / באר של תרחיף התא לתוך צלחת 96 באר שטופלה בעבר פלורונית.
    9. מניחים צלחת 96 באר באינקובטור ב 37 ° C, 5% O2 ו 5% CO2. כדי למנוע הפרעה במהלך היווצרות הגוף העוברי, הימנעו מהזזת הצלחת.
  2. יום 2: בדיקת היווצרות גוף עוברי
    1. בחנו את היווצרות הגוף העוברי באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר פי 10. גופים עובריים צריכים להציג קצוות ברורים ומוות תאי מינימלי.
    2. לשאוף כמה שיותר בינוני ולהחליף עם 100 μL / well של תווך תאי גזע. (קריטי) גופים עובריים מוסרים בקלות מהבאר במהלך חילופי בינוניים. שימו לב לא להסיר אותם, ולכן לפקח על המדיום לאחר שאיפה.
  3. יום 3: השראת נוירואקטודרם
    1. יש לשאוף כמה שיותר מדיום ולהחליף ב-120 μL/well של מדיום אינדוקציה ולהניח את הצלחת בטמפרטורה של 37°C, 20% O2 ו-5% CO2.
  4. יום 6: הטבעה
    1. בהתאם לקו iPSC, נדרשים 3 או 4 ימים כדי לגרום להופעת neuroectoderm. עקוב אחר גופים עובריים באופן קבוע. ברגע שהקצוות הופכים בהירים, גופים עובריים מוכנים להטמעה. השתמש באחת משתי השיטות השונות שניתן להשתמש בהן להטמעת גוף עוברי כמתואר להלן24.
    2. שיטת הטבעה 1: הטמעת קובצי Cookie
      1. הפשירו אליציטוט של ג'ל מטריצה חוץ-תאי לא מדולל על קרח למשך 1-2 שעות. (קריטי) שמרו תמיד את ג'ל המטריקס החוץ תאי על קרח כדי למנוע ממנו להתמצק. הכינו אליציטוטים מראש כדי למזער את זמן ההפשרה ואת מחזורי ההפשרה החוזרים ונשנים.
      2. חתכו את קצה פיפטה 200 μL באמצעות פטמות טופרים ואספו 16-32 גופים עובריים בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 1.5 מ"ל.
      3. להעביר את הגופים העובריים ב 67 μL של התקשורת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. מוסיפים 100 μL של ג'ל מטריצה חוץ-תאי באמצעות קצה פיפטה חתוך של 200 μL ומערבבים בעדינות.
      4. פזרו באופן שווה את גופי העובר בכלי בקוטר 6 ס"מ והניחו את הצלחת למשך 5-10 דקות כדי לאפשר לג'ל המטריקס החוץ תאי להתמצק.
      5. הוסף כ 4 מ"ל של מדיה בידול ודגור ב 37 ° C, 20% O2 ו 5% CO2. למחרת, מניחים את המנה על שייקר מסלול (84 סל"ד). ודא שכל הגוף העוברי מתנתק מלמטה. אם לא, השתמשו בקצה פיפטה חתוך ובמדיה כדי לנתק אותם בעדינות.
    3. שיטת הטבעה 2: הטבעה נוזלית
      1. הפשירו אליקוט של ג'ל מטריצה חוץ-תאי לא מדולל על קרח למשך 1-2 שעות והניחו אמצעי התמיינות על קרח. (קריטי) המדיה חייבת להיות קרה כקרח בעת הוספת ג'ל מטריצה חוץ-תאי.
      2. ברגע שהתווך קר, מוסיפים ג'ל מטריצה חוץ-תאי לריכוז הסופי של 2%. חותכים את קצה פיפטה 200 μL באמצעות פטמות טופר ומעבירים עד 24 גופים עובריים לבאר אחת של צלחת 6 בארות.
      3. הסר את כל המדיה העודפת והוסף כ -4 מ"ל של ג'ל מטריצה חוץ-תאי 2% / מדיה התמיינות לבאר אחת של צלחת 6 בארות. מיד מניחים את הצלחת על שייקר מסלול (84 סל"ד).
  5. ימים 9-20: בצע חילופי מדיה מלאים באמצעות מדיה בידול כל 3-4 ימים.
  6. יום 21-30: מעבירים אורגנואידים למדיית הבשלה ומבצעים חילופי מדיה מלאים כל 3-4 ימים.
  7. דיסוציאציה של אורגנואידים: עבור גרעינים בודדים ודיסוציאציה של תאים, השתמש באורגנואידים באיכות גבוהה. כדי למנוע כמויות עודפות של מוות תאי, באופן קבוע לחתוך את האורגנואידים כדי למנוע הצטברות של ליבה נמקית ולאפשר להם להתאושש במשך 2 שבועות לפני ניתוק אותם לניתוח נוסף.

2. גזירה של תא בודד מאורגנואידים

הערה: דיסוציאציה של תא בודד מבוצעת באמצעות ערכת הדיסוציאציה של רקמות עצביות (טבלה 2), המשתמשת בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית. כאן אנו מתארים דיסוציאציה מכנית ידנית. כחלופה, ניתן להשתמש במכונת דיסוציאציה.

  1. הכינו תמיסת STOP ו-0.04% BSA על קרח. הכינו תערובת אנזימים 1 ו-2 ו-0.04% BSA ב-PBS והניחו על קרח.
  2. אספו עד 5 אורגנואידים בבאר אחת של צלחת בת 6 בארות ושאפו עודפי מדיה ושטפו פעם אחת עם PBS כדי להסיר מדיה תרבותית. מניחים אורגנואידים במרכז הבאר ובעזרת אזמל טוחנים אורגנואידים ביסודיות.
  3. מוסיפים את תערובת האנזימים 1 ומניחים ב-37°C, 20% O2 ו-5% CO2, תוך ניעור ב-90 סל"ד למשך 10-15 דקות.
  4. בעזרת קצה פיפטה של 1000 μL, יש להשהות אורגנואידים מחדש על ידי פיפטינג עד פי 10. מוסיפים אנזים מיקס 2 ומערבבים היטב על ידי פיפטה בעזרת קצה פיפטה 1000 μL. מניחים בטמפרטורה של 37°C, 20% O2 ו-5% CO2, תוך ניעור ב-90 סל"ד למשך 10-15 דקות.
  5. עצור את תהליך הדיסוציאציה על ידי השעיה מחדש של תמיסת התא ב -10 מ"ל של תמיסת STOP קרה. סנן את תמיסת התאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. צנטריפוגה את תמיסת התא המסונן במשך 10 דקות ב 300 x גרם ב 4 ° C כדי ליצור כדור.
  6. לשאוף מדיה, משאיר גלולה תא תאים resuspend תאים ב 4 מ"ל של קר 0.04% BSA. סנן תמיסת תאים באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר וספור תאים באמצעות מונה תאים.
  7. צנטריפוגה את תמיסת התא למשך 10 דקות ב 300 x גרם ב 4 ° C. לשאוף תמיסת BSA, משאיר גלולה תא. תאי השהיה מחדש על פי מדריך ערכת microfluidics-based-snRNA-seq בתווך NSB+.

3. בידוד גרעינים בודדים מאורגנואידים

  1. מעבירים אורגנואידים ל-PBS צונן וחותכים כל אורגנואיד ל-4 חלקים. שטפו אורגנואידים 2x עם PBS צונן.
  2. חותכים במספריים את קצה הפיפטה של פיפטה 1000 μL ומעבירים חתיכות אורגנואיד למכין 2 מ"ל. שאפו PBS לחלוטין והוסיפו 1 מ"ל של מאגר ליזיס NP40.
  3. להקפיץ 3x עם dounce pestle A ו 3x עם dounce pestle B. להעביר את המתלים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. יש לשטוף את המשדר עם 1 מ"ל נוספים של חיץ ליזיס NP40 ולהעביר לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. דגירה במשך 5 דקות ב- RT ולאחר מכן מתלה צנטריפוגות למשך 5 דקות ב- 500 x גרם.
  4. לשאוף supernatant משאיר 50 μL של supernatant מאחור. הוסף 1 מ"ל של NSB+ מבלי להפריע לכדור. יש להשהות מחדש לאחר 5 דקות דגירה.
  5. מתלה שכבה על גבי שיפוע Percoll (שכבה תחתונה: 1 מ"ל של NSB + ו- 250 μL של Percoll, שכבה אמצעית: 1 מ"ל של NSB+ ו- 188 μL של Percoll, שכבה עליונה: 1 מ"ל של NSB+ ו- 125 μL של Percoll). (קריטי) בצעו שכבות בזהירות רבה כדי למנוע ערבוב שכבות.
  6. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 4 ° C, לשאוף supernatant ו resuspend ב NSB+. סנן תמיסת גרעינים באמצעות מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר.
  7. צביעה וספירה של גרעינים באמצעות DAPI ותא נויבאואר. השהה מחדש גרעינים על פי מדריך ערכת scRNA-seq מבוסס מיקרופלואידיקה.

4. הכנת הספרייה ורציפה

  1. לטעון 10,000 תאים וגרעינים לתוך מערכת microfluidics וליצור את הספרייה על פי המדריך של ערכת scRNA-seq מבוסס microfluidics (טבלה של חומרים).
  2. רצף את הספריות עם הערכה של 6 x 108 קריאות לכל ספריית snRNA-seq ו- 1.6 x 108 קריאות לכל ספריית scRNA-seq, וכתוצאה מכך רוויית רצף של 87% עבור ערכת הנתונים snRNA-seq ורוויה של 36% רצף עבור מערך הנתונים scRNA-seq.

5. ניתוח

  1. לבצע ניתוח של ריצוף באמצעות צינור ניתוח נתונים עבור scRNA-seq ו snRNA-seq וליישר קו מול הגנום GRCh38 האנושי. הכפיפו את מטריצת הספירה שנוצרה על ידי צינור זה לניתוח נוסף באמצעות חבילת R Seurat (גרסה 4.1.1)25.
  2. צור את אובייקט Seurat על ידי התחשבות בגנים שהיו מיוצגים בלפחות 5 תאים ושילוב תאים שהכילו לפחות 300 גנים. בצע סינון בקרת איכות נוסף על ידי שמירה על תאים שהכילו יותר מ -1000 גנים אך פחות מ -4000 גנים עבור מערך הנתונים scRNA-seq ויותר מ -800, אך פחות מ -4000 גנים לכל גרעינים עבור מערך הנתונים snRNA-seq. לא לכלול ערכות נתונים, תאים וגרעינים העולים על 5% קריאות מיטוכונדריאליות.
  3. כדי לצמצם אפקטי אצווה בין שתי השיטות, שלב את שתי ערכות הנתונים המסוננות, נרמל והצג באופן חזותי באמצעות Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). השמיט את אשכול 1 המציג מזהה מולקולרי ייחודי נמוך (UMI) וספירות גנים. לאחר מכן, עבור הצבירים מקצים זהויות תאים בהתבסס על גנים ידועים של סמן ועל מערך הנתונים של אורגנואידים בני 30 יום מאת Ana Uzquiano et. al. (קובץ קידוד משלים 1)18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את הרכב סוג התא של אורגנואידים במוח באמצעות scRNA-seq ו-snRNA-seq, אורגנואידים במוח נקצרו לאחר 30 יום של תרבית, שכן אורגנואידים בשלב זה כבר מציגים לולאות נוירואפיתליאליות המורכבות מאבות מוקפים באבות ביניים ונוירונים בשלב מוקדם 4,18. ניטור איכות האורגנואידים במהלך הגדילה והרבייה חיוני לקבלת נתונים אמינים של תא בודד וגרעין יחיד.

אורגנואידים נוצרים באמצעות הצטברות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתוך גופים עובריים (איור 1B,C). לאחר הרכבתם, גופים עובריים אלה צפויים להציג קצוות ברורים עם מינימום פסולת תאית (איור 1C). לאחר השראת הנוירואקטודרם, הגופים העובריים מפגינים הבהרה נצפית סביב פני השטח עם אזור פנימי כהה יחסית, מה שמצביע על השראה עצבית מוצלחת (איור 1D). בשבועות שלאחר מכן, האורגנואידים מפתחים מה שנקרא לולאות, מבנים דמויי רוזטה עצבית, המורכבים בעיקר מתאים נוירואפיתליאליים (איור 1E,F). למרות אורגנואידים אלה ניתן לשמור בתרבית במשך מספר חודשים, יש לציין כי עם גודלם הגדל, יש עלייה מקבילה של מוות תאים בחלק הפנימי של האורגנואידים בשל חוסר חומרים מזינים וזמינות חמצן, ובסופו של דבר וכתוצאה מכך התפתחות של ליבה נמקית.

כדי לחקור את המגוון התאי בתוך אורגנואידים בקליפת המוח באמצעות ניתוח ריצוף, בודדנו גם תאים בודדים וגם גרעינים מאורגנואידים. כדי לאזן את ההטרוגניות הטבועה בתוך קבוצה אחת של אורגנואידים במוח, ערכנו ריצוף של ארבעה אורגנואידים ממאגר מאצווה אחת. בנוסף, למטרות השוואה בין תהליכי הבידוד וכדי להסיר השפעות אצווה בין snRNA-seq לבין ספריית scRNA-seq, אורגנואידים אלה חולקו לחצאים (שמונה חצאים בסך הכל; איור 2). לאחר בידוד אנזימטי של תאים בודדים, חיוני להבטיח שיכולת הקיום של התאים תישאר מעל 80%, תוך התבוננות בכך שהתאים שומרים על מורפולוגיה עגולה (איור 3A,B). באופן דומה, הבידוד המכני של גרעינים בודדים אמור להניב גרעינים שלמים בגדלים שונים עם פסולת מינימלית או ללא פסולת ניתנת לגילוי (איור 3C,D).

ניתוח ריצוף גילה כי יותר תאים מאשר גרעינים נלכדו ורוצפו. שני מערכי הנתונים הראו איכות טובה שהוערכה על-ידי ספירת גנים ו-UMI גבוהה לכל תא וגרעין, והאחוז הנמוך של קריאות מיטוכונדריאליות (איור 4A-C). כצפוי, קריאות מיטוכונדריאליות וריבוזומליות מהוות חלק גבוה יותר מסך הקריאות ששוחזרו במערך הנתונים scRNA-seq בהשוואה למערך הנתונים snRNA-seq. במערך הנתונים scRNA-seq, רוב התאים הכילו פחות מ-30% קריאות ריבוזומליות, בעוד שבמערך הנתונים snRNA-seq, רוב הגרעינים הכילו פחות מ-5% קריאות ריבוזומליות. בנוסף, רוב התאים שנלכדו במערך הנתונים scRNA-seq מכילים פחות מ-5% קריאות מיטוכונדריאליות. לאחר סינון קריאות מיטוכונדריאליות, כ-10,000 תאים ו-3,000 גרעינים עברו את סף האיכות.

ניתוח אינטגרטיבי של שני מערכי הנתונים גילה שכל הצבירים מיוצגים בשני מערכי הנתונים, מה שמצביע על כך ששתי השיטות משחזרות את אותם סוגי תאים (איור 5A,C). הביאור של מערך הנתונים מראה שאוכלוסיות התאים העיקריות מורכבות מתאי גליה רדיאליים, אבות ביניים, אבות תת-קורטיקליים ונוירונים, כמו גם נוירוני הקרנה של שכבות עמוקות שזה עתה נולדו וסוגי תאים פחות מיוצגים כמו Cajal-Retzius, תאי hem קליפת המוח ותאי מקלעת כורואיד (איור 5B). בסך הכל, scRNA-seq ו-snRNA-seq יכולים לשחזר את כל סוגי התאים הצפויים להיות נוכחים באורגנואיד מוחבן 30 יום 20.

היווצרות גוף עוברי עד ציר הזמן להתבגרות; תמונות מיקרוסקופיה; שלבי התמיינות תאים.
איור 1: יצירת אורגנואידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). מהלך הזמן של יצירת אורגנואידים במוח (A). תמונות לדוגמה של התמיינות קליפת המוח המוצלחת מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (B), היוצרים גופים עובריים (72 שעות לאחר הזריעה) (C) ומראים אינדוקציה עצבית מוצלחת לאחר 7 ימי תרבית (D). אורגנואיד מתאר לולאות נפרדות ביום ה-15 (E) וביום ה-30 (F). סרגל קנה מידה: B-D 200 מיקרומטר, E 400 מיקרומטר, F 800 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת ריצוף RNA של תא בודד וגרעין RNA; דיסוציאציה אנזימטית, שיטת שיפוע פרקול.
איור 2: זרימת עבודה להשגת תאים בודדים וגרעינים בודדים מאורגנואידים במוח. דיסוציאציה של אורגנואידים לתאים בודדים מתבצעת על ידי טחינת אורגנואידים עם אזמל, ואחריו עיכול אנזימטי (למעלה). בידוד גרעינים מתבצע על ידי דיסוציאציה מכנית, ואחריה טיהור באמצעות שיפוע פרקול (למטה). התא הבודד ותרחיף הגרעינים מסוננים ונטענת למערכת מיקרופלואידיקה לייצור וריצוף ספריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תמונות מיקרוסקופיה תאיות המציגות צפיפויות תאים שונות ודפוסי צביעה; השיטה כוללת מכתים.
איור 3: תוצאות מייצגות של תאים וגרעינים מבודדים מאורגנואידים בני 30 יום. (A) תמונה לדוגמה של תאים מוכתמים בכחול טריפאן שצולמה באמצעות מונה תאים ו-(B) תקריב תואם. (C) שכבת על של שדה בהיר ותמונה פלואורסצנטית של גרעינים מוכתמים ב-DAPI ו-(D) תקריב תואם. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עלילות כינור המציגות שונות נתונים לפי זהות; תוצאות ניתוח סטטיסטי.
איור 4: בקרת איכות של scRNA- ו- snRNA-seq. עלילות כינור ממחישות את ספירת UMI האבסולוטית (A), ספירת גנים (B), מיטוכונדריה (C) וקריאות ריבוזומליות (D) של תאים (כחול) וגרעינים (ורוד-סגול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת UMAP המציגה אשכולות scRNAseq ו-snRNAseq, ניתוח ביטוי גנים בתאי עצב.
איור 5: scRNA-seq ו-snRNA-seq מאחזרים אוכלוסיות תאים דומות באורגנואידים בני 30 יום. UMAP מוטבע משולב של אורגנואידים בני 30 יום, המציג תוצאות scRNA-seq (כחול) ו- snRNA-seq (ורוד-סגול) (A), פרופילים משולבים ומבוארים ובודדים של scRNA-seq ו- snRNA-seq (B,C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מדיה ורכיבי ציפוי של תרביות תאים לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: מאגרי דיסוציאציה עבור scRNA ו-snRNA-seq. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ קידוד משלים 1: קובץ קידוד המשמש לניתוח נתוני scRNA-seq ו- snRNA-seq. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח שעתוק של תאים בודדים וגרעינים בודדים התגלה ככלי מרכזי להבנת מנגנוני בקרת גנים בתוך רקמות מורכבות. שתי השיטות מאפשרות מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח. כדי להבטיח ניסוי מוצלח כולל, איכות חומר המוצא היא בעלת רלוונטיות גבוהה. לכן, יש צורך לחתוך את האורגנואידים באופן קבוע כדי למנוע היווצרות של ליבה נמקית26. ניתן גם לחסל בעיה זו עם תרבות ממשק אוויר-נוזל27. כדי להפחית את השפעות האצווה עקב הטרוגניות אורגנואידים, אנו ממליצים להשתמש לפחות בארבעה אורגנואידים בכל מיצוי. לחילופין, ניתן לבצע ריצות רצף מרובות של אורגנואידים בודדים, מה שמאפשר בנוסף לבחון את השונות בתוך אותה אצווה17. בעת שימוש בשתי השיטות, scRNA-seq ו- snRNA-seq, במקביל, חיתוך אורגנואידים לשניים וחלוקתם עבור כל שיטה יכול להפחית עוד יותר את ההבדלים הנגרמים על ידי הטרוגניות אורגנואידים.

כדי לקבל פרופיל שעתוק באיכות טובה של תא או גרעין בודד, חיוני שהקרום התאי או הגרעיני יישאר שלם במהלך כל ההליך. לכן, חיוני לייעל הן את ריכוז האנזים והן את תזמון העיכול האנזימטי, אשר צריכים להיות מותאמים לגיל ולגודל של האורגנואיד. בנוסף, חיוני להשתמש בטמפרטורות הנכונות ובמהירות הצנטריפוגה ולהימנע מפיפטינג קשה. במקרה של כדאיות נמוכה, ניתן להשתמש בערכה להסרת תאים מתים לאחר דיסוציאציה של האורגנואידים לתאים בודדים. משלים, לבידוד גרעינים חיוני לשטוף בזהירות את האורגנואיד עם PBS ולהתאים את מספר המשיכות עם המשענת לגודל האורגנואידים. כמו כן, חשוב להקפיד על שכבות השיפוע של פרקול על מנת למנוע הפרעות בשכבות. אם גרעינים פגומים נשארים לאחר הבידוד, מומלץ לבצע שלב מיון באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות22. בסך הכל, השימוש במעכבי RNAse חיוני לכל השלבים מדיסוציאציה של דגימות ועד ליצירת ספרייה כדי לשמר את הרנ"א האיכותי של כל תא או גרעין.

במחקר זה, scRNA-seq הניב יותר תאים, מה שמאפשר סקירה רחבה יותר של אוכלוסיות תאים. בנוסף, תאים מכילים יותר RNA וקל יותר להעשיר אותם עבור סוגי תאים ספציפיים באמצעות סמנים על פני השטח בהשוואה לגרעינים. עם זאת, דיסוציאציה של תא בודד מסתמכת על תהליך אנזימטי שיכול לגרום לשעתוק של RNA הקשור ללחץ19,28. במיוחד במחלות הקשורות לתגובת לחץ מוגברת, זה יכול לגרום לממצאים הנגרמים על ידי דיסוציאציה20. יתר על כן, הוכח כי בידוד תא בודד הביא לאובדן אוכלוסיות תאים רגישות 3,29. אמנם זה אולי לא ניכר במחקר זה, אך זוהי תוצאה אפשרית בעת שימוש באורגנואידים ישנים יותר במוח המאופיינים במגוון תאי גבוה יותר.

מכיוון ששני מערכי הנתונים מאחזרים את אותן אוכלוסיות תאים, הבחירה בשיטת הבידוד תלויה מאוד בשאלות מחקר, רכישת רקמות וניהול זמן. בעוד שלאחר הדיסוציאציה הקיבוע והאחסון של תאים בודדים מאורגנואידים במוח במתנול מבוסס היטב30, הבידוד של גרעינים בודדים מאורגנואידים קפואים במוח עדיין דורש אופטימיזציה.

בסך הכל, הפרוטוקולים שלנו מספקים פלטפורמה רב-תכליתית וניתנת להתאמה לחקר הפרופיל התעתיק של תאים בודדים וגרעינים באורגנואידים במוח, וסוללים את הדרך לחקירות מעמיקות של שאלות הקשורות להתפתחות ולמחלות במודלים של המוח האנושי במבחנה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לולריה פרננדז-ואלון על ההוראות המקוריות לערכת הדיסוציאציה העצבית של Miltenyi. אנו מודים גם לפלטפורמת הטכנולוגיה הגנומית של מרכז מקס דלברוק על שסיפקה את המתכון למאגר הליזיס NP40 ועל העצות החשובות להגדרת פרוטוקול זה. אנו מודים גם למרגרטה הרצוג ולאלכסנדרה צ'רנישף על התמיכה הארגונית במעבדה.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 מ' ב-H2O (DTT)Sigma  43816-10 מ"ל
1.5 מ"ל DNA צינורות קשירה נמוכה צינור מיקרוצנטריפוגהVWR525-0130
10x צינור Cellranger אנליזה פיפלין
15 מ"לשפופרת צנטריפוגה
פלקון 2-מרקפטואתנול (BME)Life Technologies21985023
50 מ"לשפופרת צנטריפוגהפלקון
פלקון A83-01ביו טכנולוגיות379762
תמיסה אנטיביוטית/אנטי-פטרייתית (100X)Life Technologies15240062
תוסף B-27 PlusLife Technologies17504044
תוסף תזונה B-27 ללא ויטמין ALife Technologies12587010
אלבומין בסרום בקר, ללא חומצות שומן (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER מסננת תאים משופרתVWRDHC-N01
40 ומיקרו; mNeolab352340
מסננת תאים 70 ומיקרו; m (לבן) ניילוןסיגמאCLS431751-50EA
בקר כרום & ערכת אביזר GEM הבאה10X גנומיקה1000204
כרום הבא GEM שבב G ערכת תא יחיד, 16 rxns10X גנומיקה1000127
כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכת v3.110X גנומיקה1000268
שלם,  קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA רוש11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologiesסט
Dounce 2 מ"ל שלםSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
ספירת תאים EVE שקופיותVWREVS-050 ( 734-2676)
סרום בקר עוברי ללא טטרציקלין (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (ציפוי)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
תוספי GlutaMAX LifeTechnologies35050038
Heparin תרבית תאי נתרן נבדקהSigmaH3149-10KU
Human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
תמיסת אינסולין אנושיתסיגמא אולדריץ'I2643-25MG
החלפת סרום נוקאאוטLife Technologies10828028
LDN193189 הידרוכלוריד 98%סיגמא אולדריץ'130-106-540
MEM חומצת אמינו לא חיונית (100x)סיגמא אולדריץ'M7145-100 מ"ל
MgCl2 מגנזיום כלוריד (1M) תרמו ללא RNAse ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276מדיום תאי גזע
mTeSR1StemCell Technologies85850מדיום תאי גזע
N2 תוסף StemCell Technologies17502048
ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביותMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 מערכתIllumina Sequencer
NP-40 Surfact-Amps תמיסת דטרגנטLife Technologies28324
PBS דולבקו sInvitrogen14190169
PenStrep (פניצילין - סטרפטומיצין)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
(Y-27632 דיהידרוכלוריד) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
נתרן כלורי NaCl (5M), נטול RNase-100 מ"לInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401מדיום תאי גזע
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368מדיום תאי גזע
TC-Platte 96 באר, תחתית עגולהSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
טריפאן כחולT8154-20 מ"לסיגמא
TrypLE אקספרס אנזים, ללא פנולאדום Life Technologies12604013ריאגנט מבוסס טריפסין
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life SciencesBML-WN100-0005
פלקון מטחנת רקמות 11320074 Human מעכב סלעים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

Related Articles